新開墾土壤上構(gòu)建玉米/蠶豆-根瘤菌高效固氮模式*

梅沛沛, 王 平, 李 隆, 張 軒, 桂林國, 黃建成

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新開墾土壤上構(gòu)建玉米/蠶豆-根瘤菌高效固氮模式*

梅沛沛1,2, 王 平3, 李 隆1 **, 張 軒1, 桂林國4, 黃建成4

(1.中國農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院/植物與土壤相互作用教育部重點實驗室 北京 100193; 2. 河南科技學院生命科技學院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心 新鄉(xiāng) 453003; 3.寧夏農(nóng)林科學院作物研究所 銀川 750105; 4. 寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所 銀川 750002)

為了在新開墾土壤上構(gòu)建高效種植模式, 本文采用溫室盆栽和大田試驗相結(jié)合的方法, 選用4種根瘤菌接種方式(保水劑拌種、清水拌種、三葉期灌根和種子丸衣化)接種4種不同蠶豆根瘤菌(NM353、CCBAU、G254和QH258), 分析接菌后新開墾土壤上玉米/蠶豆間作體系的生產(chǎn)潛力、地上部氮素吸收和結(jié)瘤特性以及生物固氮等方面的優(yōu)勢, 擬為該體系篩選出高效的根瘤菌及其接種技術(shù)。結(jié)果表明: 接種NM353后, 玉米/蠶豆間作體系中蠶豆籽粒產(chǎn)量比單作平均增加152.84%, 而玉米保持相對穩(wěn)產(chǎn); 以保水劑拌種的方式接種NM353的間作蠶豆地上部氮素積累量最高, 蠶豆結(jié)瘤數(shù)、瘤重、固氮比例和固氮量均高于本試驗中其他3種方式接種的根瘤菌。在盛花期和盛花鼓粒期, 接種NM353蠶豆的固氮比例比接種CCBAU的分別高19.1%和11.1%, 在各個生育時期兩者固氮量之間差異均達顯著水平; 接種NM353與接種其他菌種間固氮量和固氮比例差異更顯著。因此, 在新開墾土壤上, 用保水劑拌種的方式對間作蠶豆接種NM353根瘤菌, 構(gòu)建玉米/蠶豆-根瘤菌高效固氮體系, 為新開墾土壤合理開發(fā)利用的可持續(xù)發(fā)展模式。

蠶豆/玉米間作; 間作優(yōu)勢; 根瘤菌; 生產(chǎn)力; 氮素吸收; 生物固氮

1999年開始開發(fā)建設(shè)的寧夏扶貧揚黃灌溉工程的主體灌區(qū)紅寺堡灌區(qū), 其間分布的淡灰鈣土面積達6.9萬hm2, 占主體灌區(qū)土壤總面積的74%。由于淡灰鈣土土壤養(yǎng)分含量較低, 加上開發(fā)過程中的土壤推墊等土地平整措施, 使農(nóng)田土壤大多表現(xiàn)為“生土”特征, 基礎(chǔ)肥力很低, 土壤養(yǎng)分貧乏嚴重制約了水、光、熱資源的生產(chǎn)潛力。一方面由于土壤肥力低下, 導致農(nóng)作物單產(chǎn)較低, 另一方面受引黃老灌區(qū)農(nóng)民施肥習慣的影響, 化肥施用不合理, 氮、磷等養(yǎng)分資源浪費嚴重。因此, 新開墾土壤的科學合理開發(fā)利用成為一個關(guān)鍵問題。

豆科/非豆科作物間作在中國分布面積較大, 包括西北地區(qū)的蠶豆()/玉米()和小麥()/豆()、西南地區(qū)的蠶豆/小麥和蠶豆/油菜()、黃淮海平原的花生()/玉米、長江中下游平原的花生/水稻()、東北地區(qū)的大豆/玉米等。蠶豆/玉米間作在寧夏、甘肅一帶種植面積較大。蠶豆/玉米間作具有明顯的產(chǎn)量間作優(yōu)勢, 這主要由于作物地下部根系生態(tài)位時空互補和根際互作過程能促進作物養(yǎng)分高效吸收利用[1-5]。蠶豆/玉米間作能提高間作蠶豆的生物固氮量[6], 并減少土壤無機氮的累積, 從而降低農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境污染的風險[7]。在缺水條件下, 與小麥間作后, 蠶豆結(jié)瘤特性得到促進, 根系下扎更深[8]。有研究表明間作蠶豆根系分泌物中類黃酮物質(zhì)的組分和含量發(fā)生了變化從而引起根瘤的變化[9]。在低磷脅迫條件下, 玉米/蠶豆間作[10]、玉米/大豆間作[11]均能促進豆科植物的結(jié)瘤和作物綜合利用資源的能力。進一步研究揭示, 玉米/蠶豆間作體系中玉米的根系分泌物促進了蠶豆的結(jié)瘤固氮[12]。蠶豆較強的環(huán)境適應能力和資源利用潛力還有待于進一步挖掘。

種植豆科植物必須接種與之相匹配的根瘤菌[13], 這樣不但可以提高間作體系中豆科植物的固氮優(yōu)勢, 而且可進一步提高豆科/禾本科間作系統(tǒng)的間作產(chǎn)量優(yōu)勢, 并改善與之間作的作物營養(yǎng)狀況[10,14-17]。但在新開墾土壤上根瘤菌數(shù)量少, 多數(shù)因環(huán)境條件不適宜而無效根瘤菌居多。且前人的研究試驗多集中于盆栽研究[14-16], 或長期耕種的土壤上進行[17], 而非新開墾土壤。接種方式則以拌種[17-18]和出苗后灌根居多[14,16], 且少有對接種方式進行比較。接種根瘤后對玉米/蠶豆間作體系的產(chǎn)量優(yōu)勢及作物根際微生態(tài)環(huán)境造成了很復雜的影響[18], 需要進一步深入研究。豆科植物與根瘤菌共生有較強的專一性, 即每種植物只與其相匹配的根瘤菌共生, 且玉米與蠶豆間作后田間微環(huán)境的改變會對蠶豆-根瘤菌的共生產(chǎn)生什么影響目前尚不十分明確。因此本研究通過新開墾土壤的盆栽與大田試驗相結(jié)合的方法, 分析玉米/蠶豆-根瘤菌共生體系的生產(chǎn)潛力、根瘤特性及生物固氮方面的優(yōu)勢, 選擇與蠶豆/玉米間作體系匹配的根瘤菌和高效根瘤菌接種技術(shù), 充分發(fā)揮玉米/蠶豆間作體系的間作優(yōu)勢和豆科植物-根瘤菌共生固氮優(yōu)勢, 培肥土壤, 增加生物氮肥投入, 降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的環(huán)境風險, 提高土壤的可持續(xù)利用能力, 為新開墾土壤的合理開發(fā)利用提供一種可持續(xù)發(fā)展模式。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在寧夏中部干旱帶的紅寺堡進行, 試驗區(qū)光能資源豐富, 全年日照時數(shù)2 900~3 550 h, 年平均氣溫8.9 ℃, 年太陽總輻射5 646.9 kJ·m-2, ≥10 ℃年積溫平均為2 963.9 ℃, 平均無霜期168 d, 年降雨量185.4 mm, 年均潛在蒸發(fā)量2 015 mm, 是降水量的11倍, 干燥度為6.9%。土壤為砂質(zhì)土壤, 土層厚30~100 cm, 土壤粗顆粒含量為20%~30%。土壤基礎(chǔ)肥力狀況見表1。該試驗地作物生長期間月平均氣溫和月平均降雨量以及灌溉量見文獻[10]。

1.2 試驗設(shè)計及管理

1.2.1 盆栽試驗及管理

盆栽試驗在中國農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院溫室進行, 栽培盆規(guī)格為20 cm×18 cm(直徑×高), 試驗所用土壤采自寧夏紅寺堡興盛村大田試驗點。以玉米/蠶豆間作為對象, 供試蠶豆品種為‘臨蠶5號’, 玉米品種為‘鄭單958’。設(shè)不接菌的蠶豆單作和玉米/蠶豆間作為對照, 主處理為4個根瘤菌株接種, 菌種分別是NM353、CCBAU、G254和QH258(均由中國農(nóng)業(yè)大學生物學院菌種保藏中心陳文新院士課題組提供)。副處理為接種方法, 共設(shè)4種根瘤菌接種方法: 1)液體菌劑+清水拌種; 2)液體菌劑+保水劑+清水拌種; 3)種子丸衣化方法接種根瘤菌; 4)兩葉期對種苗根部澆灌菌液。共計18個處理, 4次重復。2009年3月15日蠶豆和玉米同時播種。每盆均留兩棵苗, 單作即每盆留兩棵蠶豆, 間作每盆留1株玉米和1株蠶豆, 兩棵植株間距離為10 cm。2009年5月8日蠶豆和玉米同時收獲, 蠶豆和玉米共同生長55 d。

表1 播種前試驗區(qū)耕層土壤(0~20 cm)基礎(chǔ)肥力狀況

1.2.2 大田試驗及田間管理

大田試驗在寧夏紅寺堡區(qū)興盛村進行。試驗主處理為5個根瘤菌接種水平, 分別是用保水劑拌種的方式接種菌株NM353、CCBAU、G254、QH258和對照處理(不接菌, 但加等量的水), 副處理為蠶豆單作, 玉米單作和玉米/蠶豆間作3個種植水平, 蠶豆單作5個處理, 玉米/蠶豆間作5個處理, 和1個玉米不接菌單作處理, 共計11個處理, 3次重復, 隨機區(qū)組排列。供試蠶豆品種為‘臨蠶2號’, 玉米品種為‘沈單16’。蠶豆采用點播方式, 行距和株距均為0.2 m, 單作蠶豆每小區(qū)種18行; 玉米點播, 行間距0.4 m, 株距0.3 m, 單作玉米每小區(qū)種9行; 玉米/蠶豆間作每兩行玉米間作兩行蠶豆, 相鄰的玉米行和蠶豆行距離為0.3 m, 每小區(qū)種6行玉米6行蠶豆, 間作體系中各作物的株距和行距與相應單作保持一致。因此, 單作玉米種植密度為250 125株×hm-2, 單作蠶豆種植密度為83 375株×hm-2, 間作玉米種植密度為83 375株×hm-2, 間作蠶豆種植密度為55 583株×hm-2。各小區(qū)長6 m, 寬3.6 m。本試驗主區(qū)間筑埂, 埂寬0.5 m, 小區(qū)之間打畦, 畦寬0.2 m, 在第1和第2重復間設(shè)水渠, 渠寬1.2 m, 在第2和第3重復間設(shè)走道, 走道寬1 m。所種作物均為南北向種植。

蠶豆于2009年3月19日播種, 2009年8月1日收獲; 玉米于2009年4月15日播種, 2009年10月6日收獲。作物生長期間充分灌水和人工除草, 并在作物生長的適當時期中耕。在蠶豆初花期伴隨著灌水用辛硫磷控制地下害蟲, 在蠶豆盛花期葉面噴灑氧化樂果用以控制蠶豆蚜蟲, 所用殺蟲劑均按說明書使用。

1.3 根瘤菌菌劑的配制及接種方法

1.3.1根瘤菌菌劑的配制

首先配制無菌的固體和液體培養(yǎng)基, 在無菌操作臺中, 將菌種從保藏試管中挑出, 先在固體培養(yǎng)基上用平板劃線法進行活化, 然后用滅菌牙簽輕輕挑取平板上生長出的單菌落, 將其放入已滅菌的液體培養(yǎng)基中, 25 ℃、200 r×min-1進行搖培。根瘤細菌的生長情況, 通過OD600監(jiān)測, OD600為0.6~0.8, 表明細菌處于旺盛生長的對數(shù)生長期[19]。每4 h觀測一次OD600值, 直到OD600值達到0.6, 備用。

1.3.2 根瘤菌接種方法

本試驗用作接種的菌懸液均稀釋至OD600處于0.63~0.64, 采用滅過菌的YMA液體培養(yǎng)基進行稀釋。每盆用菌量為: 除了三葉期灌根用10 mL菌液外, 其他3種接種方法都用20 mL菌液, 具體每盆的接菌量見下面接種方法。根瘤菌怕日光, 懼高溫。在保存、運輸、搬運、拌種和播種后, 都要盡量避開陽光直射(如拌種時要在陰暗地方, 搬去田間時, 用黑布覆蓋, 播種后立即蓋土等)。播種后土壤濕度應保持田間持水量的60%~80%; 土壤通氣較好; 土壤溫度20~28 ℃利于根瘤的生長發(fā)育。各接種方法具體如下:

清水拌種: 將20 mL菌懸液加入種子中并充分攪拌, 以使每粒種子都均勻粘到菌液。置于陰涼避光處待播種。

保水劑拌種: 保水劑購于北京金元易公司。按照播種蠶豆量∶菌劑(L)∶清水(L)∶保水劑(kg)= 60∶6∶10∶1, 保證每10 g蠶豆種子上2 mL菌劑(7×107cfu), 將稱好的保水劑與菌液混勻后, 倒入種子中并充分攪拌, 使每粒種子表面都均勻沾上菌劑[19]。置于陰涼處, 稍晾后立即播種。大田試驗也采用此方法。

丸衣化方法: 參照牧草種子丸衣化的方法[20], 先將20 mL菌液加入到配好的5 mL羧甲基纖維素鈉溶液內(nèi), 攪拌均勻后放入種子, 反復攪拌使每粒種子表面都均勻沾上菌液和羧甲基纖維素鈉的粘著劑, 再加入6 g滑石粉, 反復攪拌使每粒種子都裹上一層丸衣材料, 置于陰涼處陰干待用。

三葉期灌根: 即在蠶豆第3片真葉展開時在蠶豆根部澆灌10 mL培養(yǎng)好的菌液。

1.4 樣品采集與測定方法

1.4.1 盆栽試驗

于蠶豆和玉米共同生長55 d后開始收獲植株樣品。收獲前兩天控水, 以便收獲時從土壤中易于將根系取出。從栽培盆中將整個植株輕輕抖出, 置于牛皮紙上分地上部和地下部。地上部樣品處理: 在105 ℃烘箱烘至恒重, 稱干重, 粉碎后充分混合均勻, 用以測定植株氮養(yǎng)分。地下部樣品處理: 輕輕抖落根上的土, 落在紙上的根瘤及帶根瘤的根一并放入8號封口袋內(nèi), 樣品取回后放在100目篩中流水沖洗, 摘可見根瘤、計數(shù)、稱鮮重, 風干、稱干重。

1.4.2 大田試驗

玉米出苗后, 每隔20~25 d取一次樣, 即蠶豆在初花期、盛花期、盛花鼓粒期和成熟期取4次樣, 玉米在苗期、拔節(jié)期、抽雄期、灌漿期和成熟期取5次樣, 兩作物共生期約95 d, 為玉米生長前期; 從蠶豆收獲到玉米收獲約60 d, 為玉米生長后期。兩作物共生期同時取樣4次, 蠶豆收獲后60 d, 玉米成熟期取樣一次, 共取樣5次。

蠶豆樣品: 于蠶豆苗期在各小區(qū)取樣帶標記30株生長均勻一致的植株, 待測量和取樣用。每個小區(qū)用鐵锨挖約0.50 m深取出整株蠶豆5株, 以保證取出所有根瘤, 置于牛皮紙上分地上部和地下部。地上部和地下部樣品處理方法同盆栽試驗(1.4.1), 在蠶豆鼓粒期和成熟期將籽粒和莖稈分開烘干稱重, 粉碎。玉米樣品: 于玉米苗期在各小區(qū)取樣帶標記30株生長均勻一致的植株, 待測量和取樣用。除苗期取玉米5株, 其他生長期在取樣區(qū)采集3株樣品, 用以測定植株干物質(zhì)和氮素濃度(在玉米灌漿期和成熟期將籽粒和莖稈分開烘干稱重, 粉碎)。

作物成熟時按帶收獲, 測定生物學產(chǎn)量和籽粒產(chǎn)量及考種性狀。離邊行0.50 m取蠶豆20株和玉米10株進行考種。然后蠶豆玉米各取其中3株, 將籽粒和秸稈分開, 烘干后, 進行粉碎, 充分混合均勻, 用以常規(guī)測定植株養(yǎng)分。測產(chǎn)時, 將蠶豆和玉米考種剩下的、離小區(qū)邊0.50 m以上的所有植株收獲, 與考種樣一起用作實際測產(chǎn)。并于收獲期, 從單作蠶豆、間作蠶豆和單作玉米各混合均勻的粉碎樣品中取2 g, 用微量粉樣機(MM200, Retsch, Haan, Germany)充分細粉碎, 再用穩(wěn)定性同位素分析儀(914-0060, Los Gatos Research, America )測定銨態(tài)氮15N自然豐度(δ15N), 以獲得蠶豆的生物固氮量和固氮比例。

1.5 數(shù)據(jù)處理

1.5.1 數(shù)據(jù)計算

土地當量比(land equivalent ratio, LER)常被用于衡量間作優(yōu)勢[21]。LER被定義為獲得與間作相同產(chǎn)量所需的單作土地面積。其計算公式如下:

式中:if和im分別代表間作中蠶豆和玉米的籽粒產(chǎn)量,sf和sm分別代表單作中蠶豆和玉米的籽粒產(chǎn)量。LER>1, 表明間作比單作利用更多的資源滿足作物生長; LER<1, 表明單作比間作更有效利用資源。

15N同位素自然豐度法應用條件驗證: 在盆栽試驗中, 本研究選用與不接種根瘤菌的蠶豆間作的玉米為參照; 大田試驗中, 選用保水劑處理的單作玉米作參照。盆栽試驗取收獲時的蠶豆、玉米樣品; 大田試驗所測樣品為4個生育時期的蠶豆植株樣品。

δ15N法測定生物固氮的基本原理: 大氣中15N自然豐度值為0.366 3%, 相當于δ15N值為0, 而土壤N的δ15N值為-6‰~16‰。15N同位素自然豐度法的應用要求植物生長的土壤中δ15N值一般在6‰~10‰[22]。2009年蠶豆收獲后表層土壤 (0~20 cm)的平均δ15N值為7.14‰。因此, 本研究土壤δ15N均高于大氣中的值, 這是15N同位素自然豐度法適用的前提條件。因此, 本研究可采用自然豐度法計算蠶豆生物固氮。

蠶豆固氮量計算: 蠶豆生物固氮采用15N同位素自然豐度法計算, 其固氮比例(percentage of nitrogen derived from air, %Ndfa)計算方法如下[22]:

(2)

式中: δ15Nmaize為與不接種根瘤菌蠶豆間作的玉米的δ15N, δ15Nfaba bean為所有種植方式蠶豆的δ15N, δ15N為擴大了的自然豐度值, 可由穩(wěn)定同位素儀直接讀數(shù);為與田間試驗相同的蠶豆品種‘臨蠶5號’在不供應氮素但保證其他養(yǎng)分需求, 即完全依靠生物固氮時的δ15N值, 為-1.851, 測定參照Shearer等[23]的方法。

式中:sample是所檢測蠶豆樣品在穩(wěn)定同位素儀上的讀數(shù),standard是不接種根瘤菌的單作玉米的讀數(shù)。生長期, δ15N是蠶豆(或玉米)秸稈的δ15N; 成熟收獲時由于將籽粒和秸稈分開取樣, δ15N是由蠶豆(或玉米)籽粒和秸稈δ15N值加權(quán)平均計算所得。

固氮量(nitrogen derived from air, Ndfa)由固氮比例和總氮累積量計算:

式中:為蠶豆生長期秸稈的氮素積累量或成熟收獲期籽粒和秸稈氮素積累量的加權(quán)平均值。

1.5.2 統(tǒng)計分析

試驗采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計。將數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007整理后, 利用SAS程序在0.1、0.05和0.01水平進行方差分析, 并用最小顯著性差異(LSD)進行多重比較[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌菌劑的特性及配制方法

供試的4個根瘤菌NM353、CCBAU、G254和QH258是多年在甘肅蠶豆上進行配對試驗得出的4種蠶豆專屬高效結(jié)瘤的根瘤菌菌種[16,18], 但其生長習性各不相同。在室內(nèi)對4個根瘤菌菌種的生長曲線進行研究, 找到各菌株最旺盛生長的時間, 提前制備好生長勢強的菌劑以備大田拌種使用。

通過對4種高效根瘤菌種的揺菌培養(yǎng)觀察可以看出, 在搖床上培養(yǎng)28 h后, NM353和CCBAU的OD600達到0.6~0.8的最佳生長狀態(tài)。而G254和QH258在培養(yǎng)16 h即可以達到最旺盛生長期。另外, 平板菌落計數(shù)法測得OD600值最佳時NM353和CCBAU培養(yǎng)20 h分別為3.5×107cfu×mL-1和2.4×107cfu×mL-1, 可見 NM353優(yōu)于CCBAU(圖1)。

圖1 供試4種根瘤菌的OD值監(jiān)測生長曲線

2.2 根瘤菌接種方法和根瘤菌菌種對間作蠶豆和玉米生產(chǎn)力的影響

盆栽試驗中, 接種4種根瘤菌后, 每盆植株地上部總生物量的大小順序為CCBAU>NM353> G254>QH258>間作不接菌>單作不接菌(表2); 接種方式為保水劑>丸衣化>清水拌種>三葉期灌根。但其中以三葉期灌根的接種方式、接種NM353根瘤菌的蠶豆植株生物量最大, 比單作不接種蠶豆的生物量高出20.8%, 比間作不接種的蠶豆高34.4%。但用保水劑拌種的方式接種NM353卻與其他3個菌種間無顯著差異。用保水劑拌種的接種方式, 接種NM353根瘤菌的蠶豆植株生物量比用此種方式接種CCBAU的少8.8%, 而間作玉米的生物量則是接種NM353的比接種CCBAU的高20.1%。

大田試驗中(表3), 間作蠶豆比單作蠶豆產(chǎn)量增加155.50%, 差異均達顯著水平。接種根瘤菌顯著增加了單、間作蠶豆籽粒產(chǎn)量, 接種CCBAU、G254、NM353、QH258和對照處理水后, 間作蠶豆分別比單作蠶豆產(chǎn)量高87.5%、118.6%、104.7%、87.3%和87.6%。由于共生期對玉米/蠶豆間作體系接種根瘤菌, 在玉米/蠶豆種間促進作用和蠶豆-根瘤菌共生固氮二者的協(xié)同作用下, 本試驗中間作蠶豆產(chǎn)量增加顯著, 而間作中玉米的產(chǎn)量基本與單作保持一致。從地上部生物量結(jié)果(圖2)也可以看出, 接種根瘤菌NM353的處理, 間作蠶豆和玉米的生物量為最高, 分別是18 t(DW)×hm-2(<0.05)和20 t(DW)×hm-2。

從土地當量比(表3)分析, 所有接菌處理的間作體系均具有明顯的產(chǎn)量優(yōu)勢, 土地當量比均大于1。接種NM353和CCBAU兩種根瘤菌后, 間作蠶豆增產(chǎn)效果均有明顯提升, 其中以NM353的效果更好。用保水劑拌種的接種方式, 接種NM353根瘤菌的玉米/蠶豆間作共生體系的土地當量比為1.65, 該間作體系中的間作玉米和間作蠶豆的產(chǎn)量分別比接種CCBAU的處理高5.8%和6.7%。

因此, 考慮對玉米/蠶豆間作體系進行接種根瘤菌, 從生物量和作物長勢來看, 該體系以用保水劑拌種的接種方式接種NM353根瘤菌為最佳處理。

2.3 根瘤菌接種方法和根瘤菌菌種對間作蠶豆和玉米地上部氮累積的影響

盆栽試驗不同接種處理蠶豆植株氮素積累量均比不接種的對照植株顯著增加(表2)。從整盆植株來看, 間作接種處理的蠶豆地上部氮積累量高于間作不接種對照, 說明接種根瘤菌能充分發(fā)揮兩種作物在有限的資源空間中對資源的吸收和利用的補償作用。4種根瘤菌中以接種NM353的間作蠶豆地上部氮積累量最高。無論是單株蠶豆還是整盆植株的氮積累量, 均以三葉期灌根接種方式接種根瘤菌NM353最高, 并且均與接種QH258的根瘤菌菌種間差異顯著?？傮w上, 4種接種方法間沒有明顯差異, 但都高于不接種的間作和單作蠶豆。

從大田試驗結(jié)果(圖2)來看, 接種NM353的蠶豆地上部氮積累量比接種CCBAU的高48.5%, 處理間差異顯著; 接種后該間作體系中玉米的地上部N積累量以NM353的處理最高, 但是與接種G254的處理沒有顯著性差異。

表2 不同接種方法接種4個根瘤菌種后間作蠶豆、玉米地上部生物量和地上部氮吸收(盆栽)

表中所列數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差(=4)。同列不同大寫字母表示4個接種方式與兩個對照共6個處理間差異顯著(<0.05); 同列不同小寫字母表示同一接菌方式下不同根瘤菌間差異顯著(<0.05)。Data are means ± S.E. (= 4). Different capital letters in the same column demonstrate significant differences among 6 treatments (4 inoculation methods and 2 non-inoculation controls) at 0.05 level; different lowercase letters indicate significant differences among 4 rhizobia treatments with the same inoculation method at 0.05 level.

表3 根瘤菌接種處理對蠶豆/玉米間作作物籽粒產(chǎn)量及其間作優(yōu)勢的影響(大田)

表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差(=3)。不同大寫字母表示同一作物相同種植方式下5個接菌處理間差異顯著(<0.05 ); △, * 和**分別表示同一接菌處理下同一作物單、間作間在10%、5%和1%水平下差異顯著。1)表示間作蠶豆(玉米)比單作蠶豆(玉米)的平均增產(chǎn)率。Data in the table are means ± S.E. (= 3). Different capital letters demonstrate significant differences among 5 treatments (4 rhizobia treatments and 1 control with water) with the same crop and same cropping system at 0.05 level; △, * and ** indicate significant differences at 0.1, 0.05, and 0.01 levels, respectively, between sole and intercrop with the same rhizobium treatment.1) The over-yield ratio is average yield increasing rate of intercropped faba bean (maize) compared to that of sole faba bean (maize).

2.4 根瘤菌接種方法和根瘤菌菌種對間作蠶豆結(jié)瘤特性的影響

盆栽試驗接種根瘤菌處理的蠶豆根系單株根瘤數(shù)都顯著高于單作和間作不接菌處理, 說明接種根瘤菌促進了蠶豆結(jié)瘤, 特別是在與玉米間作的條件下該優(yōu)勢表現(xiàn)更加明顯(表4)。4種根瘤菌接種效果沒有顯著差異, 說明盆栽條件下4種根瘤菌均與蠶豆匹配較好。4種接種方法中, 清水拌種和保水劑拌種的結(jié)瘤數(shù)顯著高于丸衣化和三葉期灌根的接種處理, 清水拌種和保水劑拌種分別比間作不接種蠶豆的結(jié)瘤數(shù)增加125.5%和142.3%。蠶豆單株根瘤干重也表現(xiàn)出同樣趨勢, 并發(fā)現(xiàn)接種NM353和CCBAU的根瘤干重高于另外兩個菌種; 從接種方法來看, 保水劑拌種>清水拌種>丸衣化>三葉期灌根。用保水劑拌種、清水拌種、三葉期灌根和丸衣化4種接菌方式接種NM353蠶豆根瘤單瘤重分別比單作不接種的增加18.8%、64.5%、105.6%和58.5%(表4)。

在田間條件下, 接種NM353后, 在盛花期和盛花鼓粒期, 間作蠶豆比單作蠶豆單株根瘤干重分別高7.0%和6.4%(表5)。在初花期、盛花期、盛花鼓粒期均以接種NM353根瘤菌后, 間作蠶豆單株根瘤干重為最高。在成熟期, 接種各個菌種的單、間作蠶豆的根瘤干重均趨于一致。單株根瘤數(shù)目和單瘤重均顯示出菌種NM353的優(yōu)勢, 與單株根瘤干重結(jié)果變化趨勢一致(表4)。因此, 在田間對玉米/蠶豆間作體系接種根瘤菌NM353蠶豆結(jié)瘤特性最佳。

2.5 根瘤菌接種方法和根瘤菌菌種對間作蠶豆生物固氮的影響

盆栽試驗接種根瘤菌的間作蠶豆的固氮比例(%Ndfa)和固氮量(Ndfa)比不接菌單作蠶豆平均高89.5%和 93.7%, 比不接菌的間作蠶豆也分別高出39.8%和70.3%(表4)。用保水劑拌種的方法, 接種根瘤菌NM353的蠶豆固氮比例顯著高于接種CCBAU和G254, 比后兩者均高26.3%。

用保水劑拌種方式接種NM353的蠶豆固氮量為最高, 分別比接種CCBAU、G254和QH258高22.5%、47.8%和19.2%(表4)。此外, 在固氮量方面, 用丸衣化接種的方式接種根瘤菌G254的固氮量顯著高于其他3個接菌方法, 但仍比保水劑拌種的方式接種NM353的蠶豆的固氮量低10.9%。從接菌方式上來看, 盆栽試驗中, 清水拌種接菌方式的蠶豆固氮比例和固氮量依次比用三葉期灌根、保水劑拌種和丸衣化的接菌方式分別高10.6%和6.4%、18.4%和14.2%、24.8%和27.7%, 比不接菌單作蠶豆和不接菌間作蠶豆分別高113.5%和115.3%、57.5%和89.3%。因此, 在盆栽條件下, 用清水拌種方式接菌既節(jié)約成本, 減化操作環(huán)節(jié), 又能保證接菌效果。

大田試驗條件下, 在蠶豆盛花鼓粒期, 蠶豆的固氮比例和固氮量為整個生育期中最高, 說明隨著生育期的推進, 蠶豆的固氮能力逐漸增強, 而在成熟期有所下降(圖3)。但總體上蠶豆固氮比例在整個生育期內(nèi)變化不大。接種根瘤菌NM353后蠶豆固氮比例均高于其他接菌方式, 與各生育時期的對照處理相比都表現(xiàn)出顯著差異, 在盛花鼓粒期其固氮比例高出對照28.2%, 差異達顯著水平。在初花期和成熟期接種NM353的蠶豆固氮比例比接種CCBAU的分別高36.1%和31.0%, 尤其在盛花期和盛花鼓粒期, 其固氮比例分別比接種CCBAU高19.1%和11.1%, 差異達顯著水平。接種NM353的蠶豆在整個生育期固氮量均顯著高于接種CCBAU的蠶豆。

圖2 接種不同菌種對間作蠶豆、玉米地上部生物量和地上部氮積累量的影響(大田)

不同大寫字母表示同一作物5個接菌處理間差異顯著(<0.05 ); △, *, **和n.s.分別表示相同接菌方式下同一取樣日期單、間作間差異在10%、5%和1%水平上顯著, 在10%水平上差異不顯著。Different capital letters in the same column demonstrate significant differences among 5 treatments (4 rhizobia treatments and control with water) at 0.05 level; △, *, ** and n.s. refer to marginal significance at 10%, significance at 5%, 1% levels and not significant at 10% level, respectively, between sole and intercrop with the same rhizobium treatment at one growth stage.

表4 根瘤菌接種方法和根瘤菌菌種對間作蠶豆結(jié)瘤特性和生物固氮的影響(盆栽)

表中所列數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差(=4)。同列不同大寫字母表示4個接種方式與兩個對照共6個處理間差異顯著(<0.05); 同列不同小寫字母表示同一接菌方式下不同根瘤菌間差異顯著(<0.05)。Data are means ± S.E. (= 4). Different capital letters in the same column demonstrate significant differences among 6 treatments (4 inoculation methods and 2 non-inoculation controls) at 0.05 level; different lowercase letters indicate significant differences among 4 rhizobia treatments with the same inoculation method at 0.05 level.

與玉米共生階段, 接種NM353的蠶豆的固氮量在初花期、盛花期、鼓粒期和成熟期分別比接種CCBAU的高64.8%、45.2%、34.3%和91.6%(表5)。

此外, 接種NM353的處理中間作蠶豆在盛花鼓粒期的固氮比例(%Ndfa)比單作的高9.2%, 差異達顯著水平。就固氮量而言, 接種NM353的單間作蠶豆在初花期差異達到邊緣性顯著水平(=0.051 4), 間作比單作高38.9%, 而在盛花期、盛花鼓粒期和成熟期則表現(xiàn)為顯著水平, 間作分別比單作高25.7%、51.1%和115.3%?？傮w上, 單間作蠶豆在固氮量方面的差異較為明顯, 固氮比例則差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

3.1 玉米/蠶豆-根瘤菌固氮體系具有顯著生產(chǎn)力優(yōu)勢

豆科植物-根瘤菌共生體系是生物固氮體系中最強的共生體系, 而豆科/非豆科間作結(jié)合了糧食生產(chǎn)、生物固氮的優(yōu)點, 是一種穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、高效、可持續(xù)的種植體系, 遍布世界各地[25-29]。前人通過盆栽試驗研究表明, 在玉米/大豆間作體系中接種根瘤菌SH212, 玉米和大豆的生物產(chǎn)量均比間作不接種分別高15.9%和5.8%[14]; 在小麥/蠶豆間作體系中接種根瘤菌NM353, 小麥和蠶豆的生物產(chǎn)量均比間作不接種分別高14%和5%[15], 在長期耕種的土壤上進行的玉米/蠶豆間作體系接種根瘤菌GS374后, 接種蠶豆的生物學產(chǎn)量和籽粒產(chǎn)量分別比不接種處理提高10.4%和13.7%, 與接種蠶豆間作的玉米生物學產(chǎn)量和籽粒產(chǎn)量比不接種蠶豆間作的玉米分別提高25.6%和34.3%[17]。本文通過新開墾土壤的盆栽和大田試驗相結(jié)合的方法, 發(fā)現(xiàn)在玉米、蠶豆共生期間, 對間作體系中蠶豆接種高效根瘤菌, 間作蠶豆比單作蠶豆籽粒產(chǎn)量增加98.7%, 間作玉米比單作玉米總體增產(chǎn)5.8%。且以接種NM353的處理, 間作蠶豆和玉米的地上部植株生物量為最高。用保水劑拌種的方式接種NM353根瘤菌的玉米/蠶豆-根瘤菌間作共生體系的籽粒產(chǎn)量土地當量比達1.65。從生物量和作物長勢來看用保水劑拌種的接種方式接種NM353根瘤菌為最佳處理, 盆栽試驗和大田試驗均驗證了這一點。由此說明在新開墾土壤這種特定的生態(tài)條件下, 玉米/蠶豆間作體系和根瘤菌間協(xié)調(diào)好豆科植物遺傳型、根瘤菌遺傳型和環(huán)境條件三者間的互作, 可以構(gòu)建禾本科/豆科-根瘤菌高效共生體系。與單作不接種蠶豆和間作不接種的處理相比較, 玉米/蠶豆間作體系接種的4種根瘤菌中, 以保水劑拌種方式接種NM353的間作蠶豆地上部氮素積累量最高。因此, 本文成功克服了豆科植物與根瘤固氮菌共生的種種限制性因素, 如pH、土壤鹽分、土壤養(yǎng)分、極端溫度、土壤濕度和植物生長狀況不佳[30-31]等, 在新開墾土壤上構(gòu)建了玉米/蠶豆-根瘤菌高效共生固氮體系。也進一步說明了對玉米/蠶豆間作體系接種根瘤菌是有效的, 可以充分挖掘豆科植物-根瘤菌共生固氮體系的高效固氮能力[6,20]和豆科/禾本科間作的種間互促作用, 進而提高體系的生產(chǎn)力優(yōu)勢。

圖3 不同生育時期接種不同根瘤菌處理蠶豆的固氮比例(%Ndfa)和固氮量(Ndfa) (大田)

不同大寫字母表示同一個生育時期5個接菌處理間差異顯著(<0.05); △和*分別表示同一個生育時期同一接菌處理下單、間作間在10%和5%水平下差異顯著。Different capital letters demonstrate the significance of 5 treatments ( 4 rhizobia treatments and 1 control with water) at one growth stage at 0.05 level; △and * indicate the significant differences at 0.1 and 0.05 levels, respectively, of sole and intercrop with the same rhizobium treatment at one growth stage.

3.2 玉米/蠶豆間作體系中高效根瘤菌及接菌方法的篩選

以根瘤菌-紫花苜蓿()-無芒雀麥()互作體系為模式, 賈瑞宗[32]提到篩選高效根瘤菌的方法, 主要從3個方面考慮: 1)比較菌株的結(jié)瘤能力、固氮能力和與土著根瘤菌的競爭能力。2)探討根瘤菌菌株和苜蓿品種間的匹配效果, 即觀察宿主植物的形態(tài)學參數(shù)和地上部植株養(yǎng)分等。3)把室內(nèi)盆栽試驗結(jié)果與大田定點試驗相結(jié)合。研究結(jié)果顯示, 豆科接種根瘤菌并與禾本科間作提高生物固氮, 緩解“銨阻遏”, 促進豆、禾雙增產(chǎn)的生物學效應。發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌和間作兩種措施都能明顯提高作物生物量, 而且間作同時接種則增產(chǎn)效果更為明顯。本文通過盆栽和大田試驗相結(jié)合的方法得出, 根瘤菌NM353相對于其他根瘤菌更能適應該新開墾土壤環(huán)境條件下的玉米/蠶豆間作體系, 玉米、蠶豆和根瘤菌NM353三者之間能更好地發(fā)揮間作促進作用和豆科-根瘤菌共生體系的共生固氮優(yōu)勢。用保水劑拌種的方式接種NM353根瘤菌的蠶豆植株生物量比用此種方式接種CCBAU的少8.8%, 而間作玉米的生物量則是接種NM353的比接種CCBAU的高20.1%。用保水劑拌種方式接種NM353根瘤菌的玉米/蠶豆間作體系地上部植株生物量為最高, 土地當量比達1.65。4種接種方法中, 清水拌種和保水劑拌種的結(jié)瘤數(shù)顯著高于丸衣化和三葉期灌根的接種處理, 清水拌種和保水劑拌種分別比間作不接種蠶豆的結(jié)瘤數(shù)增加102.2%和126.6%。不同接種方式蠶豆單株根瘤干重也表現(xiàn)出同樣趨勢, 且從初花期到盛花鼓粒期均以接種NM353根瘤菌后, 間作蠶豆單株根瘤干重為最高。用保水劑拌種的方式接種NM353的蠶豆的固氮比例和固氮量都顯著高于用此種方式接種的CCBAU、G254和QH258。因此本研究成功將這種間作優(yōu)勢和豆科-根瘤菌生物固氮作用聯(lián)合起來應用于農(nóng)作物, 在新開墾土壤上成功篩選出高效根瘤菌及其接種技術(shù), 在新開墾土壤上構(gòu)建了高效固氮體系玉米/蠶豆-根瘤菌種植模式。

表5 接種根瘤菌對間作蠶豆結(jié)瘤特性的影響(大田)

同列不同大寫字母表示同一作物相同種植方式下5個接菌處理間差異顯著(<0.05); △和*分別表示同一個生育時期同一接菌處理下單、間作間在10%和5%水平下差異顯著。Different capital letters demonstrate significant differences among 5 treatments ( 4 rhizobia treatments and 1 control with water) with the same crop and same cropping system at 0.05 level; △and * indicate significant differences at 0.1 and 0.05 levels, respectively, between sole and intercrop with the same rhizobium treatment.

Hauggaard-Nielsen等[33]曾呼吁人們重視并充分挖掘同一個種植體系中對豆科植物接種根瘤菌并搭配適宜的豆科和非豆科植物間作來增進所種植體系的復合潛力。孫艷梅[34]將根瘤菌(CCBAU0119)接種到紫花苜蓿/老芒麥()間作體系, 取得了良好的增產(chǎn)效果, 并且發(fā)現(xiàn)間作條件下接種根瘤菌, 在種植的前兩年可顯著提高苜蓿產(chǎn)量, 而第3年根瘤菌卻沒有明顯表現(xiàn)出來作用。因此, 建議在實踐生產(chǎn)中可以考慮在豆科作物生長過程中進行多次接種, 以保證所構(gòu)建體系的生物固氮優(yōu)勢, 以此來培肥土壤, 降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的環(huán)境風險, 提高土壤的可持續(xù)利用能力。

本文通過盆栽和大田試驗相結(jié)合的方法, 在新開墾土壤上對玉米/蠶豆間作體系進行根瘤菌接種和接種方法篩選試驗, 證明對該間作體系接種根瘤菌是有效的。構(gòu)建的蠶豆/玉米間作體系, 用保水劑拌種方式對蠶豆接種根瘤菌NM353后, 在間作促進作用和共生固氮協(xié)同作用下, 間作蠶豆籽粒產(chǎn)量比單作不接種處理平均增加237.11%, 而間作玉米籽粒產(chǎn)量也比單作平均增加21.8%。且間作接菌處理下間作蠶豆和玉米的地上部植株生物量為最高, 共生體系的土地當量比達1.65。4種根瘤菌中, 以接種NM353的間作蠶豆地上部含氮量最高。接種根瘤菌NM353蠶豆結(jié)瘤數(shù)和根瘤干重都高于接種其他根瘤菌。用保水劑拌種的方式接種NM353蠶豆的固氮比例和固氮量都顯著高于其他處理?？傊? 以采用保水劑拌種方式接種NM353為最佳選擇, 可以在新開墾土壤上構(gòu)建禾本科/豆科-根瘤菌高效固氮模式。

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Construction of efficient nitrogen-fixing cropping pattern: Maize/faba bean intercrop with rhizobium inoculation in reclaimed low-fertility soils*

MEI Peipei1,2, WANG Ping3, LI Long1**, ZHANG Xuan1, GUI Linguo4, HUANG Jiancheng4

(1. College of Resources and Environmental Sciences, China Agricultural University / Key Laboratory of Plant-Soil Interactions, Ministry of Education, Beijing 100193, China; 2.College of Life Science and Technology, Henan Institute of Science and Technology / Henan Collaborative Innovation Centre of Modern Biological Breeding, Xinxiang 453003, China; 3. Institute of Crop Science, Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Yinchuan 750105, China; 4. Institute of Agricultural Resources and Environmental Science, Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Yinchuan 750002, China)

Lighe sierozem in the Ningxia Yellow River Irrigation area is characterized as newly reclaimed soil due to lower fertility and land consolidation. To rational use land resources with environmental friendly way of the soil, leguminous/non-leguminous crops intercropping plus nitrogen-fixing rhizobium is an important measure. In order to construct an efficient nitrogen-fixing cropping pattern in reclaimed lands, the efficiency ofspecies and the inoculation methods were investigated aiming to the construction of a maize/faba bean-rhizobium intercropping systems through the greenhouse and field experiments with newly-reclaimed low-fertility soils. Fourbiovar(NM353, CCBAU, G254 and QH258) and four inoculation methods (seed inoculation with water absorbent, seed inoculation with water, dip root at 3-leaf stage and seed pelleting & inoculation) were used and the relative advantages determined with respect to crop productivity, aboveground nitrogen acquisition, nodule characteristics, biological nitrogen fixation, etc. The greenhouse experiment results showed that the order of total biomass of intercropped maize and faba bean for different rhizobium was CCBAU > NM353 > G254 > QH258 > intercropping without rhizobium > sole crop without rhizobium, and for inoculation method was seed inoculation with water absorbent > seed pelleting & inoculation > seed inoculation with water > dip root at 3-leaf stage. The field experiment showed that inoculation with NM353 with seed inoculation via water absorbent method produced significant increase in yield of intercropped faba bean and maize by 79.7% and 42.8%. The intercropping system with G254 and NM353 rhizobium showed obvious yield advantage, the land equivalent ratio was >1.5. Also nitrogen content of faba bean and maize was highest among different treatments. In addition, the number of nodules, nodule biomass and nitrogen derived from air (Ndfa) and percent Ndfa (%Ndfa) were all greater in the newly-established system compared to non-inoculated faba beans. Particularly, %Ndfa of faba bean inoculated with NM353 was respectively 19.1% and 11.1% higher than that inoculated with CCBAU at peak flowering and pod-filling stages, and both had significant differences. The differences in Ndfa of faba bean were significant between rhizobium inoculation NM353 and CCBAU at each growth stage. Relatively, the difference between NM353 inoculation and the other strains was more significant for either %Ndfa or Ndfa. The inoculation with water absorbent method showed best inoculation effect with respect to nodules number, nodule biomass, %Ndfa and Ndfa. Thus an efficient cropping system was successfully set up for nitrogen fixation. The maize/faba bean-rhizobium intercropping system based on seed inoculated withNM353 was the most sustainable development model for rational development and utilization of the low-fertility soil.

Maize/faba bean intercropping; Inter-specific facilitation; Rhizobium; Productivity; Nitrogen uptake; Biological nitrogen fixation

Corresponding author, E-mail: lilong@cau.edu.cn

Jul. 7, 2017; accepted Sep. 28, 2017

10.13930/j.cnki.cjea.170620

S344.2; S144.3

A

1671-3990(2018)01-0062-13

通信作者:李隆, 主要研究方向為生物多樣性與資源高效利用。E-mail: lilong@cau.edu.cn 梅沛沛, 主要研究方向為生物多樣性與資源高效利用。E-mail: meipeipei@126.com

2017-07-07

2017-09-28

*This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0300202) and the National Key Technology R & D Program of China (2007BAD89B02).

*國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0300202)和國家科技支撐計劃項目(2007BAD89B02)資助

梅沛沛, 王平, 李隆, 張軒, 桂林國, 黃建成. 新開墾土壤上構(gòu)建玉米/蠶豆-根瘤菌高效固氮模式[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報, 2018, 26(1): 62-74

MEI P P, WANG P, LI L, ZHANG X, GUI L G, HUANG J C. Construction of efficient nitrogen-fixing cropping pattern: Maize/faba bean intercrop with rhizobium inoculation in reclaimed low-fertility soils[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2018, 26(1): 62-74