高效液相色譜法在去甲氧基姜黃素納米脂質載體中藥物含量測定中的應用

朱辰龍

浙江省杭州市富陽中醫(yī)骨傷醫(yī)院 浙江 杭州 311400

中藥研究

高效液相色譜法在去甲氧基姜黃素納米脂質載體中藥物含量測定中的應用

朱辰龍

浙江省杭州市富陽中醫(yī)骨傷醫(yī)院 浙江 杭州 311400

高效液相色譜法 去甲氧基姜黃素 納米脂質載體 含量測定

作為臨床中一種十分常見的藥物構成成分，去甲氧基姜黃素是姜黃素的類似成分，其臨床作用與姜黃素有著一定的相同之處[1]。去甲氧基姜黃素不僅能夠起到抗癌、抗氧化及抗炎等藥理作用，而且毒副作用少，具有良好的應用前景。然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)去甲氧基姜黃素水溶性差，降低了其生物利用度[2-3]。作為新型的藥物載體，納米脂質載體能夠促進液態(tài)脂質向固態(tài)脂質的轉化，提升藥物包封率及載藥量，與此同時增強藥物與癌細胞親和力，效果顯著[4]。研究采用高效液相色譜法（HPLC）測定去甲氧基姜黃素納米脂質載體中藥物含量，并對研究結果做出總結。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑：此次研究采用的高效液相色譜儀型號為LC-4000，購自山東金普分析儀器有限公司；真空干燥箱型號為DZF-6020，購自北京中科博達儀器科技有限公司提供；電子分析天平型號為FA6103C，購自上海精科天美科學儀器有限公司；紫外-可見分光光度計型號為KV-T3，購自南京肯凡電子科技有限公司；AS30600BDT超聲波清洗器購自杭州匯爾儀器設備有限公司。研究使用的去甲氧基姜黃素試劑（純度＞99%）購自南京道斯夫生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉購自蘇州市元碩精細化學品有限公司；卵磷脂購自安慶市中創(chuàng)工程技術有限責任公司；棕櫚酸甘油酯購自上海升德醫(yī)藥科技有限公司；單硬脂酸甘油酯購自南通錦恒化工有限公司；分析純購自德州潤昕實驗儀器有限公司。研究時實驗室用水均為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 供試溶液制備：首先采用電子分析天秤精密稱取去甲氧基姜黃素納米脂質載體制劑1ml，將其置入具塞錐形瓶，給予超聲及甲醇破乳處理；然后將上述物質轉移到容量為50ml的容量瓶中，在其中加入適量甲醇溶液予以定容，將其留作備用。空白納米脂質載體溶液的制備方法與上述相同。稱取去甲氧基姜黃素5.1mg，將其置入50ml棕色容量瓶，在其中加入甲醇定容，達到相應刻度后得110mg/ml標準品溶液，將其作為對照品溶液。

1.2.2 檢測波長確定：將甲醇作為空白，在紫外波長200～800nm范圍內對去甲氧基姜黃素溶液進行掃描，劑量為5mg/ml，經過掃描，發(fā)現(xiàn)當波長處于420nm時，去甲氧基姜黃素擁有最強吸收率。因此，以420nm作為檢測波長。

1.2.3 色譜條件確定：色譜柱規(guī)格為4.6nm×250nm，5mm，柱溫以300℃為宜，流速設置為1.0ml/min，進樣量為20ml，流動相為5%乙腈與43：57冰乙酸。

1.2.4 專屬性試驗：取去甲氧基姜黃素對照品溶液及去甲氧基姜黃素-納米脂質載體溶液、空白納米脂質載體溶液，分別給予甲醇稀釋，稀釋后各取20ml，進樣所需的色譜條件如1.2.3所示。結果顯示，輔料不會影響到對去甲氧基姜黃素的測定，說明該測定方法專屬性強。

2 結果

2.1 標準曲線：取 對 照 品溶液200μl、400μl、800μl、1600μl、3200μl及5000μl，置入容量為10ml以下的棕色量瓶中，經過甲醇破乳處理后定容，得到濃度 分 別 為 2.04μl/ml、4.08μl/ml、8.16μl/ml、16.32μl/ml、32.64μl/ml、52.5μl/ml，并對峰面積 Y及濃度X進行線性回歸分析，得方程為Y=122.32X-276.32，r=0.9997（n=6），且當去甲氧基姜黃素檢測濃度處于2.04～52.6mg/ml時，濃度與吸光度線性關系良好。

2.2 精密度試驗：對對照品溶液給予5次/d連續(xù)檢測，對日內精密度進行計算，同樣條件下進行1次/d檢測，連續(xù)檢測5d，得出日間精密。結果顯示日內精密度與日間精密度RSD分別為0.59%、0.67%（n=5），其能夠滿足實驗測定相關要求。

2.3 穩(wěn)定性試驗：對同一對照品在0、2、4、8、16、24不同時間點予以峰面積測定，得出RSD=0.49%（n=6），說明在24h內其吸收基本穩(wěn)定，符合測定要求。

2.4 重復性試驗：精密量取同一樣品，平行條件下制備6份去甲氧基姜黃素納米脂質載體供試液，在相應的色譜條件下進行測定，結果顯示RSD為0.99%，體現(xiàn)出其良好的重復性。

2.5 加樣回收率測定：精密量取供試品溶液1ml，將其置入9個棕色容量瓶中，并將其平均分為三組，每組分別加入161μl、20μl、242μl對照品溶液，得到不同濃度溶液，分別測定其在420nm位置的吸光度值，求出回收率。見表1。

2.6 樣品檢測：制備去甲氧基姜黃素納米脂質載體制劑3份，分別精密量取20μl，將其置入4ml EP管，給予甲醇定容處理，通過回歸方程計算具體濃度，結合稀釋倍數(shù)計算藥物含量。見表2。

表1 加樣回收率試驗結果分析（n=9）

表2 樣品含量測定結果分析（n=3）

3 討論

脂質納米粒在臨床中又被稱作是亞微米載體系統(tǒng)，其應用方便，能夠促進活性物與水在任意比例下進行互溶，提升吸收效果[5-6]。國外學者Mishra A等人在研究中采用HPLC法對復方姜黃微囊中的姜黃素及胡椒堿含量進行測定，結果顯示，姜黃素0.07342～0.36726μg間、胡椒堿0.00338～0.01696μg間表現(xiàn)為良好的線性關系，其回收率分別達到了97.86%、97.43%，RSD分別為1.81%、1.04%，基于此次試驗結果，對HPLC法有著較高的認可度，其認為該方法具有較高靈敏度，可在復方姜黃微囊中姜黃素及胡椒堿含量測定中得以應用[7]。此次研究發(fā)現(xiàn)，當去甲氧基姜黃素在420nm位置呈現(xiàn)出最大吸收，當其濃度在2.04～52.6mg/ml之間，去甲氧基與吸光度的線性關系呈現(xiàn)為良好狀態(tài)，經過計算，其平均回收率能夠達到99.22%，體現(xiàn)出該方法的優(yōu)越性，與國外學者研究一致。

綜上所述，采用HPLC法測定去甲氧基姜黃素納米脂質載體中藥物含量，操作便利、準確性高，結果可靠，可在臨床藥物含量檢測中得以推廣應用。

[1]劉永濤，李樂，王賽賽，等.魚組織中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素含量的超高效液相色譜法測定

[J].分析測試學報，2017，21(2)：183-184.

[2]韓超，朱振甌，劉濱，等.微波輔助萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定溫郁金中3個姜黃素類化合物[J].藥物分析雜志，2013，21(2)：185-188.

[3]陳進，代文婷，何爭民，等.姜黃素納米脂質載體中藥物含量及包封率測定方法的建立[J].中國藥物與臨床，2012，12(12)：1550-1553.

[4]Barbosa R D M， Klassen A， Marcato P D， et al.Validation of an HPLC method for the determination of Dibucaine encapsulated in Solid Lipid Nanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers[J]. Latin American Journal of Pharmacy，2013，32(9)：1362-1369.

[5]肖衍宇，陳曦，鄒浪，等.注射用姜黃色素納米脂質載體的制備及其質量評價[J].中國新藥雜志，2013，16(9)：1088-1093.

[6]陳進，代文婷，邢海燕，等.微載體藥物遞送系統(tǒng)在姜黃素中的應用研究進展[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2012，29(10)：885-889.

[7]Mishra A，Dewangan G，Singh W R，et al.A simple reversed phase high-performance liquid chromatography(RP-HPLC)method for determination of curcumin in aqueous humor of rabbit[J].Journal of Advanced Pharmaceutical Technology&Research，2014，5(3)：147-149.

2017-08-01