3型酸敏感離子通道在髓核致炎大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)研究

林士明 陳亦鵬 潘浩 王棟 賈高永 胡慶豐

3型酸敏感離子通道在髓核致炎大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)研究

林士明 陳亦鵬 潘浩 王棟 賈高永 胡慶豐

目的 通過觀察3型酸敏感離子通道（ASIC3）信號通路阻斷劑阿米洛利對髓核致炎大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中ASIC3表達(dá)的影響，探索ASIC3在髓核組織誘導(dǎo)發(fā)生根性疼痛過程中的可能機(jī)制。方法 48只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組和阿米洛利組3組，每組16只。對照組在暴露L5DRG后直接縫合。模型組取出大鼠尾部的髓核組織置于暴露的L5DRG上，縫合切口。阿米洛利組在模型組的基礎(chǔ)上，于術(shù)后2周內(nèi)每天腹腔內(nèi)注射20μg/kg阿米洛利。對照組和模型組不進(jìn)行藥物干預(yù)。造模成功后分別于術(shù)后2、4、6、8、10、12d檢測大鼠后足的機(jī)械刺激縮足閾值（PWT）。采用RT-PCR法和Western blot法測定ASIC3、TNF-α和IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)水平。術(shù)后1、3、7和14d采用ELISA法檢測外周血及DRG上清液中的TNF-α和IL-6水平，并檢測一氧化氮（NO）水平。結(jié)果 與對照組比較，術(shù)后12d時模型組大鼠后足的PWT顯著下降（P＜0.01），術(shù)后14d模型組大鼠DRG中ASIC3的mRNA和蛋白水平上調(diào)（均P＜0.01），外周血和DRG中NO、TNF-α、IL-6水平均上調(diào)（均P＜0.01）。與模型組比較，阿米洛利組大鼠后足的PWT在8d內(nèi)下降，之后逐漸增加，術(shù)后10和12d大鼠后足的PWT明顯高于模型組（均P＜0.01），術(shù)后14d DRG中ASIC3的mRNA和蛋白水平下降（均P＜0.05），外周血和DRG中NO、TNF-α、IL-6水平均顯著降低（均P＜0.01）。結(jié)論ASIC3可能在由髓核突出引起的神經(jīng)根性疼痛中起重要作用。ASIC3可能通過上調(diào)NO及細(xì)胞炎性因子（TNF-α和IL-6）的表達(dá)并增強(qiáng)這些介質(zhì)的疼痛加強(qiáng)作用，誘導(dǎo)痛覺過敏從而引起神經(jīng)根性疼痛。

椎間盤 髓核 3型酸敏感離子通道 炎癥

椎間盤突出后引起的根性疼痛與髓核致炎背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）的受壓和髓核接觸神經(jīng)根后誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)及自身免疫過程有關(guān)。椎間盤突出后，髓核組織分泌的促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8水平增加[1-3]。此外，免疫球蛋白、氫、一氧化氮（NO）和磷脂酶A2也參與到椎間盤疾患的病理生理反應(yīng)[4]。髓核與神經(jīng)根接觸后誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是復(fù)雜的，各種細(xì)胞介質(zhì)和炎癥通路參與其中。酸敏感離子通道（acid sensing ion channel，ASIC）蛋白是阿米洛利敏感性Na+通道/變性蛋白家族的成員，其形成同聚和異聚功能膜通道[5]，其中ASIC3已被證實與缺血、炎癥或組織酸中毒相關(guān)疼痛的傳導(dǎo)緊密相關(guān)，使髓核適應(yīng)椎間盤的酸性和高滲生物龕。本研究擬觀察ASIC3信號通路阻斷劑阿米洛利對髓核致炎大鼠DRG中ASIC3表達(dá)的影響，并檢測大鼠后足機(jī)械刺激縮足閾值（pain withdrawal threshold，PWT） 及外周血和 DRG中 NO、TNF-α、IL-6水平，以探索ASIC3在髓核組織誘導(dǎo)發(fā)生根性疼痛過程中的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物條件 48只清潔級成年雄性SD大鼠，體重220～240g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXY（浙）2013-0016。實驗在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心進(jìn)行，實驗室溫度22～25℃、12h明暗循環(huán)，大鼠自由飲水?dāng)z食。實驗程序遵循美國國立衛(wèi)生研究院制定的《實驗動物護(hù)理和使用指南》（第9版，2010年）。動物實驗方案通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 手術(shù)方法 通過腹腔內(nèi)注射水合氯醛（100g/L）麻醉大鼠。以大鼠髂嵴最高點連線為中心作25～30mm正中縱切口暴露脊柱及兩側(cè)組織，切除L5下關(guān)節(jié)突、L6上關(guān)節(jié)突和L5半椎板，暴露左側(cè)L5DRG及部分脊髓硬膜囊。采用18G的皮膚穿刺針頭在L5～6椎間盤進(jìn)行穿刺，針頭用持針器夾持，尖端保留5mm長度，于纖維環(huán)前外側(cè)方平行終板方向刺入，深度控制在5mm，刺入后維持5s；然后，斷尾，縱向切開鼠尾根部，從2個椎間盤內(nèi)取髓核組織共0.4mg，置于L5DRG上，術(shù)畢逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚。術(shù)后肌肉注射2萬U青霉素（80萬U/0.48g，H37021359，齊魯制藥有限公司）預(yù)防感染。

1.2.2 實驗分組及給藥方法 48只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組和阿米洛利組3組，每組16只。各組處理及給藥方法如下：（1）對照組在上述手術(shù)過程中暴露L5DRG后直接縫合。（2）模型組按上述手術(shù)方法進(jìn)行造模。（3）阿米洛利組：按上述手術(shù)方法進(jìn)行造模，并于術(shù)后2周內(nèi)每天腹腔內(nèi)注射20μg/kg阿米洛利（H10900015，美國Sigma公司）。對照組和模型組不進(jìn)行藥物干預(yù)。術(shù)后1、3、7、14d，每天隨機(jī)處死3只大鼠并取出L5DRG，采用5ml注射器刺入L5～6椎間隙水平內(nèi)取外周血，-20℃保存。

1.2.3 大鼠后足的PWT測定 各組隨機(jī)選取4只大鼠分別于術(shù)后 2、4、6、8、10、12d 采用 Up-Down 法測定大鼠后足的PWT。檢測工具為8根強(qiáng)度呈對數(shù)遞增方式的Von Frey纖毛機(jī)械刺激針（BIO-EVF3，上海玉研科學(xué)儀器有限公司），間隔5min重復(fù)刺激3次，初始刺激強(qiáng)度為2.04g，每次刺激時間為4～6s。在測試前30min，將大鼠置于測定PWT值用的籠子內(nèi)適應(yīng)測試環(huán)境。

1.2.4 ASIC3、TNF-α和 IL-6 mRNA表達(dá)水平測定采用RT-PCR法。術(shù)后14d，以Trizol法提取L5DRG中總RNA。取1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃60min，85℃ 5min，4℃ 5min。以 GAPDH 為內(nèi)參，設(shè)計引物：ASIC3 上游為 5′-CGCTATGTGGCTCGGAAGTG-3′，下游為 5′-TGTAGGACTCGCTGCGGTTG-3′；TNF-α 上游為 5′-CTGAGGTCAACCTGCCCAAG-3′，下游為 5′-GGCTGGGTAGAGAACGGATG-3′；IL-6 上游為 5′-CACCAGGAACGAAAGTCAAC-3′，下游為 5′-GGCTGTCAACAACATCAGTC-3′。通過逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 2μl進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)條件為：95℃10min，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s循環(huán)擴(kuò)增。采用ABI Prism 7300 SDS（美國ABI公司）儀器分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 ASIC3、TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)水平測定 采用Western blot法。術(shù)后14d，將DRG剪成細(xì)小的碎片，按每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃12 000g離心15min，取上清液，進(jìn)行蛋白含量測定。蛋白含量采用紫外分光光度法在562nm處進(jìn)行濃度測定。灌膠上樣進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳后，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用立春紅染色觀察轉(zhuǎn)印是是否成功，5%脫脂奶粉的Tris緩沖液4℃過夜封閉，洗膜后分別加入兔抗鼠 ASIC3（1∶400）、TNF-α（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）一抗溶液，4℃雜交過夜，用洗膜液漂洗后加入1∶1 000稀釋的二抗雜交 1h后，取出用洗膜液沖洗，ECL顯色，并使用Image J.1.46軟件分析灰度值。

1.2.6 TNF-α和IL-6水平測定 采用ELISA法測定術(shù)后1、3、7、14d外周血及DRG上清液中的TNF-α和IL-6水平。試劑盒由上海恒斐生物科技有限公司提供。

1.2.7 NO水平檢測 將外周血和DRG以1 000g離心10min，收集上清液，使用NO測定試劑盒（型號A012，南京建成生物工程研究所）在術(shù)后1、3、7和14d測定NO水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠DRG中ASIC3的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 模型組及阿米洛利組大鼠DRG中ASIC3的mRNA和蛋白水平均高于對照組（均P＜0.01），而阿米洛利組大鼠DRG中ASIC3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于模型組（均P＜0.05），見圖1。

圖1 3組大鼠DRG中ASIC3的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（a：3組大鼠ASIC3的mRNA表達(dá)水平比較；b：3組大鼠ASIC3蛋白表達(dá)電泳圖；c：3組大鼠ASIC3的蛋白表達(dá)水平比較）

2.2 大鼠后足 PWT的變化情況 術(shù)后 2、4、6、8、10、12d模型組大鼠后足的PWT與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。阿米洛利組大鼠后足的PWT在術(shù)后8d內(nèi)下降，之后逐漸增加；術(shù)后10和12d大鼠后足的PWT明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.01），見圖 2。

2.3 3組大鼠外周血和DRG中NO、TNF-α和IL-6表達(dá)水平的比較 模型組及阿米洛利組大鼠外周血和DRG 中術(shù)后 1、3、7、14d 的 NO、TNF-α 和 IL-6表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)（均P＜0.05），且模型組術(shù)后3、7、14d的NO、TNF-α和IL-6表達(dá)水平較阿米洛利組也顯著上調(diào)（均P＜0.01），見表1～3。通過RT-PCR法和Western blot法測量3組大鼠DRG也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，見圖3。

圖2 大鼠后足PWT的變化情況

表1 3組大鼠外周血和DRG中NO表達(dá)水平的比較（μmol/L）

3 討論

椎間盤突出引起的椎神經(jīng)根病與DRG損傷密切相關(guān)。大量的證據(jù)表明ASIC3可能涉及椎神經(jīng)根病的各種因素和各種類型的疼痛，例如缺血性、炎性、機(jī)械性和神經(jīng)根性疼痛[6-8]。然而，ASIC3信號通路阻斷劑在椎神經(jīng)根病中的作用還是未知的。本研究中，筆者加入了ASIC3信號通路阻斷劑阿米洛利，從而進(jìn)一步探討ASIC3在椎間盤突出引起的神經(jīng)根性疼痛的作用機(jī)制。椎間盤是含髓核組織的特殊生物力學(xué)結(jié)構(gòu)，通過分泌基質(zhì)高分子，提高滲透壓來使其適應(yīng)所施加的機(jī)械負(fù)荷。最近一些研究把焦點轉(zhuǎn)移到由髓核組織與神經(jīng)根和周圍組織接觸引發(fā)的炎癥過程[9-10]。髓核被認(rèn)為是有限的血管供應(yīng)的閉合組織，椎間盤纖維環(huán)破裂后，髓核通過裂隙突出椎管內(nèi)，此時髓核作為一個特異性抗原，將導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)發(fā)生，通過釋放各種細(xì)胞炎性介質(zhì)引起一系列炎癥反應(yīng)[11-12]。本研究通過將髓核置于DRG的模型組與未將髓核置于DRG的對照組比較，發(fā)現(xiàn)模型組DRG神經(jīng)元中ASIC3的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加，表明細(xì)胞炎癥反應(yīng)可以引起ASIC3在DRG神經(jīng)元的上調(diào)，而腹腔內(nèi)注射阿米洛利則顯著抑制了DRG神經(jīng)元中ASIC3表達(dá)的增加。

表2 3組大鼠外周血和DRG中TNF-α表達(dá)水平的比較（ng/L）

表3 3組大鼠外周血和DRG中IL-6表達(dá)水平的比較（ng/L）

圖3 3組大鼠DRG中TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（a：3組大鼠IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平比較；b：3組大鼠IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)電泳圖；c：3組大鼠IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)水平比較）

痛覺過敏是所有炎癥過程的共同特征，其特征性在于感受傷害閾值的降低和對于熱和機(jī)械刺激的敏感增加[13]。本研究模型組中大鼠后足的PWT在術(shù)后12d內(nèi)持續(xù)下降，在10d時下降最為明顯。然而，由髓核組織誘導(dǎo)的痛覺過敏在阿米洛利組中得到顯著改善，在術(shù)后8d開始顯著上升。表明ASIC3與痛覺過敏密切相關(guān)，阿米洛利可減輕ASIC3介導(dǎo)的痛覺過敏。

NO和細(xì)胞炎性因子（TNF-α和IL-6）與神經(jīng)肽的增加相關(guān)，在先前研究中觀察到，用細(xì)胞炎性因子抑制劑阻斷其上游信號通路可以減少外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛[14-15]。本研究模型組術(shù)后14d，通過ELISA和生化檢測到外周血和DRG中NO、TNF-α和IL-6水平均增加。通過Western blot法也同樣檢測到DRG中TNF-α和IL-6水平均增加。阿米洛利組顯著抑制了術(shù)后3、7、14d NO、TNF-α和IL-6水平的上調(diào)。表明ASIC3與炎癥過程密切相關(guān)，可以促進(jìn)多種炎性因子的表達(dá)并增強(qiáng)這些介質(zhì)的疼痛加強(qiáng)作用。而阿米洛利通過抑制ASIC3的表達(dá)從而降低細(xì)胞炎性因子的表達(dá)，減緩局部的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，椎間盤突出發(fā)生后，髓核介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以引起ASIC3在DRG神經(jīng)元上的表達(dá)上調(diào)，而ASIC3又可促進(jìn)多種細(xì)胞炎性因子（TNF-α和IL-6）的表達(dá)，使局部形成正反饋，加強(qiáng)這些介質(zhì)的疼痛加強(qiáng)作用，誘導(dǎo)痛覺過敏從而引起神經(jīng)根性疼痛。抑制ASIC3則可以減弱髓核組織對DRG的炎癥損傷而致的痛覺過敏，減緩神經(jīng)根性疼痛。

[1] Sasaki N,Sekiguchi M,Kikuchi S,et al.Effects of asialo-erythropoietin on pain-related behavior and expression of phosphorylated-p38 map kinase and tumor necrosis factor-alpha induced by application of autologous nucleus pulposus on nerve root in rat[J].Spine(Phila Pa 1976),2011,36(2):86-94.doi:10.1097/BRS.0b013e3181f137a8.

[2] Zu B,Pan H,Zhang X J,et al.Serum levels of the inflammatory cytokines in patients with lumbar radicular pain due to disc herniation[J].Asian Spine J,2016,10(5):843-849.doi:10.4184/asj.2016.10.5.843.

[3] Dagistan Y,Cukur S,Dagistan E,et al.Role of expression of inflammatory mediators in primary and recurrent lumbar disc herniation[J].J Korean Neurosurg Soc,2017,60(1):40-46.doi:10.3340/jkns.2015.0911.002.

[4] Amin R M,Andrade N S,Neuman B J.Lumbar disc herniation[J].Curr Rev Musculoskelet Med,2017,10(4):507-516.doi:10.1007/s12178-017-9441-4.

[5] Stankowska D L,Mueller B H,Oku H,et al.Neuroprotective effects of inhibitors of Acid-Sensing ion channels(ASICs)in optic nerve crush model in rodents[J].Curr Eye Res,2017:1-12.doi:10.1080/02713683.2017.1383442.[Epub ahead of print]

[6] Gao M,Long H,Ma W,et al.The role of periodontal ASIC3 in orofacial pain induced by experimental tooth movement in rats[J].Eur J Orthod,2016,38(6):577-583.doi:10.1093/ejo/cjv082.

[7] Munro G,Christensen J K,Erichsen H K,et al.NS383 selectively inhibits acid-sensing ion channels containing 1a and 3 subunits to reverse inflammatory and neuropathic hyperalgesia in rats[J].CNS NeurosciTher,2016,22(2):135-145.doi:10.1111/cns.12487.

[8] 胡四平,汪衛(wèi)星,劉洋,等.局部注射酸敏感離子通道抑制劑阿米洛利對脛骨癌痛大鼠疼痛行為學(xué)的影響[J].浙江醫(yī)學(xué),2013,35(8):623-625.

[9] Ohtori S,Inoue G,Eguchi Y,et al.Tumor necrosis factor-alpha-immunoreactive cells in nucleus pulposus in adolescent patients with lumbar disc herniation[J].Spine(Phila Pa 1976),2013,38(6):459-462.doi:10.1097/BRS.0b013e3182739cb4.

[10] de Souza Grava A L,Ferrari L F,Defino H L.Cytokine inhibition and time-related influence of inflammatory stimuli on the hyperalgesia induced by the nucleus pulposus[J].Eur Spine J,2012,21(3):537-545.doi:10.1007/s00586-011-2027-8.

[11] Kalb S,Martirosyan N L,Kalani M Y,et al.Genetics of the degenerated intervertebral disc[J].World Neurosurgery,2012,77(3-4):491-450.doi:10.1016/j.wneu.2011.07.014.

[12] 朱宇,姜宏,俞鵬飛.腰椎間盤突出后重吸收的研究進(jìn)展[J].中國脊柱脊髓雜志,2014,24(12):1124-1128.doi:10.3969/j.issn.1004-406X.2014.12.12.

[13] Yagi J,Wenk H N,Naves L A,et al.Sustained currents through ASIC3 ion channels at the modest pH changes that occur during myocardial ischemia[J].Circ Res,2006,99(5):501-509.doi:10.1161/01.RES.0000238388.79295.4c.

[14] Studer R K,Aboka A M,Gilbertson L G,et al.p38 MAPK inhibition in nucleus pulposus cells:a potential target for treating intervertebral disc degeneration[J].Spine(Phila Pa 1976),2007,32(25):2827-2833.doi:10.1097/BRS.0b013e31815b757a.

[15] HayashiY,Ohtori S,Yamashita M,et al.Direct single injection of p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor does not affect calcitonin gene-related peptide expression in dorsal root ganglion neurons innervating punctured discs in rats[J].Spine(Phila Pa 1976),2009,34(26):2843-2487.doi:10.1097/BRS.0b01-3e3181b8db15.

Effect of amiloride on ASIC3 expression in dorsal root ganglion following nerve root inflammation induced by nucleus pulposus in rats

LIN Shiming,CHEN Yipeng,PAN Hao，et al.
Department of Orthopedics，Guang Xing Hospital Affliated to Zhejiang Uniuersity of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310007，China

Objective To investigate the effect of amiloride on the expression of acid sensing ion channel 3 (ASIC3)in dorsal root ganglion(DRG)following nerve root inflammation induced by nucleus pulposus in rats. Methods Forty eight SD rats were randomly divided into control group(Sham,n=16),inflammation group(NP,n=16),inflammation+amiloride group(NP+Ami,n=16).The L5DRG was exposed in rats of NP and NP+Ami groups by surgery,and sham surgery was performed in sham group.Intraperitoneal injection of amiloride 20μg/kg was given to rats in NP+Ami group q.d for 2 weeks after surgery,and no amiloride was given to rats in sham group and NP group．The mechanical pain withdrawal threshold(PWT)was evaluated at 2,4,6,8,10 and 12d after modeling.The expression of ASIC3,TNF-α,IL-6 mRNA and protein were examined by Real-time PCR and Western blot,respectively.TNF-α and IL-6 concentrations present in peripheral blood and DRG were determined at 1,3,7 and 14d after the surgical procedures using ELISA method.NO levels were examined by biochemistry test. Results Rats exposed to the NP showed decreased PWT at 12d after surgery(P＜0.01),and the levels of ASIC3 and the NO,TNF-α,IL-6 were up-regulated in DRG induced by NP 14d after surgery(all P＜0.01).Compared to NP group the mechanical PWT decreased at 8d after surgery and then gradually increased at 10 and 12d after surgery in NP+Ami group (all P＜0.01).ASIC3 was down-regulated(both P＜0.05),and the levels of NO,TNF-α,IL-6 were significantly decreased at 14d after surgery(all P＜0.01)in NP+Ami group. Conclusion ASIC3 may upgrade the expression of NO and inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 to induce hyperalgesia and never root pain.

Intervertebral disc Nucleus pulposus ASIC3 Inflammation

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-918

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2015ZA157）；杭州市科技計劃重點項目（20150733Q60）

310007 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院骨科

胡慶豐，E-mail：huqingfeng258@163.com

2017-04-22）

陳麗）