食源性雌二醇?xì)埩魴z測技術(shù)研究進(jìn)展

白宇，胡景炎，張井

1(溫州科技職業(yè)學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州，325006) 2(溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗站，浙江 溫州，325006)

食源性雌二醇?xì)埩魴z測技術(shù)研究進(jìn)展

白宇1，胡景炎1，張井2*

1(溫州科技職業(yè)學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州，325006) 2(溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗站，浙江 溫州，325006)

具有促生長、催情作用的雌二醇在畜牧業(yè)生產(chǎn)中已發(fā)揮重要作用，然而廣泛的不當(dāng)應(yīng)用常導(dǎo)致食源性雌二醇?xì)埩舻膰?yán)重后果。當(dāng)前，雌二醇?xì)埩魧?dǎo)致的生物雌激素樣作用、弱致癌性已引起全世界的廣泛關(guān)注，加強食源性雌二醇?xì)埩舻谋O(jiān)測與管控，加強對雌二醇?xì)埩魴z測技術(shù)的研究與應(yīng)用，對于保障食品安全與人類生理健康等具有十分重要的現(xiàn)實意義。該文概述了食源性雌二醇的主要來源、殘留危害分析和主要檢測分析技術(shù)。

雌二醇；殘留風(fēng)險；潛在致癌性；檢測技術(shù)

雌二醇(estradiol，E2)作為最具活性的天然性激素之一，在生物機體內(nèi)含量最多，活性最強，主要由機體內(nèi)卵泡顆粒細(xì)胞合成和分泌，是雌激素中一類含18個碳原子的類固醇激素，能促進(jìn)動物性器官、第二性征及乳腺的維持和發(fā)育，增強妊娠晚期子宮的自發(fā)收縮活動以及增強子宮對催產(chǎn)素的反應(yīng)，維持鈣平衡以致影響骨生長，改變脂肪代謝等功能，與動物以及人類的生長繁殖息息相關(guān)[1]。但是E2也直接或間接地干擾正常內(nèi)分泌物質(zhì)的合成、釋放和代謝等過程，導(dǎo)致一系列的神經(jīng)系統(tǒng)異常、生殖功能異常和免疫功能異常。

E2這類具有性激素樣活性的化合物，于50年前便已作為同化劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用，用以促進(jìn)生長和提高飼料轉(zhuǎn)化率。然而，由于雌激素類添加劑在動物體內(nèi)的不完全代謝，主要的殘留代謝產(chǎn)物仍具有生物活性，最終通過食物鏈作用富集在生物機體的脂肪組織，不僅對動物健康形成危害，而且對人類也會形成長期毒害作用，甚至對生態(tài)環(huán)境造成直接或間接危害。20世紀(jì)80年代開始，許多國家和組織就已經(jīng)通過立法來限制或禁止在食品動物中使用甾類同化激素[2]。歐盟自1988年禁止所有甾類同化激素用于促生長目的，制定了針對歐盟國家內(nèi)部流通及外部輸入的動物源性食品的一整套嚴(yán)格的監(jiān)管措施[3]?，F(xiàn)今，美國、歐盟、日本等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)已形成完善的檢測體系，而我國也在本世紀(jì)初開始建立國家獸藥殘留監(jiān)控體系和獸藥安全評價系統(tǒng)，但迄今為止雌激素類藥物殘留的檢測和評價體系還不是十分完善。

隨著人們對動物源性激素類藥物殘留危害性認(rèn)知的逐漸增強，E2所誘發(fā)的食品安全問題也越發(fā)凸顯。應(yīng)用可靠的檢測分析方法檢測可食性畜產(chǎn)品中的E2濃度是確保食品安全的重要措施。目前，常用的理化儀器檢測方法有高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等；免疫學(xué)分析法有放射性免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附法以及熒光免疫分析法等。

易非知道有危險，知道危險在靠近，可是她太年輕了，她不知道避讓，反而迎上去，她在逼那個危險，她以為勇氣可以把它嚇退，可是她不知道，把它逼到了角落里，它是會更加兇猛的。

1 動物性食品中E2的主要來源

1.1 肉類生產(chǎn)

動物性食品中雌激素來源比較廣泛，部分來源于飼料中E2的非法添加，正常情況下每公斤飼料只需加入20～70 mg的E2，就能達(dá)到促進(jìn)動物體內(nèi)鈣、氮、磷等元素吸收的功效；當(dāng)E2達(dá)到0.3 nmol/L的生理濃度，就可以刺激細(xì)胞迅速生長[2-3]。因此，一些養(yǎng)殖戶為了追求快速促進(jìn)動物生長發(fā)育的功效，違規(guī)在飼料中添加雌激素及其衍生類物質(zhì)等違禁藥物。E2對于機體蛋白的合成有促進(jìn)作用，在氮的代謝中發(fā)揮著重要作用，能提高機體對氨基酸的利用率。肉牛若以E2作為增重劑，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的同時，可以減少氨的排泄量，其日增重和飼料報酬能得到顯著提高，而且對飼料消化率無明顯影響，此類天然激素作為增重劑在一些國家仍在使用。20世紀(jì)60～70年代的美國約80%以上肥育牛生產(chǎn)過程中用到雌激素，最初用于牛皮下埋植劑或注射，幼畜斷奶后埋植于耳后皮下，育肥階段改為飼料添加劑方式投藥。

我們要計算企業(yè)的盈虧平衡點、計算企業(yè)的用工成本、計算企業(yè)每投入一筆錢的產(chǎn)出回報，要計算每個項目的盈利周期，只有將所有的賬都算清楚、算明白才可以讓我們的企業(yè)良性發(fā)展。

內(nèi)分泌激素不僅能影響生長、發(fā)育和生殖，也能影響免疫系統(tǒng)，如性激素影響免疫應(yīng)答。內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間能夠相互誘導(dǎo)和相互作用，2個系統(tǒng)之間擁有一套共同的作為信息傳遞者的激素淋巴因子等信息分子，并且與相同結(jié)構(gòu)的受體結(jié)合，已證明免疫系統(tǒng)中具有環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的作用位點[16]。尹大強等[17]報道幾種激素對鯽魚淋巴細(xì)胞增殖的影響，其中E2(0.002～20 ng/mL)對鯽魚淋巴細(xì)胞增殖有明顯的誘導(dǎo)作用，判定E2、睪酮和雙酚A等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物具有潛在的免疫毒性。

1.2 乳制品

重組基因酵母篩檢法(yeast estrogen screen,YES)是早年建立的評價環(huán)境雌激素(environmental estrogens,EEs)活性的常用方法[38]，應(yīng)用重組基因酵母檢測樣品，將人雌激素受體DNA序列穩(wěn)定重組于酵母染色體，同時酵母細(xì)胞含有編碼β-半乳糖苷酶Lac-Z基因的表達(dá)質(zhì)粒，當(dāng)雌激素活性物質(zhì)激活酵母中的雌激素受體基因響應(yīng)片段，β-半乳糖苷酶相關(guān)基因也相應(yīng)的被激活與表達(dá)，共同開始蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和合成過程，因此β-半乳糖苷酶活性的強弱與待測的雌激素活性呈正相關(guān)。由于該檢測法操作簡單快速、靈敏度高、特異性強，酵母細(xì)胞易于培養(yǎng)且費用低廉，可用于大批量樣品的篩查。GAIDO等[39]研究人員在1997年首次建立重組基因酵母測評體系，對E2的檢測靈敏度可達(dá)到10-12mol/L。COMTOIS等[40]以YES試驗分析城市污水中的環(huán)境雌激素成分比例含量，其建立的E2檢測體系檢測限達(dá)1.4 ng/L，其中對污水中的E2直接檢測，當(dāng)量濃度線性范圍為4.4～72 ng/L，由于YES能同時處理大量的樣品并只需污水過濾后便能直接測定，使得這檢測體系便于推廣以及。

另外在奶牛生產(chǎn)中，經(jīng)常使用苯甲酸雌二醇(代謝標(biāo)志物為E2)與孕激素誘導(dǎo)奶牛發(fā)情，而且能誘導(dǎo)泌乳，E2主要用作催情劑而非“催奶素”，同樣會導(dǎo)致E2這類激素殘留。有時為了增加牛奶產(chǎn)量，通常使用含動物蛋白的高蛋白飼料飼喂，這樣進(jìn)一步導(dǎo)致牛奶中的雌激素殘留量增加。

目前我國奶牛生產(chǎn)業(yè)中小規(guī)模和散養(yǎng)戶仍然占有相當(dāng)大的比重，奶源品質(zhì)控制難度較大，規(guī)范化使用獸藥，且按照規(guī)定嚴(yán)格遵守休藥期都較為困難。并且我國對于激素類藥物殘留一直未納入乳品的日常檢測，因此急需加強該類藥物殘留的監(jiān)控與管控，并在食品安全風(fēng)險監(jiān)測項目中納入相應(yīng)的監(jiān)測內(nèi)容。

1.3 保健類藥物

根據(jù)倪繼紅等對人參蜂皇漿影響兒童生長發(fā)育的臨床與實驗研究[9]，發(fā)現(xiàn)臨床16例服藥兒童因服用蜂乳、花粉、人參、蜂皇漿等引起性早熟，同時，性激素分泌也受到一定影響，動物實驗結(jié)果也證實喂藥幼鼠體重、卵巢和子宮重量顯著增加，卵泡的成熟和排卵、睪丸的生精功能明顯提高。采用放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)測定人參蜂皇漿中E2和睪酮含量，顯示E2含量為73～134 pg/mL，睪酮含量為45～71 ng/mL。蜂皇漿和人參都能興奮垂體分泌促性腺激素，某些補品中含有的蜂乳、花粉、人參等成分，如人參含有增強RNA聚合酶I和II活性的成分，刺激肝、腎、睪丸等許多器官組織核酸及蛋白質(zhì)的合成，從而影響生長發(fā)育。

1.4 水產(chǎn)品

雌激素類藥物還具有縮短生長周期和影響動物性別分化的效應(yīng)，大多被不法水產(chǎn)養(yǎng)殖戶添加在飼料中用以提高水產(chǎn)品的產(chǎn)量。此外，水環(huán)境作為環(huán)境雌激素最大的存儲庫，隨著水體污染的日益嚴(yán)重，水產(chǎn)品的質(zhì)量和安全正在受到環(huán)境雌激素的污染。據(jù)JURGENS等[10]報道表明，在英國多地的河流、湖泊、污水處理口等均有雌激素的富集。而我國的多個水域，包括長江和嘉陵江流域及其水產(chǎn)品中也均發(fā)現(xiàn)雌激素[11]。20世紀(jì)90年代，美國的五大湖區(qū)域也出現(xiàn)了魚類雌性化、生殖發(fā)育異常等現(xiàn)象，而排入水中的天然或人工合成的環(huán)境雌激素是導(dǎo)致這一后果的主要原因[12]。此外，當(dāng)水產(chǎn)養(yǎng)殖水體受到畜牧業(yè)養(yǎng)殖污染，如含有雌激素的畜禽排泄物未經(jīng)法定處理程序排放，造成水產(chǎn)動物生長過程體內(nèi)E2一定的蓄積，通過食物鏈進(jìn)入人體后，仍具有較強的生物活性。

2 E2殘留的危害

2.1 E2殘留的雌激素樣作用

通過TAKASHI等[19]對牛奶中的雌激素與前列腺癌的相關(guān)性研究顯示，E2對與生殖相關(guān)的類固醇的合成過程中的酶起到抑制作用，使其合成受阻，影響干擾機體內(nèi)分泌生殖系統(tǒng)的正常運作，在前列腺癌形成過程中起誘發(fā)機制，引起前列腺的DNA損傷。

通過對區(qū)域內(nèi)污水系統(tǒng)管網(wǎng)圖2分析可知，杏A注水站與杏C注水站通過杏X污水站可以建立連通關(guān)系；杏A注水站與杏B注水站通過杏X污水站、杏X脫水站可以建立連通關(guān)系，由此可以將原杏A注水站來水通過以上兩個渠道調(diào)入相應(yīng)注水站。杏X脫水站將0.6×104m3/d污水外輸方向由杏X污水站調(diào)整至杏B污水站，杏X污水站將0.6×104m3/d污水外輸方向由杏A深度污水站調(diào)整至杏C深度污水站，同時杏B注水站和杏C注水站各啟1臺注水泵即可滿足杏A注水站停運后杏四～六區(qū)東部及東部過渡帶深度注水管網(wǎng)運行需求。

經(jīng)過基因改良的奶牛幾乎在整個懷孕期都在泌乳，因此現(xiàn)代的商業(yè)牛奶中含有大量的雌激素。硫酸雌酮作為牛奶中的主要雌激素，具有較高的生物活性，攝入人體后迅速轉(zhuǎn)換為雌酮(E1)和E2，兒童和青少年作為奶及乳制品的主要的消費人群，其中的E2殘留將會對該類人群的生長發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響[6]。MARUYAMA等[13]通過研究攝入商品化牛奶人群的尿液提取雌激素，發(fā)現(xiàn)E2的含量均有所升高，2 h內(nèi)其濃度幾乎不改變，其代謝過程變得非常緩慢。進(jìn)一步研究顯示原因就在于促性腺激素分泌被抑制，其次是睪酮的分泌減少，這便會對男性的生殖健康產(chǎn)生影響，還會引起女性的亞臨床性腺機能減退。因此認(rèn)為商品化牛奶的攝入是影響兒童性早熟以及男孩女性化的主要原因之一[6,11]。

MATAGNE等[14]研究E2對幼年雌鼠下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)脈沖式分泌的影響時，發(fā)現(xiàn)小鼠注射E2后，出現(xiàn)GnRH脈沖間隙減少，陰道開口時間提前，首次發(fā)情時間提前等現(xiàn)象。由此認(rèn)為E2影響新生雌鼠大腦中與性激素分泌有關(guān)細(xì)胞的分化，從而導(dǎo)致性早熟。侯麗艷等[15]發(fā)現(xiàn)雌激素主要是通過干擾下丘腦-垂體-睪丸軸，抑制垂體促性腺激素分泌而降低循環(huán)系統(tǒng)中睪丸睪酮濃度，進(jìn)而破壞生殖系統(tǒng)生長發(fā)育。

2.2 E2殘留的免疫毒性

為保證動物性食品衛(wèi)生安全，我國農(nóng)業(yè)部公告第176號文件明確規(guī)定在飼料及動物飲用水中嚴(yán)禁加入雌二醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇等激素類藥物[4]，農(nóng)業(yè)部235號公告也表明在所有可食性動物組織中不得檢出雌二醇[5]。然而我國畜牧業(yè)總量大，大型集約化、中小規(guī)模以及散戶等各種養(yǎng)殖模式并存，濫用雌激素的現(xiàn)象仍然普遍存在，監(jiān)管困難。大部分的濫用現(xiàn)象歸結(jié)于一種無意識，對于所做之事的不計后果，一方面是由于對后果的“不可知”，另一方面是對后果的“不感知”。“不可知”是由于農(nóng)戶對專業(yè)知識的缺乏，意識不到E2對于人體以及環(huán)境的危害；而“不感知”是由于生產(chǎn)者為追求經(jīng)濟(jì)效益最大化而產(chǎn)生的一種群體潛意識，沉默的大多數(shù)抱著僥幸心理，即使明明知曉E2殘留會帶來一些危害，仍然潛意識中不去深入思考造成相關(guān)的危害。這就要求政府充分發(fā)揮市場調(diào)控的職能，對市場具有監(jiān)控作用的政府職能部門不僅要做好監(jiān)控管理工作，更需要加強對養(yǎng)殖農(nóng)戶相關(guān)專業(yè)知識的宣傳普及工作。

2.3 E2殘留的致癌風(fēng)險

毒理學(xué)和流行病學(xué)研究表明，人體內(nèi)E2的含量與乳腺癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜肌瘤等疾病有很大相關(guān)性，部分學(xué)者將E2歸類為一種致癌物質(zhì)。然而E2的潛在致癌性向來都是有爭議的，早期在Ames試驗(細(xì)菌回復(fù)突變試驗)和一些其他細(xì)胞試驗中都否定了雌激素包括E2的致突變活性，一度將其歸類為非誘變性和非遺傳毒性[18]。然而，這些早期的試驗結(jié)果與近年已確定的具有潛在致突變性的各種類型的基因損傷并不一致。

儀器分析法主要為色譜法，包括高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)，以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)。GC-MS因其將色譜的高效分離能力和質(zhì)譜強大的定性能力相結(jié)合，成為目前獸藥殘留分析領(lǐng)域中最強大、最有力的定性定量工具。然而，儀器分析方法又存在需要精密昂貴的儀器，樣品預(yù)處理復(fù)雜耗時，衍生化會造成目標(biāo)類固醇的損失或降解等弊端，因此在實踐中難以做到快速檢測大量樣品，不能滿足現(xiàn)場檢測要求[29]。

QIN等[19]統(tǒng)計西方國家的牛奶消費與雌激素循環(huán)水平數(shù)據(jù)顯示，西方男性罹患前列腺癌的患病率比亞洲男性更高，揭示牛奶中的雌激素是導(dǎo)致前列腺癌的重要因素之一。因此腫瘤的發(fā)生可能與組織或細(xì)胞中的E2或E2代謝物相關(guān)聯(lián)[20]。通過TRIPATHI等[21]以生物素標(biāo)記E2的研究表明，E2及其代謝物導(dǎo)致染色體或基因異常的機理可歸納為以下幾點：(1)基因序列的堿基替換、刪除與插入；(2)染色體數(shù)的擴(kuò)增及丟失；(3)染色體易位；(4)基因擴(kuò)增。

受應(yīng)試教育觀念的影響，許多教師、家長都把關(guān)注的重點放在學(xué)生考試科目的學(xué)習(xí)上，忽略了學(xué)生身體素質(zhì)的提高，不重視甚至反對學(xué)生參與各種體育運動，而足球?qū)W習(xí)、訓(xùn)練的時間都比較長，難以獲得教師和家長方面的大力支持。同時，由于足球運動往往比較激烈，學(xué)校和家長擔(dān)心學(xué)生的安全問題，于是相互之間形成了一種默契，逐漸減少學(xué)生的足球教學(xué)比例，或者改為“重理論，輕實踐”的教學(xué)方式，使得足球教學(xué)失去了真正的意義。

藝術(shù)技巧是表現(xiàn)，文化底蘊則是作品的靈魂，綜觀中華藝術(shù)之長河，大浪淘沙留有美名的藝術(shù)家大都是大文豪，如蘇東坡、文征明等等。

2.3.1 E2代謝物作用

E2代謝物——2-羥雌二醇、4-羥雌二醇，以及相應(yīng)的醌可以游離自由基為媒介造成直接或間接的DNA損傷[22]。肝臟中的細(xì)胞色素P450促使E2代謝主要轉(zhuǎn)化成2-羥基雌二醇，只有15%～20%是4-羥基雌二醇，而在子宮、乳腺、卵巢中的P450使E2主要轉(zhuǎn)化為4-羥基雌二醇，并且由鄰苯二酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶將其甲基化。兒茶酚雌能以半醌自由基的中間形式，通過在醌與氫醌(兒茶酚)之間的氧化還原循環(huán)，代謝生成自由基，繞過半醌這個中間代謝物則少了自由基的產(chǎn)生。而羥自由基與DNA共價結(jié)合形成DNA加合物，又可共價修飾嘌呤或嘧啶，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，突變形成原癌基因(c-myc)，而c-myc擴(kuò)增并發(fā)染色體畸變，這是致癌進(jìn)程中重要的一個要素[20]。

HUSEBY[23]等建立的小鼠動物模型揭示E2的直接致癌作用。在倉鼠腎腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)，E2通過特殊的4-羥基酶催化轉(zhuǎn)化為4-羥基雌二醇造成DNA損傷，而且代謝產(chǎn)物4-羥雌二醇通過激活兒茶酚的活性半醌啟動誘導(dǎo)腫瘤的形成。

通過對E2的危險性分析發(fā)現(xiàn)，E2能發(fā)揮基因毒性是通過以醌介導(dǎo)反應(yīng)的兒茶酚雌的代謝活化，以及后續(xù)的代謝物氧化還原循環(huán)。經(jīng)過實驗動物以及細(xì)胞水平試驗驗證E2的殘留存在如下風(fēng)險：(1)誘導(dǎo)染色體結(jié)構(gòu)畸變；(2)產(chǎn)生異倍染色體；(3)c-myc基因擴(kuò)增?；蛟S，單一風(fēng)險不足以引發(fā)乳腺癌等相關(guān)疾病，但是一系列細(xì)胞和基因分子水平的改變，便能夠誘發(fā)腫瘤的形成，如激素依賴性器官腫瘤；基因突變引發(fā)腫瘤；破壞體內(nèi)遺傳物質(zhì)，使染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目發(fā)生變化。

此外，本研究仍有不足之處：(1)本研究納入標(biāo)本量較少，因此指標(biāo)的診斷價值仍需大樣本、多中心的臨床研究進(jìn)一步驗證和完善。(2)本研究中IGF-1聯(lián)合CEA對女性的診斷價值不高，文中沒有列出。(3)本研究基于血清循環(huán)IGF-1和CEA 2個指標(biāo)對于CRC的診斷價值進(jìn)行評價，僅作為一種臨床上的輔助篩查方法。

2.3.2 E2的直接作用

E2可直接破壞瓦解細(xì)胞中的微管結(jié)構(gòu)，抑制染色體的有絲分裂，進(jìn)而導(dǎo)致異倍體的產(chǎn)生[24]。染色體的異倍體性又誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而使細(xì)胞獲得致腫瘤性。E2還可介導(dǎo)細(xì)胞中某些癌基因的表達(dá)，如E2能刺激乳腺癌相關(guān)肽基因(pS2)的表達(dá)，誘導(dǎo)靶器官形成腫瘤[25]。

KONG等[26]報道不同濃度E2影響中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞(V79) 試驗，發(fā)現(xiàn)10-10mol/L的E2具有轉(zhuǎn)移酶基因(hprt)編碼序列的致突變效應(yīng)，濃度升高反而觀測不到這種作用。E2能提高h(yuǎn)prt在V79細(xì)胞中的突變頻率，又能誘導(dǎo)hprt分子性質(zhì)的改變，包括外顯子的缺失，堿基轉(zhuǎn)移和插入，嘧啶與嘌呤的顛換等變化。

食源性E2模擬或拮抗正常的內(nèi)源性激素，與體內(nèi)正常的雌激素發(fā)生協(xié)同反應(yīng)，促使機體雌激素活性增強，主要表現(xiàn)為雌激素樣作用。青春期前兒童血清中E2濃度(酶免疫法)很少超過2 ng/L，這階段兒童對于外源性激素的敏感性高，微量的E2即可影響兒童的成長發(fā)育，外環(huán)境中稍有過量的E2殘留污染就會使兒童暴露在危險當(dāng)中。

2.3.3 雌激素結(jié)合受體作用

JENSEN等[27]通過對雌激素的深入研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體作用機制：當(dāng)E2穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)中與一次性蛋白受體相結(jié)合，這種結(jié)合可將受體活化，形成典型的配體激素受體復(fù)合物，并遷移到細(xì)胞核，通過和特定DNA序列(如PS2基因)結(jié)合而啟動靶基因表達(dá)，引起細(xì)胞的變化從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

雌激素受體作為雌激素促生長效應(yīng)之必要中介，其在乳腺癌細(xì)胞的生長過程中也發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，因此雌激素受體對于乳腺癌的早期篩查以及治療效果評測也發(fā)揮著重要的作用[28]。

現(xiàn)代社會的我們的確沒有那么多的閑暇時間。但前有古人曰：“讀書有‘三余’——冬者歲之余，夜者日之余，陰雨者晴之余?！焙笥恤斞父醒裕骸皶r間就像海綿里的水，只要愿擠，總還是有的?！彼麄兌几嬖V了我們合理安排時間的重要性，而讀書就更要抓緊一切閑余時間。陸瓏也曾說過：“欲速是讀書第一大病，功夫在于綿密不間斷，不在速也?！币虼丝磿鴷r速度要適中，對其內(nèi)容細(xì)細(xì)品味，只有這樣讀書，才會讓人在書的世界里流連忘返、受益匪淺。

3 E2殘留檢測分析技術(shù)

3.1 儀器分析法

李荔等[20]通過計量學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，目前國外病恥感研究主要涉及以下三類疾病：第一類為嚴(yán)重、有傳染性的疾病，如艾滋病、慢性肝炎等；第二類為影響外貌及生理相關(guān)的疾病，如精神分裂癥、癲癇、肥胖等；第三類為不道德或自愿行為引發(fā)的疾病，如肺癌、人工流產(chǎn)等。帕金森病在此分類中屬于第二類。目前國外關(guān)于帕金森病伴發(fā)焦慮、抑郁狀態(tài)或其他心理障礙等已成為臨床關(guān)注的熱點。但就帕金森病患者病恥感研究較少，只有少量對金森病患者病恥感的質(zhì)性研究，缺乏量性研究。

3.1.1 高效液相色譜法

JIANG等[31]所改進(jìn)的HPLC體系中，以丙烯酸為單體熱聚合并與乙二醇甲基丙烯酸酯交聯(lián)形成非共價的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers,MIPs)作為固相吸附劑，以E2作為 MIP的模板分子，利用優(yōu)化的分子印跡固相萃取(MISPE)從魚蝦組織中提取E2。其表現(xiàn)出對E2的高度選擇性，在對魚蝦組織中的E2檢測時，加標(biāo)回收率高達(dá)84%±6.53%，因能消除基質(zhì)的干擾，比傳統(tǒng)固相萃取高出60%左右，檢測限(LOD)可達(dá)0.023 mg/L，定量限(LOQ)相當(dāng)于0.076 mg/L，線性檢測范圍在0.01～2.0 mg/L。HU等同樣以E2作為MIP模板，結(jié)合固相微萃取應(yīng)用HPLC檢測水產(chǎn)品中的E2，檢出限范圍為0.9～2.39 μg/L，對魚類的加標(biāo)回收率達(dá)80.0%～83.6%，對蝦類的回收率達(dá)85.0%～94.1%[32]。

3.1.2 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜作為柱色譜法則是以惰性氣體為流動相，以具有一定活性并且表面積大的吸附劑作為固定相，依據(jù)對混合物中各組分的吸附力不同而達(dá)到分離的目的，由于樣品在氣相中傳遞速度快，另外可選做吸附劑的物質(zhì)較多，因此是一種快速分析和高效分離的分析方法。

質(zhì)譜儀(MS)是稱量離子的“天平”，以分析離子電荷-質(zhì)量比達(dá)到鑒定物質(zhì)的目的，操作時使試樣中各組分在離子源處電離形成帶正電荷的離子，經(jīng)電場加速形成電子束，再經(jīng)由質(zhì)量分析器得到質(zhì)譜圖，進(jìn)而通過庫檢索定性定量，如今的質(zhì)譜技術(shù)已具有相當(dāng)?shù)母哽`敏度掃描和非目標(biāo)篩選。

在GC-MS中，試樣經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)入質(zhì)譜儀，再經(jīng)過質(zhì)量分析器、檢測器后，即成為質(zhì)譜儀號輸入計算機。色譜的分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集卻是同時進(jìn)行的，因其樣品用量少，分離和鑒定可同時進(jìn)行，加上具有高分辨率、高準(zhǔn)確度、高靈敏度和較寬的動態(tài)范圍而被廣泛應(yīng)用，現(xiàn)一般用于最后檢測的確證。國標(biāo)GB/T 22967—2008中使用氣相色譜-負(fù)化學(xué)電離質(zhì)譜法測定牛奶和奶粉中雌二醇?xì)埩袅?，牛奶中檢出限達(dá)0.25 μg/kg，奶粉中為2 μg/kg[33]。ZOU等[34]在用GC-MS測定魚蝦組織中E2時，固相萃取清理后，線性檢測范圍為0.005～0.25 μg/mL，加標(biāo)回收率在68.5%～100.1%之間，LOD達(dá)0.2 μg/kg。

近年來不斷通過研發(fā)使用不同的MIP作為色譜儀的固相萃取吸附劑(solid phase extraction.SPE)，來提高SPE的選擇性與凈化水平，從而增強檢驗的準(zhǔn)確性、靈敏度與精密度。如DU等建立了一種基于虛擬模板MIP的LC-MS分析法，對豬肉中的瘦肉精進(jìn)行了選擇性分析，檢測限可達(dá)0.02 mg/kg[35]。YANG等采用一種新型的分子印跡聚合物作為LC-GC/MS的SPE取代傳統(tǒng)的固相萃取柱(Oasis HLB)來提取飲料和罐頭中的雙酚A類似物，該方法在飲料中的定量限范圍在2～150 ng/L，檢測罐頭時的定量限為0.03～1.5 mg/kg[36]。MIP曾使用多種納米材料作為表面涂料，包括二氧化硅納米粒子、量子點和磁性納米粒子，DU等使用乙烯化多壁碳納米管作為GC/MC MIP-SPE的表面涂料，測定飲料中的鄰苯二甲酸酯時檢測限達(dá)2.3 ng/L[37]。

這種MIP獨特的高效選擇性分析以及相應(yīng)的靈活性，應(yīng)用于HPLC、GC-MS或是LC-MS時可用于測定復(fù)雜樣品基質(zhì)，對于檢測E2是一種強大的助力，JIANG[31]和HU[32]都是把E2作為MIP模板模擬生物識別，再結(jié)合固相微萃取進(jìn)行HPLC檢測。然而每種方法都具有一定的局限性，由于MIP結(jié)構(gòu)和形狀的兼容性，得到的固相微萃取纖維對E2結(jié)構(gòu)類似物也表現(xiàn)出一定的選擇性。

3.2 生物分析法

3.2.1 重組基因酵母篩檢法

有報道稱西方飲食中食源性雌激素有60%～70%來源于牛奶和乳制品，而牛奶中75%都是來自于妊娠奶?！，F(xiàn)代奶牛生產(chǎn)中多是用的改良奶牛，改良奶牛在分娩3個月后就可以利用人工授精來替代漫長的自然交配過程，整個懷孕期間會持續(xù)泌乳，妊娠中后期雌激素含量比平常血清中的含量更高，血液循環(huán)中E2通過血-乳屏障進(jìn)入乳腺，使得E2在乳腺中的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外周循環(huán)系統(tǒng)中的濃度，進(jìn)而造成牛奶中E2含量相應(yīng)升高[6]。因此市售牛奶相比于傳統(tǒng)牛奶相應(yīng)雌二醇的含量勢必會發(fā)生改變。盡管商業(yè)化牛奶在銷售前都會經(jīng)過均一化作用和巴氏滅菌法處理，但這樣的處理方式不能徹底滅活E2這類激素[7]。周虹等對現(xiàn)代改良奶牛與傳統(tǒng)蒙古黃牛的牛奶研究對比中發(fā)現(xiàn)[8]，盡管市售牛奶中E2含量是傳統(tǒng)黃牛奶中E2含量的1.5倍，雌酮含量是傳統(tǒng)黃牛奶的80倍，但由于奶牛在品種、飼養(yǎng)方式和受孕方式及產(chǎn)奶量的差異，牛奶中含有一定量的雌激素具有一定合理性，不能就此否定牛奶的營養(yǎng)價值。

一連十多天下來，喬振宇對我仍舊不冷不熱的態(tài)度，我問三句他答一聲，他份內(nèi)的家務(wù)活相繼鬧罷工，我們不再像從前那樣打鬧拌嘴嘻嘻哈哈，而像是不得已同住一個屋檐下的“拼居客”。

3.2.2 人乳腺癌細(xì)胞增殖實驗

人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)含有許多雌激素調(diào)節(jié)基因，當(dāng)受試物接種于不含有血源性雌激素的培養(yǎng)基中，外界的刺激可使MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)蛋白，這種相關(guān)蛋白的表達(dá)可評價樣品的雌激素活性[41]。OKUBO等[42]以雌激素受體依賴型MCF-7細(xì)胞增殖試驗檢測了20種用于殺蟲劑或除草劑的農(nóng)藥的雌激素活性，其中以30 pmol/L E2作為參考系刺激MCF-7細(xì)胞增殖，并添加100 nmol/L的雌激素拮抗劑作為增殖阻斷劑；LEE等[43]在為絕經(jīng)期婦女尋找雌激素替代療法時就以MCF-7細(xì)胞增殖試驗來檢測野生植物中雌激素的活性，同樣以100 nmol/L的雌激素拮抗劑做阻斷，研究顯示能刺激MCF-7細(xì)胞增殖的E2濃度為10 μg/mL。由于MCF-7細(xì)胞及培養(yǎng)基中的血清均來自人體，其結(jié)果可以排除由動物實驗外推到人的不確定性，結(jié)果可信度較高，方法簡單快速，適用于大規(guī)模篩選。然而細(xì)胞培養(yǎng)成本過高且對實驗條件要求也較高，同時受許多因素的影響，如不同細(xì)胞株的敏感程度、培養(yǎng)條件等都會導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)差異[44]。

3.3 免疫分析法

免疫學(xué)分析法是利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)特性的分析方法，主要包括RIA和目前檢測肉品及乳品中獸藥殘留的免疫學(xué)檢測方法中應(yīng)用最多的酶聯(lián)免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。

3.3.1 放射免疫分析法

RIA是利用同位素標(biāo)記抗原與樣品中待檢測的物質(zhì)，同相對應(yīng)的抗體發(fā)生競爭性抑制反應(yīng)，從而達(dá)到檢測目的的痕量檢測方法。RIA同時具有免疫反應(yīng)的高特異性和放射性測量的高靈敏度，應(yīng)用范圍廣范。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前至少已有300多種生物活性物質(zhì)建立了RIA，幾乎可應(yīng)用于所有激素的分析(包括多肽類和固醇類激素)，同時也用于病毒抗原、腫瘤抗原、細(xì)菌抗原等各種蛋白質(zhì)和藥物的分析，其應(yīng)用范圍還在不斷擴(kuò)展。早年WOLFORD等[45]運用RIA檢測商業(yè)化牛奶中E2的濃度能達(dá)到6.4 pg/mL。然而RIA用到的放射性試劑對人體有害，樣品處理過程中會帶來一系列的問題隱患，加上其穩(wěn)定性受多種因素影響，需要有一整套質(zhì)量控制措施來確保結(jié)果的可靠性，在獸藥殘留分析檢測領(lǐng)域已逐漸被ELISA所替代。PAPE-ZAMBITO D等現(xiàn)以RIA檢測法檢測到商品牛奶中E2的平均含量在0.4～1.1 pg/mL[7]。

3.3.2 酶聯(lián)免疫分析法

ELISA是把酶的高效催化作用和抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性有機結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)，操作簡便、靈敏度高、特異性強，適合大量樣品的篩選。將抗原或抗體吸附于固相載體上進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色后用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，可同時進(jìn)行大批量樣品檢測，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測分析的快速篩選。周虹等以市場現(xiàn)有ELISA試劑盒檢測了3種品牌的市售牛奶，測得E2平均濃度在24.6 pg/ml[8]。WANG等[46]以ELISA檢測牛奶中的紅霉素，從制作紅霉素半抗原開始，一步步從免疫到制備單克隆抗體，最后建立完整的紅霉素檢測體系，與制備E2ELISA檢測試劑盒異曲同工，因此若市場需要完全可以制備靈敏度更高的試劑盒來應(yīng)用市場。

胡蘿卜中含有大量的β-胡蘿卜素，攝入人體消化器官后，可以轉(zhuǎn)化成維生素A，是目前最安全補充維生素A的產(chǎn)品 (單純補充化學(xué)合成維生素A，過量時會使人中毒)。它可以維持眼睛和皮膚的健康，改善夜盲癥、皮膚粗糙的狀況，有助于身體免受自由基的傷害。不宜與醋等酸性物質(zhì)同時服用。

3.4 熒光適配體分析法

適配體-熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是利用核酸適配體特異的分子識別功能，以及特定熒光基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移建立的一種高靈敏度、高選擇性的光譜方法。

核酸適配體主要應(yīng)用單鏈寡核苷酸片段，以其莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)使核酸分子形成多種三維結(jié)構(gòu)，由于其容易制備及修飾，穩(wěn)定性高，與一些小分子靶物質(zhì)以及DNA、RNA、蛋白質(zhì)等特異性結(jié)合力強，親和力高，常被用于制作各種適配體傳感器。在FRET法中，由于供體基團(tuán)的熒光發(fā)射譜與受體基團(tuán)的吸收光譜有一定重合，當(dāng)距離合適時便可觀察到供體熒光猝滅和受體熒光增強。

蔣曉華等[47]以雌二醇適配體作為供受體之間的連結(jié)媒介，供受體是能與適配體堿基互補配對的兩條互補鏈，當(dāng)適配體檢測到E2時，由于高選擇性，適配體與E2優(yōu)先結(jié)合，而原先發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移的供受體重新游離，使得供體重新發(fā)出熒光，基于此特性建立高靈敏度的E2檢測方式，其線性范圍在1.0×10-11～5.0×10-9mol/L，對人尿液中E2的LOD可達(dá)6×10-12mol/L。

4 結(jié)論與展望

E2是乳腺癌等雌激素依賴性癌癥疾病的重要致癌風(fēng)險因素，食源性E2在動物源食品中的殘留關(guān)乎人類的健康和生存發(fā)展，對動物源食品中的E2進(jìn)行殘留監(jiān)控是一個復(fù)雜的系統(tǒng)工程，其中檢測技術(shù)起著舉足輕重的作用，是“管出來”的重要技術(shù)支撐。當(dāng)前在動物源食品安全檢測領(lǐng)域，一般采用的 “快速篩選+定量確證”的檢測模式，即針對大批量樣本首先采用免疫分析進(jìn)行快速篩選，疑似陽性樣本采用儀器分析方法進(jìn)行確證。這種檢測模式高效、經(jīng)濟(jì)、快速，是全世界通用的動物源食品安全監(jiān)控模式。我國已經(jīng)發(fā)布了多個動物性食品E2殘留的國家(行業(yè))檢測標(biāo)準(zhǔn)，如GB 29698—2013以GC-MS作為奶及奶制品中E2殘留量測定的檢測標(biāo)準(zhǔn)[48]，農(nóng)業(yè)部958號公告10—2007中GC-MS法對水產(chǎn)品中E2殘留量的測定[49]；進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN 0664—1997中以RIA對出口肉及肉制品中雌二醇?xì)埩袅康臋z測等[50]，基本滿足了定量確證檢測技術(shù)的需求，再加上新型技術(shù)MIP這類萃取技術(shù)的不斷應(yīng)用與更新，使確證檢測技術(shù)靈敏度與高效性不斷強化。當(dāng)前我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)分散經(jīng)營依然占有較大比重，動物源食品生產(chǎn)、加工主體80%以上是小微企業(yè)，定量確證技術(shù)需要大型分析儀器和熟練的技術(shù)人員，難以滿足大量樣本快速檢測的要求，同時由于動物源食品的鮮活特性，其檢測的關(guān)口主要在屠宰場、超市、農(nóng)貿(mào)市場、鮮奶收購站和進(jìn)出口岸等，往往需要實時、現(xiàn)場檢測。2015年修訂的《食品安全法》明確要求食品安全監(jiān)控要延伸到鄉(xiāng)鎮(zhèn)一級。隨著國家、社會和消費者對食品安全監(jiān)管的要求日益提高，樣品抽檢比例必然增大(當(dāng)前不到1%)，需要檢測樣本數(shù)量將大幅增加，這就要求在未來的E2監(jiān)控中，需要面對大量、痕量污染的樣品，因此與發(fā)達(dá)國家相比，我國對快速檢測具有特殊的需求，發(fā)展檢測速度快、檢測靈敏度高和檢測準(zhǔn)確的快速檢測技術(shù)是E2殘留檢測的重點研究方向。

由表3可知，四個維度之間均呈現(xiàn)中度正相關(guān)，除了對學(xué)習(xí)效果滿意度維度外，其他3個維度均存在非常顯著意義(P<0.01).說明本量表各維度間所測量的心理特質(zhì)相對獨立，也說明本量表具有良好的結(jié)構(gòu)信度.

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Researchprogressonriskanddetectiontechnologyofestradiolresiduesinfood

BAI Yu1,HU Jing-yan1,ZHANG Jing2*

1(Wenzhou Vocational College of Science and Technology,College of Animal Science,Wenzhou 325006,China) 2(Wenzhou Academy of Agricultural Sciences,The Ministry of Agriculture of Agricultural Products Quality Safety Risk Assessment Laboratory,Wenzhou 325006,China)

As a female sex hormone,estradiol (E2) is a most important form of estrogen in humans and animals,it triggers the reproductive system development during the puberty,which is involved in a number of physiological processes,including development of the female reproductive structures and secondary sexual characteristics.E2is a typical natural estrogen used extensively in livestock for promotion of their growth.It is now widely exist in the environment and caught many attention by scientists due to the biological estrogen effects which can cause carcinogenicity.Therefore,in order to ensure food safety and human physiological health,it has very important to monitor and control the estradiol residues in food source and improve detection technology.The main residual sources,hazard analysis and detection techniques of food source E2were discussed in order to provide a reference for E2biological activity research and convenient and effective detection techniques establishment.

estradiol; residual risks; potential carcinogenicity; detection techniques

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014216

博士，助理研究員(張井為通訊作者，E-mail：zhgjing2008@qq.com)。

浙江省科技廳公益性項目(2014C32046、2017C37087)；溫州市科技局公益性項目(S20150026、N20140042)

2017-03-05，改回日期：2017-05-17