筍殼醋酸木質(zhì)素對葡萄糖透析延遲指數(shù)、發(fā)酵特性及酶活力的影響

龔衛(wèi)華，向卓亞，葉發(fā)銀，趙國華,3*，彭英

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(吉首大學 師范學院，湖南 吉首，416000) 3(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715) 4(長沙一加一生物科技有限公司，湖南 長沙，410000)

筍殼醋酸木質(zhì)素對葡萄糖透析延遲指數(shù)、發(fā)酵特性及酶活力的影響

龔衛(wèi)華1,2，向卓亞1，葉發(fā)銀1，趙國華1,3*，彭英4

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(吉首大學 師范學院，湖南 吉首，416000) 3(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715) 4(長沙一加一生物科技有限公司，湖南 長沙，410000)

采用醋酸法提取麻竹筍筍殼中木質(zhì)素，對其在葡萄糖透析延遲指數(shù)(glucose dialysis retardation index,GDRI)、發(fā)酵特性及對酶活力的影響等方面進行分析，并與相同來源的纖維殘渣和粗膳食纖維進行對比研究。研究結(jié)果表明，醋酸木質(zhì)素GDRI能力相對較低；但能降低發(fā)酵液中的pH值，增加發(fā)酵液中短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)的含量，增強發(fā)酵特性；在酶活性方面，醋酸木質(zhì)素對α-淀粉酶具有激活作用，可作為淀粉酶的激活劑，但對脂肪酶的活性影響不明顯。因此，木質(zhì)素對筍殼膳食纖維在發(fā)酵特性和對α-淀粉酶活性影響方面具有積極作用。

木質(zhì)素；膳食纖維；葡萄糖透析延遲指數(shù)；發(fā)酵特性；酶活力

膳食纖維作為人類的“第七大營養(yǎng)素”，其生物學活性受到越來越多的關注[1-2]。但膳食纖維的生物活性與其來源及組成成分有關。木質(zhì)素作為膳食纖維中非水溶性膳食纖維的主要成分，對膳食纖維的生物活性具有重要貢獻。

膳食纖維具有降低餐后血糖的功能，而葡萄糖透析延遲指數(shù)(glucose dialysis retardation index,GDRI)是一個有效反映葡萄糖在胃腸道被延遲吸收的體外指標[3]。因此本研究采用GDRI來考察木質(zhì)素對葡萄糖吸收的影響。

腸道菌群是一類寄生在人體腸道中的正常的微生物，在許多代謝性疾病如糖尿病、肥胖癥中扮演越來越重要的角色[4]。而影響腸道菌群的組成和其代謝產(chǎn)物的主要因素是膳食[5]。有研究表明，膳食纖維的攝入量提高，可促進腸道益生菌的生長，進而產(chǎn)生較多的短鏈脂肪酸，降低腸道pH值，有利于降低代謝性疾病的風險[6]，但多集中在水溶性膳食纖維對發(fā)酵特性的研究方面，對于非水溶性膳食纖維木質(zhì)素對發(fā)酵特性的影響，相關的研究還比較少見。本研究以醋酸木質(zhì)素、纖維殘渣和粗膳食纖維為底物，接種人體糞便進行體外發(fā)酵，測定發(fā)酵液中的pH值及短鏈脂肪酸的量，來探討醋酸木質(zhì)素對體外發(fā)酵的影響。

α-淀粉酶和脂肪酶是人體中主要消化酶，對淀粉和脂肪的水解起重要作用，對人體的健康非常有益[7-8]。本研究探討了醋酸木質(zhì)素、纖維殘渣和粗膳食纖維對α-淀粉酶和胰脂肪酶活性的影響，進一步了解木質(zhì)素在人體消化過程中作用；分析了醋酸木質(zhì)素對葡萄糖透析延遲指數(shù)(GDRI)、發(fā)酵特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻竹筍筍殼，采于重慶市北碚區(qū)竹林；α-淀粉酶、脂肪酶,美國Sigma公司；牛血清白蛋白，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS-26數(shù)顯恒溫水浴鍋，DHG-9140電熱恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；722可見光分光光度計，北京金科利達電子科技有限公司；GC-2010氣相色譜儀，日本島津公司；LGJ-10冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；L535-1低速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 粗膳食纖維的提取

將麻竹筍筍殼清洗除雜、自然干燥、剪碎，置于烘箱中55 ℃干燥12 h，粉碎取40～60目樣品。然后以純水在液料比10∶1(mL∶g)，95 ℃水浴條件下浸提2 h(以除掉色素、淀粉和蛋白等可溶性成分，斷裂部分木質(zhì)素與纖維素和半纖維的連接鍵，有利于醋酸對木質(zhì)素的提取)，過濾，濾渣55 ℃烘干備用，既得粗膳食纖維粉[5]。

1.3.2 木質(zhì)素和纖維素殘渣的提取

稱取一定量粗膳食纖維粉，按照液料比20∶1(mL∶g)加入87%醋酸溶液，并添加6%的HCl作為催化劑，在114 ℃油浴條件下反應80 min后，真空抽濾，濾渣用同體積分數(shù)的醋酸沖洗，并用純水沖至中性，濾渣冷凍干燥既得纖維素殘渣。濾液減壓濃縮至50 mL，濃縮液逐滴加入500 mL的純水中沉淀，離心分離，用pH 2的酸水(0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值)溶液沖洗3 次，冷凍干燥，得筍殼醋酸木質(zhì)素[9]。

1.3.3 葡萄糖透析延遲指數(shù)的測定[10]

準確稱取400 mg樣品(醋酸木質(zhì)素、纖維殘渣和粗膳食纖維)粉末，30 mg 葡萄糖加入到15 mL的純水中，連續(xù)攪拌1 h，混合樣品被轉(zhuǎn)到透析袋中，同時還準備空白對照樣(加葡萄糖，不加粉末樣品)，樣品對照樣(加入粉末樣品，不加葡萄糖)，將透析袋放入500 mL燒杯中，37 ℃恒溫振蕩60 min，每10 min 吸取葡萄糖透析液1 mL，測定葡萄糖的質(zhì)量濃度，采用蒽酮比色法測定葡萄糖的含量，620 nm 處測定吸光度，標準曲線為：y=0.007x+0.020，R2=0.994，x為葡萄糖質(zhì)量濃度，y為吸光度，按公式(1)計算葡萄糖透析延遲指數(shù)(GDRI)：

(1)

式中：C為樣品溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度；Cd為樣品對照的葡萄糖質(zhì)量濃度；C0為空白對照的葡萄糖質(zhì)量濃度。單位均為μg/mL。

1.3.4 體外發(fā)酵特性

1.3.4.1 體外發(fā)酵方法

(1)體外發(fā)酵緩沖液制備：按文獻[5]方法配制體外發(fā)酵緩沖溶液，其配方見表1。使用前將發(fā)酵緩沖液與微量元素溶液按100∶1比例混合備用。

表1 體外發(fā)酵緩沖溶液的組成Table 1 Composition of the buffer solution in vitro fermentations

(2)人體腸道菌群發(fā)酵液制備：所選的志愿者要求日常攝食正常，無消化系統(tǒng)疾病，3個月以上的時間未服用或注射抗生素。取1 000 mL的燒杯1個，置于烘箱中保持溫熱(45 ℃)。將1個志愿者的新鮮糞便收集到燒杯中，馬上充CO2氣體并密封稱重，向燒杯中加入37 ℃體外發(fā)酵緩沖液[比例為1∶5(g∶mL)]，充分攪勻，并不斷向燒杯中吹CO2氣體，用4層紗布過濾，濾液即為腸道菌群發(fā)酵液。

(3)底物的發(fā)酵[6]：試驗分為4組，分別是空白對照組、醋酸木質(zhì)素組、纖維殘渣組和粗膳食纖維組。每組8個50 mL離心管。準確稱取100 mg(精確至0.001 g)相應的粉末樣品置于離心管中作為微生物發(fā)酵底物，加入10 mL腸道菌群發(fā)酵液，馬上吹入CO2氣體以保持無氧環(huán)境，立刻密封?；旌暇鶆蚝笤?7 ℃厭氧條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0，6，12，24 h。按設定時間取出離心管，測定發(fā)酵液的pH值，然后離心(4 000 r/min，20 min)，吸取1 mL上清液置于5 mL離心管中，并加入2 mL 2-乙基丁酸內(nèi)標溶液(1.99 mmol/L)，過0.25 μL的濾膜，濾液用于氣相色譜分析。

1.3.4.2 短鏈脂肪酸的氣相色譜測定[11]

配制不同濃度的乙酸、丙酸、丁酸標準溶液，上氣相色譜儀，得標準曲線。乙酸的標準曲線方程為：y=5.17×10-6x+2.596，R2=0.999，丙酸的標準曲線方程為：y=2.46×10-6x+0.834，R2=0.998，丁酸的標準曲線方程為：y=2.96×10-6x+0.647，R2=0.999。

GC條件：色譜柱型號：DB-FFAP125型毛細管柱(30 m×0.53 mm×0.5 μm)；載氣，N2；載氣流量，14.4 mL/min；升溫過程：初始溫度100 ℃，保持0.5 min，以8 ℃/min升溫至180 ℃，保留1 min，再以20 ℃/min升溫至200 ℃，保留5 min。進樣口溫度和檢測器溫度分別為200 ℃和250 ℃，空氣、氮氣和氫氣流速分別為300 、20 和30 mL/min。進樣量為1 μL，分析時間為17.5 min。

1.3.5 對酶活性的影響

1.3.5.1 對α-淀粉酶活性的影響

參考相關文獻方法[7，12]。準確稱取不同質(zhì)量的樣品粉末，加入20 mmol/L pH 6.9的磷酸緩沖溶液0.5 mL，再加入0.75 mL 1 U/mL 的α-淀粉酶溶液(20 mmol/L pH 6.9 的PBS配制)，混勻，37 ℃水浴保溫10 min，取出，加入0.75 mL 0.25% 淀粉溶液(20 mmol/L pH 6.9 的PBS配制)，37 ℃水浴中準確反應5 min，最后加入1.5 mL DNS 終止反應，沸水浴5 min，冷卻到室溫，540 nm處測定吸光度(As)。同時測定空白對照(不加樣品粉末)的吸光度(Ab)和樣品對照的(用0.75 mL的PBS代替α-淀粉酶)吸光度(Ad)，通過以下公式計算對酶活的促進率：

(2)

1.3.5.2 對脂肪酶活性的影響

脂肪酶的活性通過脂肪酶水解對硝基苯基月桂酸酯來實現(xiàn)的[8]。底物溶液的配制：采用50 mmol/L pH 5.0醋酸鈉緩沖溶液配制0.8 g/L硝基苯基月桂酸酯溶液，且溶液含有1%的曲通100，沸水浴1 min，冷卻到室溫，得到底物溶液。脂肪酶溶解在Tris-HCl(100 mmol/L，pH 8.2)的緩沖溶液中，混勻后4 000 r/min離心15 min，上清液即為脂肪酶溶液。

準確稱取不同量的樣品粉末，加入4 mL Tris-HCl (100 mmol/L，pH 8.2)的緩沖溶液，再加入4 mL底物溶液和2 mL脂肪酶溶液，混合均勻，37 ℃水浴反應20 min，然后沸水浴10 min 來終止反應，混合樣品4 000 r/min離心15 min，上清液于405 nm處測定吸光度，按式2計算促進率。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每個樣品重復測定3次，結(jié)果均表示為(平均值±標準偏差)。方差分析(SPSS 19.0，SPSS Inc.,USA)采用Duncan檢驗進行分析，p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖透析延遲指數(shù)的測定

葡萄糖透析延遲指數(shù)(GDRI)是一個很好的反應葡萄糖在胃腸道被延遲吸收的體外指標。當葡萄糖在胃腸道被延遲吸收，可降低血液中的血糖含量，而葡萄糖在腸道中可被高效發(fā)酵，產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸從而降低腸道pH值，抵抗感染，對人體的健康有益[10]。如圖1所示，纖維殘渣的GDRI要明顯高于醋酸木質(zhì)素和粗膳食纖維，而醋酸木質(zhì)素和粗膳食纖維對葡萄糖延遲的作用較相似，這可能與樣品外部結(jié)構(gòu)，如比表面積有關，醋酸木質(zhì)素(2.085 m2/g)和粗膳食纖維(1.405 m2/g)都要比纖維殘渣(3.307 m2/g)低，而醋酸木質(zhì)素和粗膳食纖維的比表面積相似，數(shù)據(jù)見參考文獻[13]。

圖1 醋酸木質(zhì)素、纖維殘渣和粗膳食纖維的葡萄糖透析延遲指數(shù)與時間的關系圖(不同小寫字母表示同一線條的數(shù)據(jù)之間差異顯著)Fig.1 The relationship GDRI and dialysis time of lignin,cellulose residues and coarse dietary fiber

有研究表明，GDRI與樣品中的水溶性膳食纖維含量及水不溶性膳食纖維中的糠醛酸含量相關[14]，也有其他研究者認為與樣品的內(nèi)在結(jié)構(gòu)和樣品的表面特性有一定的相關[15]。本論文中的醋酸木質(zhì)素的GDRI要明顯低于從橄欖核中提取纖維GDRI(22%～29%)[14]、芒果皮中纖維的GDRI(21%)[16]和楊桃果渣纖維的GDRI(25%)[17]，而與麥麩中纖維的GDRI(5.3%)[18]的結(jié)果相似。這可能與樣品的來源及內(nèi)在結(jié)構(gòu)有一定相關。

2.2 發(fā)酵性能的影響

2.2.1 發(fā)酵液中pH值的變化

有研究認為，膳食纖維增加了腸道糖酵解的底物濃度，促進SCFAs的產(chǎn)生，從而降低了腸道內(nèi)的pH值；而腸道酸性環(huán)境有利于腸黏膜保持完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并促進黏膜細胞的增殖，有利于腸道健康[5]。醋酸木質(zhì)素、纖維殘渣和粗膳食纖維對發(fā)酵液中pH值的影響見圖2。

圖2 醋酸木質(zhì)素、纖維殘渣和粗膳食纖維對體外發(fā)酵液中pH的影響 (不同小寫字母表示同時間段數(shù)據(jù)之間差異顯著，下同)Fig.2 Effect on pH of lignin,cellulose residue and coarse dietary fiber in vitro fermentation liquid

在0 h時，醋酸木質(zhì)素的pH值與其他組分相比最低，可能是因為木質(zhì)素的本身帶有的酸性，給pH值的變化帶來的影響，而其他2種樣品粉末與空白相比變化不大?？瞻讓φ铡⒗w維殘渣、粗膳食纖維和醋酸木質(zhì)素在6 h時的pH值之間無顯著性差異，但空白對照、纖維殘渣和粗膳食纖維在6 h時pH值達最低點。醋酸木質(zhì)素的pH值在12 h時達到最低，顯著低于其他纖維殘渣、粗膳食纖維和空白組pH值，說明醋酸木質(zhì)素有助提高體外發(fā)酵的性能，延長發(fā)酵的時間，在12 h時發(fā)酵完全。但在24 h 時4組樣品pH值又呈上升趨勢，可能是因為發(fā)酵底物耗盡的緣故。

2.2.2 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的變化

短鏈脂肪酸是非消化性碳水化合物在結(jié)腸厭氧菌群作用下的發(fā)酵產(chǎn)物，不同碳鏈長度的短鏈脂肪酸(C2～C6)產(chǎn)生的數(shù)量取決于膳食和腸道微生物[19]。

醋酸木質(zhì)素、纖維殘渣和粗膳食纖維對發(fā)酵液中短鏈脂肪酸濃度的影響見圖3～圖5。

圖3 醋酸木質(zhì)素、纖維殘渣和膳食纖維對體外發(fā)酵乙酸的影響Fig.3 Effect on acetic acid of lignin,cellulose residue and coarse dietary fiber in vitro fermentation liquid

圖4 醋酸木質(zhì)素、纖維殘渣和粗膳食纖維對體外發(fā)酵丙酸的影響Fig.4 Effect on propionic acid of lignin,cellulose residue and coarse dietary fiber in vitro fermentation liquid

圖5 醋酸木質(zhì)素、纖維殘渣和粗膳食纖維對體外發(fā)酵丁酸的影響Fig.5 Effect on butynic acid of lignin,fiber residue and coarse dietary fiber in vitro fermentation

醋酸木質(zhì)素對發(fā)酵液中乙酸的產(chǎn)生在開始的6 h有一定的抑制，但是6～12 h 的過程中顯著提高了乙酸的產(chǎn)量，與pH變化趨勢一致，可能在開始階段醋酸木質(zhì)素本身的酸性會對腸道菌群有一定的影響，因此產(chǎn)生了一定抑制作用，但是隨著時間的推移，木質(zhì)素與腸道菌群充分接觸，有助于乙酸的產(chǎn)生，在12 h時乙酸生成量達到最大。而纖維殘渣對乙酸的生成有一定的抑制作用，從0～24 h乙酸的產(chǎn)生的量都低于空白對照組，這可能與纖維殘渣的組成和結(jié)構(gòu)，以及糞便中的微生物組成相關，有研究表明不同糞便的貢獻者對短鏈脂肪酸的產(chǎn)生有不同的影響[20]。粗膳食纖維在6 h以后對乙酸的產(chǎn)生有一定促進作用，顯著高于空白對照組，與鄭等[4]研究的結(jié)果一致。醋酸木質(zhì)素對發(fā)酵液中丙酸和丁酸產(chǎn)量的影響與乙酸一致，12 h時丙酸和丁酸的產(chǎn)量最大，顯著高于纖維殘渣、粗膳食纖維和空白對照。說明醋酸木質(zhì)素對整個發(fā)酵過程中的3種短鏈脂肪酸產(chǎn)生都有促進作用。這與DRZIKOVA等[20]研究的結(jié)果相似，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)麥麩擠壓物發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸要高于燕麥粉擠壓物產(chǎn)生的相應短鏈脂肪酸的量，而麥麩中含有更多在非水溶性膳食纖維和更少在水溶性膳食纖維。纖維殘渣和粗膳食纖維對發(fā)酵液中丙酸產(chǎn)生，在12 h以后有一定的促進作用。而對于發(fā)酵液中的丁酸，粗膳食纖維對其產(chǎn)生沒有明顯的影響作用，纖維殘渣卻有一定的抑制作用。這也說明在膳食纖維發(fā)酵過程中，非水溶性膳食纖維木質(zhì)素起到的作用要強于非水溶性膳食纖維纖維素。整體來說，發(fā)酵液中產(chǎn)生的乙酸的量要高于丙酸和丁酸，與前人的研究結(jié)果一致[4,18]。雖然3種脂肪酸的作用各不相同，但它們可以一起發(fā)揮作用降低腸道的pH值，從而預防有害細菌的生長。特別是丁酸，提供了結(jié)腸上皮細胞70%的能量來源，也有研究表明丁酸具有預防結(jié)腸癌的作用[4]。因此木質(zhì)素在膳食纖維發(fā)酵特性中起積極的促進作用。

2.3 對酶活性的影響

2.3.1 對α-淀粉酶活性的影響

醋酸木質(zhì)素、纖維殘渣和粗膳食纖維對α-淀粉酶活性的影響見圖6。醋酸木質(zhì)素對α-淀粉酶活性的促進率顯著高于纖維殘渣和粗膳食纖維，而且促進率隨醋酸木質(zhì)素濃度的增加而增大。醋酸木質(zhì)素對α-淀粉酶活性影響的數(shù)據(jù)及相關原理見參考文獻[12]，纖維殘渣對α-淀粉酶活性的影響不明顯，并稍微有一定的抑制效果。粗膳食纖維對α-淀粉酶活性具有一定的促進作用，當濃度為3 mg/mL時，其促進率為50%左右，這可能與粗膳食纖維中木質(zhì)素的含量有關。膳食纖維對酶活性的影響，前人的研究中鮮有報道，因而木質(zhì)素在膳食纖維對α-淀粉酶的活性中起重要作用。

圖6 醋酸木質(zhì)素、纖維殘渣和粗膳食纖維對α-淀粉酶活性的影響(不同小寫字母表示同一線條的數(shù)據(jù)之間差異顯著)Fig.6 Effect on α-amylase activity of lignin,cellulose residue and coarse dietary fiber

2.3.2 對脂肪酶活性的影響

如圖7所示，醋酸木質(zhì)素和粗膳食纖維對脂肪酶活性的影響不明顯，這與ZHANG等[8]報道的木質(zhì)素在一個均相的液體反應體系和使用親水性的底物時，木質(zhì)素對脂肪酶的活性有促進作用結(jié)果不一樣，可能與木質(zhì)素的來源及提取的方法不同有關，而纖維殘渣對脂肪酶的活性有一定的抑制作用，粗膳食纖維對脂肪酶的活性影響不大?？偟膩碚f，在對脂肪酶的活性方面，醋酸木質(zhì)素貢獻作用不明顯。

圖7 木質(zhì)素、纖維殘渣和粗膳食纖維對脂肪酶活性的影響Fig.7 Effect on lipase activity of lignin,cellulose residue and coarse dietary fiber

3 結(jié)論

醋酸木質(zhì)素在延遲葡萄糖透析能力方面的作用不明顯，但能顯著降低接種人腸道菌群的體外發(fā)酵液中的pH值和提高發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的產(chǎn)量，在12 h時，其pH值水平最低，短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)的產(chǎn)量達到最高，說明醋酸木質(zhì)素對筍殼膳食纖維的發(fā)酵作用具有很大的貢獻。對酶活性的影響試驗中，發(fā)現(xiàn)醋酸木質(zhì)素能顯著提高了α-淀粉酶的活性，且隨著醋酸木質(zhì)素濃度的增加，促進率不斷上升；但是醋酸木質(zhì)素對于脂肪酶的活性影響不明顯。

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Effectsofligninfrombambooshootshellontheglucosedialysisretardationindex,fermentationpropertyandenzymeactivity

GONG Wei-hua1,2,XIANG Zhuo-ya1,YE Fa-yin1,ZHAO Guo-hua1,3*,PENG Ying4

1(College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China) 2 (Normal College of Jishou University,Jishou 416000,China) 3 (Chongqing Engineering Research Centre of Regional Foods,Chongqing 400715,China) 4 (Changsha PlusOne Biotechnology Co.,Ltd,Changsha 410000,China)

Lignin was extracted from bamboo (Dendrocalamuslatiforus) shoot shell by acetic acid process.The biological activities of lignin on glucose dialysis retardation index (GDRI),fermentation property and enzyme activity were investigated and compared with the same source of cellulose residues and coarse dietary fiber.The results showed that the GDRI ability of lignin was relatively low,but the fermentation properties were enhanced.The pH value in the fermentation liquid was decreased,the content of short-chain fatty acid (acetic acid,propionic acid and butynic acid) in the fermentation liquid was increased.Since lignin activated α-amylase activity,it can be used as an activator of α-amylase.However,no obvious influence on the lipase activity was found.Therefore,lignin has a positive effect on fermentation properties and α-amylase activity of bamboo shoot shell dietary fiber.

lignin； dietary fiber； glucose dialysis retardation index； fermentation property； enzyme activity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014627

博士，講師(趙國華教授為通訊作者，E-mail：zhaoguohua1971@163.com)。

果蔬典型加工過程中品質(zhì)功能劣變與保質(zhì)減損及其調(diào)控機理(2016YFD0400204-2)

2017-04-26，改回日期：2017-06-03