基于漂洗工藝探究白鰱魚糜加工過程中蛋白質(zhì)氧化規(guī)律

袁凱，張龍，谷東陳，樊震宇，王錫昌*，李鈺金，劉遠(yuǎn)平

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(榮成泰祥食品股份有限公司，山東 威海，264309)

基于漂洗工藝探究白鰱魚糜加工過程中蛋白質(zhì)氧化規(guī)律

袁凱1，張龍1，谷東陳1，樊震宇1，王錫昌1*，李鈺金2，劉遠(yuǎn)平2

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(榮成泰祥食品股份有限公司，山東 威海，264309)

基于工業(yè)化魚糜漂洗工藝，探討白鰱魚糜加工過程中蛋白質(zhì)氧化規(guī)律，進(jìn)而為肉制品加工提供科學(xué)理論依據(jù)。在不同溫度(4、12、20 ℃)，不同漂洗次數(shù)(1、2、3次)下，制備新鮮漂洗白鰱魚糜，測定魚糜羰基，總巰基含量，溶解度，Ca2+-ATPase酶活性，蛋白質(zhì)降解聚集程度，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化，綜合評價(jià)蛋白質(zhì)氧化變性程度。研究結(jié)果表明，魚糜中的羰基含量隨著漂洗溫度升高增大，隨漂洗次數(shù)積累降低；隨漂洗溫度升高和次數(shù)積累，蛋白無序結(jié)構(gòu)的百分含量顯著增加；總巰基含量和β-折疊結(jié)構(gòu)的百分含量逐漸下降；漂洗處理引起肌球蛋白發(fā)生降解反應(yīng)，溫度升高，降解程度加??；蛋白溶解性及Ca2+-ATPase酶活力減?。痪C上分析電泳結(jié)果及二級結(jié)構(gòu)變化規(guī)律可作為氧化變性的良好評價(jià)指標(biāo)，而選擇低溫(4 ℃)少漂洗(1或2次)處理能夠保證魚糜蛋白得率的同時(shí)能夠效控制蛋白氧化程度。

白鰱魚糜；漂洗；蛋白質(zhì)氧化；評價(jià)指標(biāo)

近年來隨著海洋資源衰退，適用于魚糜加工的海水魚種捕獲量下降，為尋求新的魚糜加工原料并發(fā)揮我國豐富淡水魚資源優(yōu)勢，研究淡水魚糜加工并產(chǎn)業(yè)化已成為聚焦的熱點(diǎn)。鰱魚是我國產(chǎn)量豐富的低值淡水魚種之一，僅2015年的年產(chǎn)量達(dá)到440萬t[1]。選用鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)作為魚糜加工原料能有效實(shí)現(xiàn)低值魚高值化，具有巨大的經(jīng)濟(jì)潛力。近年來關(guān)于白鰱魚(鰱魚種)魚糜的研究集中于蛋白的凝膠品質(zhì)及冷凍變性方面，而關(guān)于蛋白氧化變性的研究較少，且多以體外模擬系統(tǒng)的研究為主，在具體加工過程中的蛋白質(zhì)氧化變性規(guī)律研究鮮有報(bào)道。實(shí)際上，蛋白的氧化變性對加工肉制品特別是穩(wěn)定性較差的水產(chǎn)肉品的品質(zhì)具有重要影響作用，探究在具體加工過程中的蛋白質(zhì)氧化變性規(guī)律研究有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。本研究選用淡水魚白鰱作為研究對象，基于工業(yè)化魚糜漂洗工藝制備新鮮淡水魚糜，探討白鰱魚糜加工過程中蛋白質(zhì)氧化規(guī)律，進(jìn)而控制魚糜加工的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鰱魚(鮮活)，購于上海市浦東新區(qū)古棕路農(nóng)工商超市，每條魚身長約50 cm，重約2 kg。購買后立即運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室冷庫中進(jìn)行宰殺，去頭、皮、內(nèi)臟、肌間刺后取背肉備用。

2,4-二硝基苯肼(DNPH)、2-硝基苯甲酸(DTNB)、聚丙烯酰胺(Acr)、Tris、TEMED、十二烷基硫酸鈉(SDS)、ATP鹽酸胍、米吐爾；美國Sigma試劑公司；鉬酸銨、乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、無水甲醇、冰乙酸、三氯乙酸(TCA)、乙酸乙酯等，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；巰基乙醇、標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker(SDS)、上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

節(jié)能型恒溫水浴槽DC-1015，寧波新芝生物科技有限公司；伯樂電泳儀POWERPAC，日本ATTO株式會社；實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)PSB100，蘇州巴托離心機(jī)制造有限公司；冷凍離心機(jī)Avanti J-26XP，美國貝克曼儀器有限公司；多點(diǎn)磁力加熱攪拌器RT10，數(shù)顯勻漿機(jī)T25，德國IKA實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器有限公司，酶標(biāo)分析儀SAF-680T，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；紫外可見分光光度計(jì)UV2300，上海天美科學(xué)儀器有限公司；金屬浴加熱器MINIT-100，杭州奧盛儀器有限公司等；紅外光譜儀及單點(diǎn)ATR附件：Nicolet iS5，美國賽默飛世爾公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白鰱漂洗魚糜制備

稱取新鮮白鰱魚肉200 g，點(diǎn)動絞肉30 s。將攪碎的魚肉裝袋、混勻、冰浴。稱取碎魚肉20 g入置有磁力轉(zhuǎn)子的小燒杯，加入4倍體積且預(yù)先調(diào)溫為4 ℃的超純水80 mL。將其放置在設(shè)定溫度為4 ℃的加熱式磁力攪拌器上，磁力設(shè)置為Mot 5檔。恒溫?cái)嚢?0 min，并靜置1 min。采用雙層紗布過濾漂洗肉(使用離心管收集漂洗液，冰浴保存)，經(jīng)脫水離心機(jī)(仿三足式離心機(jī))對紗布包裹的漂洗肉進(jìn)行脫水，得到一次漂洗魚糜。將紗布過濾的漂洗肉繼續(xù)使用該溫度下超純水漂洗10 min，經(jīng)過濾，離心等步驟依次制備2、3次漂洗魚糜。選用不同漂洗溫度(4、12、20 ℃)與次數(shù)(1、2、3次)制備漂洗白鰱魚糜共9組，記作4-1、4-2、4-3、12-1、12-2、12-3、20-1、20-2、20-3。

1.3.2 魚糜蛋白溶液制作

稱取2 g魚糜，加入15 mL Tri-HCl(20 mmol/L，pH 7.5)緩沖液，10 000 r/min轉(zhuǎn)速下間歇式均質(zhì)1 min，采用單層紗布過濾勻漿液去除大顆粒，雙縮脲法測定勻漿液的蛋白濃度并稀釋，制得蛋白質(zhì)濃度均為5 mg/mL的樣品。

1.3.3 魚糜蛋白羰基含量測定

經(jīng)過漂洗處理，魚肉中脂質(zhì)及水溶性蛋白被去除，所得魚糜的主要組分為肌原纖維蛋白。因此參照OLIVER等[2]測定肌原纖維蛋白中羰基的方法測定魚糜中的羰基含量。

取2.5 mL質(zhì)量濃度約為5 mg/mL 蛋白溶液入預(yù)冷離心管中，分別加入2 mL濃度為10 mmol/L 的2,4-二硝基苯肼(DNPH，2 mol/L HCl配置)，對照組加入2 mol/L HCl。在20℃下，避光反應(yīng)1 h，每隔10 min振蕩1次。隨后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的三氯乙酸5 mL終止反應(yīng)，在9 000 r/min 轉(zhuǎn)速下冷凍離心10 min，棄上清液，加入等體積比的乙酸乙酯-乙醇混合2 mL，洗滌沉淀3次，加入 10 mL鹽酸胍溶液(6 mol/L、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液配置、pH 6.5)，40℃下保溫20 min，待沉淀溶解，在9 000 r/min轉(zhuǎn)速下冷凍離心3 min，收集上清液。羰基吸光值得測定在370 nm處，摩爾吸光系數(shù)為 21 000/[L/(mol·cm)]，羰基含量表示為 nmol/mg 蛋白質(zhì)。

1.3.4 魚糜蛋白巰基含量測定

參考HAWKINS等[3]描述測定蛋白巰基的方法，分別取濃度為5 mg/mL蛋白溶液1 mL，加入9 mL Tris-HCl(20 mmol/L，pH 7.5)緩沖液內(nèi)含(8 mol/L尿素，10 mmol/L EDTA，2% SDS)混合充分，取5 mL混合液，加入0.5 mL DNTB(0.2 mmol/L，Tris-HCl緩沖液配置，pH 7.0)，空白組加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液。在30 ℃下反應(yīng)25 min，巰基吸光值在412 nm處，摩爾吸光系數(shù)13 600/[L/(mol·cm)]，巰基含量表示為nmol/mg 蛋白質(zhì)。

1.3.5 漂洗液蛋白及魚糜蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

參考辛草等[4]的電泳方法并改進(jìn)，將取100 μL漂洗液中，加入300 μL電泳上樣液(50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，含有2% SDS、8 mol/L尿素、2%β-巰基乙醇)使其溶解，100 ℃下金屬浴加熱5 min。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的凝縮膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的分離膠，上樣量10 μL，起始電壓85 V，待條帶進(jìn)入分離膠內(nèi)，設(shè)定電壓135 V，測定蛋白組分分子質(zhì)量。取下膠片采用R-250考馬斯藍(lán)染色法檢驗(yàn)30 min，冰乙酸甲醇進(jìn)行脫色24 h，得到還原性電泳圖譜。

1.3.6 魚糜蛋白二級結(jié)構(gòu)紅外光譜分析

參考HU等[5]的測定蛋白二級結(jié)構(gòu)的方法。稱取2 g魚糜樣品，置入小燒杯中，用透氣膜封口，進(jìn)行24 h冷凍干燥。將干樣蛋白取出，在瑪瑙研缽中搗碎后裝袋備用。紅外單點(diǎn)ATR的參數(shù)設(shè)置為掃描范圍為550～4 000 cm-1；分辨率為4 cm-1；32次平行。魚糜樣本通過溴化鉀壓片制樣，并經(jīng)傅里葉紅外光譜儀獲取原始譜圖，再經(jīng)基線校準(zhǔn)和譜圖校準(zhǔn)得到傅里葉紅外光譜。譜圖擬合分析是指通過PeakFit v4.12軟件對FT-IR譜圖中酰胺I帶進(jìn)行歸一化和二階導(dǎo)數(shù)處理后，得到四種蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的比例。二階導(dǎo)數(shù)處理擬合峰的中心處，底層帶的峰型呈現(xiàn)高斯分布。譜圖擬合系數(shù)需要高于0.999。

1.3.7 魚糜蛋白溶解度測定

參考林偉偉等[6]的方法。將制備的2 g魚糜與含有0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl(20 mmol/L，pH 7.5)緩沖液15 mL混合，10 000 r/min均質(zhì)，采用單層紗布過濾除去大顆粒及氣泡，制備9個(gè)樣品勻漿液。在4 ℃下充分?jǐn)嚢杈鶆?0 min后在4 ℃下6 000 r/min離心10 min，分別收集上清液。勻漿液和上清液中蛋白含量利用雙縮脲法測定，溶解度表示為上清液中蛋白質(zhì)含量與總蛋白含量的百分比。

1.3.8 魚糜蛋白Ca2+-ATPase活性的測定

參考張龍等[7]的方法。將魚糜勻漿液與ATP反應(yīng)液混合，反映體系中含1 mg/mL蛋白，1 mmol/L的ATP，5 mmol/L的CaCl2，0.5 mol/L的KCl，25 mmol/L的Tris-HCl(pH 7.0)。在20 ℃條件下反應(yīng)25 min，取1 mL反應(yīng)液中，并加入0.5 mL 15%高氯酸溶液終止反應(yīng)。采用鉬酸銨法 (0.5 mL的上清液中依次加入0.25 mL ELON，1.75 mL鉬酸反應(yīng)45 min后在OD值640 nm下測定吸光值)測定釋放的無機(jī)磷(Pi)含量。蛋白的Ca2+-ATPase活性單位是μmol Pi/mg·min，表示1 mg蛋白在1 min里分解ATP生成無機(jī)磷酸的μmol數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)的表示方法

本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，采用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚糜蛋白羰基含量變化

白鰱魚肉在漂洗過程中，肌肉組織被均勻分散在溶液中，增大了氧氣、金屬離子、脂質(zhì)氧化衍生物與蛋白質(zhì)分子表面的接觸機(jī)會，為蛋白質(zhì)氧化提供了條件。蛋白質(zhì)羰基化是蛋白質(zhì)復(fù)雜的氧化變性形式的一種，目前作為評價(jià)蛋白氧化最廣泛的指標(biāo)[7]。脂肪族氨基酸側(cè)鏈殘基被直接氧化，多肽骨架β-片段化，蛋白質(zhì)與還原糖反應(yīng)，與非蛋白羰基結(jié)合是產(chǎn)生羰基的四個(gè)主要途徑[8]。

如圖1所示，經(jīng)過漂洗處理，魚糜羰基含量為0.25～3.40 nmol/mg蛋白，測量數(shù)值與李學(xué)鵬等[9]測得經(jīng)低濃度羥自由基氧化體系(H2O2濃度為1 mmol/L)作用不同時(shí)間后新鮮六線魚肌原纖維蛋白中的羰基含量結(jié)果相似。結(jié)果表明經(jīng)不同漂洗處理后白鰱魚肉蛋白質(zhì)羰基化程度顯著性差異?？傮w上，相同漂洗次數(shù)下，隨漂洗溫度升高，羰基含量顯著增大。相同漂洗溫度下，隨漂洗次數(shù)增多，羰基累計(jì)含量下降(p<0.05)。例如相比于4-1，12-1和20-1的羰基含量依次增加了94.8%和15.1%。而相同溫度下，相比于12-1，12-2和12-3的羰基含量依次減少了38.92%和11.54%，其他組間結(jié)果變化相似，這與SYLVIE等[10]研究發(fā)現(xiàn)漂洗后竹莢魚碎肉經(jīng)冷藏，隨漂洗次數(shù)增多，羰基含量減少的結(jié)果相似。這種變化趨勢與漂洗的工藝特征有關(guān)，漂洗過程去除脂質(zhì)、金屬離子、水溶性蛋白(含氧合肌紅蛋白)、促氧化酶類(超氧歧化酶、過氧化氫酶等)、還原糖等誘導(dǎo)物及反應(yīng)物，一定程度上能夠抑制蛋白羰基化。同時(shí)可能去除某些羰基化氧化產(chǎn)物，如含有羰基的水溶性蛋白，多肽片段和一些羰基化的脂質(zhì)被洗除，均可能造成可檢測羰基含量減少[11]。

圖1 不同漂洗溫度和時(shí)間對白鰱魚糜蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effects of different washing temperature and time on the carbonyl content of protein in silver carp surimi注：圖1中小寫字母表示同溫度下，不同漂洗時(shí)間(次數(shù))間差異的顯著性(p<0.05)，大寫字母表示相同時(shí)間(次數(shù))下，不同漂洗溫度間差異的顯著性(p<0.05)；n=3(圖2、圖6、圖7同)。

在漂洗過程中，白鰱肉糜發(fā)生明顯的羰基化氧化變性，羰基化程度隨漂洗溫度升高顯著增強(qiáng)。漂洗次數(shù)積累能夠抑制羰基化產(chǎn)物在魚糜中的積累，是否能夠抑制羰基化發(fā)生受到漂洗系統(tǒng)中組分移除的影響，不能得到直接結(jié)論。

2.2 魚糜蛋白巰基含量變化

巰基含量變化是蛋白質(zhì)變性的重要指標(biāo)，其反應(yīng)本質(zhì)為氧化還原反應(yīng)。蛋氨酸(甲硫氨酸)，半胱氨酸中的巰基(—SH)經(jīng)氧化轉(zhuǎn)化為二硫鍵(—S—S—)，而巰基(—SH)易于與2—硝基甲苯反應(yīng)生產(chǎn)黃色物質(zhì)，因此常采用2—硝基甲苯(DTNB法，Ellman法)檢測這一蛋白變性指標(biāo)[3]。

如圖2所示，同溫度下，隨漂洗次數(shù)增多，巰基含量顯著下降(p<0.05)。同溫度下，相比與1次漂洗，2次和3次漂洗組的巰基含量均下降，但2、3次漂洗組間巰基含量下降梯度并不大，這可能是由于3次漂洗過于充分，漂洗處理破壞了已形成的二硫鍵(—S—S—)，導(dǎo)致二硫鍵(—S—S—)積累速率減慢,這與王金余等[12]研究發(fā)現(xiàn)3次漂洗降低白鰱魚糜肌球蛋白交聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果相似。經(jīng)相同漂洗次數(shù)(一次漂洗除外)，溫度升高，巰基含量下降。經(jīng)不同漂洗處理后蛋白巰基含量發(fā)生差異性變化，隨溫度升高及漂洗次數(shù)累計(jì)，巰基含量遞減，相比巰基總量，減少程度不大，表明造成巰基含量減少的蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)并不劇烈。

2.3 漂洗液蛋白(肌漿蛋白)及魚糜蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

通過羰基和巰基含量的結(jié)果可知，漂洗中的蛋白氧化變性程度并不劇烈的情況下，蛋白質(zhì)氧化多造成蛋白多肽骨架斷裂，或形成少量蛋白聚集體。并且根據(jù)李艷青[13]等研究蛋白氧化對鯉魚蛋白結(jié)構(gòu)的影響發(fā)現(xiàn)，氧化形成的少量的蛋白聚合體分子質(zhì)量超過200 kDa，難以通過濃縮膠體，進(jìn)入分離膠中。因此實(shí)驗(yàn)中采用SDS-PAGE還原性電泳檢測蛋白氧化變性后的降解變化。

圖2 不同漂洗溫度和時(shí)間對白鰱魚糜蛋白巰基含量的影響Fig.2 Effects of different washing temperature and time on the sulfhydryl content of protein in silver carp surimi

如圖3所示，相比4 ℃組，12-3、20-2、20-3組結(jié)果中發(fā)現(xiàn)肌球蛋白重鏈條帶，這表明肌球蛋白損失在漂洗液中，從而降低魚糜得率。在12 ℃和20 ℃兩個(gè)溫度下，12-2、12-3、20-2、20-3組在110～100 kDa分子質(zhì)量附近，均出現(xiàn)新增條帶，4-1、4-2、4-3、12-1、20-1組中均未出現(xiàn)，這可能是因?yàn)殡S溫度升高，漂洗次數(shù)增多，肌球蛋白發(fā)生降解的結(jié)果。肌動蛋白條帶間均無明顯差異，說明不同漂洗條件對肌動蛋白溶出的影響差異較小。

圖3 不同漂洗溫度和時(shí)間下白鰱魚糜漂洗液蛋白SDS-PAGE電泳圖譜(還原性)Fig.3 SDS-PAGE patterns of silver carp protein in washing solution under different temperature and time

如圖4所示，不同漂洗條件導(dǎo)致魚糜蛋白電泳條帶差異明顯。相比于4 ℃組，12 ℃和20 ℃組在110～100 kDa分子質(zhì)量內(nèi)，出現(xiàn)較多雜條帶，并且隨漂洗次數(shù)累計(jì)，雜條帶顏色漸深。這可能是肌球蛋白發(fā)生降解的結(jié)果與漂洗液蛋白電泳結(jié)果相吻合。相比于4 ℃組，12 ℃和20 ℃組在97.2～66.4 kDa出現(xiàn)新增雜條帶，并且同溫度下，隨漂洗次數(shù)積累，條帶漸淺。這表明蛋白降解程度加劇。且20℃組在該分子量區(qū)間條帶顏色明顯深于12 ℃組，表明在隨溫度升高，蛋白降解反應(yīng)程度更大，所有組別的肌動蛋白條帶變化不明顯。這與CLAUSEN等[14]研究氣調(diào)保藏對牛肉肌原纖維蛋白氧化變性影響中所的出的電泳結(jié)果類似。

圖4 不同漂洗溫度和時(shí)間下白鰱魚糜蛋白SDS-PAGE電泳圖譜(還原性)Fig.4 SDS-PAGE patterns of protein in silver carp surimi under different washing temperature and time

2.4 魚糜蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)傅里葉紅外光譜分析

蛋白質(zhì)變性往往改變其結(jié)構(gòu)，其中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化常作為蛋白質(zhì)變性的敏感指標(biāo)。蛋白二級結(jié)構(gòu)主要包括有α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角這3種規(guī)則的結(jié)構(gòu)，此外還有任意形態(tài)的無規(guī)則卷曲。

將白鰱漂洗魚糜干粉溴化鉀壓片上樣，獲得原始譜圖，求得二階導(dǎo)數(shù)，對譜圖中酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)進(jìn)一步分解為多個(gè)子峰，并指出其峰位置，通過曲線擬合的方法，可以定量的分析蛋白質(zhì)中各二級結(jié)構(gòu)的含量。擬合數(shù)據(jù)如表1所示，經(jīng)過漂洗處理的白鰱蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)百分含量發(fā)生變化，其中β-折疊和無規(guī)則卷曲百分含量的變化呈現(xiàn)良好的規(guī)律性。總體上，隨溫度上升和漂洗次數(shù)積累，β-折疊的百分含量下降，無規(guī)則卷曲的百分含量增多。

同溫度下，隨漂洗次數(shù)積累，β-折疊的百分含量逐漸減少，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的百分含量逐漸上升，在4 ℃組中，相比于4-1，4-2和4-3組β-折疊的百分含量依次下降2.20%和5.77%，而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的百分含量依次增多15.45%和3.54%，其他各溫度下結(jié)果類似。經(jīng)過相同漂洗次數(shù)，隨溫度上升，這2種結(jié)構(gòu)變化的差異性顯著。相比于4-1，12-1和20-1的β-折疊的百分含量分別下降了6.68%和22.05%，而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的百分含量增加了14.41%、68.47%。此外α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的百分含量基本無變化，這與盧巖等[15]研究適度氧化改善大豆分離蛋白功能結(jié)構(gòu)影響中利用圓二色譜(CD)定量蛋白二級結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果類似。

圖5 不同漂洗溫度和時(shí)間下白鰱魚糜蛋白在酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)蛋白二級結(jié)構(gòu)紅外光譜擬合圖Fig.5 Infrared spectrum fitting in amideI (1 600-1 700 cm-1) of secondary structure of silver carp surimi protein under different washing temperature and time

表1 不同漂洗溫度和時(shí)間下白鰱魚糜蛋白二級結(jié)構(gòu)百分含量Table 1 Percentage content of silver carp surimi protein secondary structure under different washing temperature and time

注：表1中小寫字母表示同溫度下，不同漂洗時(shí)間(次數(shù))間差異的顯著性(p<0.05)，大寫字母表示相同時(shí)間(次數(shù))下，不同漂洗溫度間差異的顯著性(p<0.05)；表1中后2列數(shù)據(jù)不做顯著性分析；n=3。

一些研究認(rèn)為熱處理溫度在55 ℃以下，蛋白質(zhì)其二級結(jié)構(gòu)基本不變[16]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。導(dǎo)致這種差異的原因這可能是對原料的處理方式顯著不同。魚糜漂洗前，絞碎的魚肉組織均勻分散在液體中，隨攪拌操作持續(xù)，蛋白分子與O2及Fe3+充分接觸，所導(dǎo)致的氧化變性可能是造成蛋白二級結(jié)構(gòu)變化主要原因之一。

2.5 魚糜蛋白溶解度的測定

蛋白溶解性是蛋白質(zhì)重要的功能特性之一，可用來評價(jià)氧化變性對蛋白質(zhì)功能品質(zhì)造成的破壞程度。

如圖6所示，同溫度下，隨漂洗時(shí)間延長，4 ℃和12 ℃組中，蛋白溶解性均為先升高隨后降低，而20 ℃組中，蛋白溶解度隨漂洗次數(shù)增多，連續(xù)下降?？紤]到漂洗處理改變蛋白組分和氧化變性，推斷氧化變性程度較弱時(shí)，多次漂洗處理提高了鹽溶蛋白在魚糜總蛋白所占比例，蛋白溶解能力增大，造成測定值增大。2次漂洗以后，漂洗對蛋白組分影響減弱，隨蛋白氧化變性的程度加深，溶解度減少。而經(jīng)歷相同漂洗次數(shù)，隨漂洗溫度上升，蛋白溶解性呈遞減趨勢?？傮w而言，漂洗處理后帶來的蛋白氧化變性對魚糜蛋白溶解度產(chǎn)生一定的影響，影響蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，但其蛋白溶解度不低于75%，蛋白質(zhì)功能品質(zhì)造成的破壞程度較低。

圖6 不同漂洗溫度和時(shí)間對白鰱魚糜蛋白溶解性的影響Fig.6 Effects of different washing temperature and time on the solubility of protein in silver carp surimi

2.6 魚糜蛋白質(zhì)Ca2+-ATPase酶活力

蛋白質(zhì)Ca2+-ATPase酶活力也是表征蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的重要指標(biāo)如圖7所示。經(jīng)過漂洗處理，蛋白Ca2+-ATPase酶活力發(fā)生改變，隨漂洗溫度升高和漂洗次數(shù)積累，酶活力下降，其變化范圍在0.52～0.35 μmol Pi/(mg·min)，波動范圍較小，下降程度適中。這與郝淑賢等[17]研究加工條件對淡水魚肌原纖維Ca2+-ATPase穩(wěn)定性的影響的結(jié)果相似。經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)中漂洗處理，隨溫度和漂洗次數(shù)累計(jì)，酶活力總體下降，低溫漂洗能夠很好的維持白鰱蛋白質(zhì)Ca2+-ATPase活性，蛋白變性程度較少。

圖7 不同漂洗溫度和時(shí)間對白鰱魚糜蛋白Ca2+-ATPase酶活力的影響Fig.7 Effects of different washing temperature and time on the Ca2+-ATPase activity of protein in silver carp surimi

3 結(jié)論

本文對不同漂洗條件下制備所得白鰱魚糜的氧化指標(biāo)進(jìn)行測定，分析在漂洗工段中白鰱魚肉蛋白氧化變性規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)，在魚糜漂洗過程中，隨漂洗溫度上升和漂洗次數(shù)積累，檢測指標(biāo)反映各種類蛋白氧化反應(yīng)均有發(fā)生。其中蛋白羰基化，蛋白質(zhì)分子降解及二級結(jié)構(gòu)含量變化的結(jié)果間的差異性較強(qiáng)。針對漂洗工藝，電泳圖譜及蛋白二級結(jié)構(gòu)變化可做為顯著的檢測指標(biāo)。漂洗過程中蛋白氧化影響其功能品質(zhì)，但對其損傷作用在加工的可接受范圍內(nèi)。綜合考慮，低溫(4 ℃)及少次數(shù)(1或2次)漂洗滿足工藝加工要求的同時(shí)能夠有效減少總蛋白損失，控制蛋白氧化程度，維持蛋白質(zhì)良好功能特性，有利于淡水魚糜加工生產(chǎn)。此外關(guān)于魚糜加工過程中蛋白氧化對制品的食用營養(yǎng)，安全健康性還需進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，望本文結(jié)果對實(shí)際生產(chǎn)過程中的蛋白質(zhì)氧化研究提供一定的理論支持。

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ProteinoxidationinmincedSilvercarp(Hypophthalmichthysmolitrix)duringwashingprocess

YUAN Kai1,ZHANG Long1,GU Dong-chen1,FAN Zhen-yu1,WANG Xi-chang1*,LI Yu-jin2,LIU Yuan-ping2

1(College of Food Science and Technology Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China) 2(Rongcheng Taixiang Food Products Co.,Ltd,Weihai 264309,China)

Based on industrial surimi washing processing,this paper discusses protein oxidation in the process and provides scientific basis for surimi processing research.Fresh silver carp surimi was prepared at different temperatures (4,12,20 ℃) and different washing times (1,2,3).Then the content of carbonyl group and total thiol content,Ca2+-ATPase enzyme activity,the degree of protein degradation and aggregation,change of secondary protein structure were detected.The results show that the content of carbonyl increased significantly with the increase of temperature but decreased with washing times.The disordered structure increased with the increase of temperature and times,while the content of total sulfhydryl and β-fold structure decreased gradually.Myosin degradation was caused by washing and with temperature increasing,the degradation increased; protein solubility and Ca2+-ATPase activity decreased.Among these indexes,SDS-PAGE pattern and the changes of the secondary protein structure are the good indexes to evaluate oxidation denaturation.Washing 1-2 time at 4 ℃ could effectively control protein oxidation degree while ensuring yield of protein.

silver carp surimi; washing; protein oxidation; detected indexes

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014490

碩士研究生(王錫昌教授為通訊作者，E-mail：xcwang@shou.edu.com)。

2014年泰山學(xué)者藍(lán)色產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才團(tuán)隊(duì)支撐項(xiàng)目“低值蛋白高值化重組利用關(guān)鍵技術(shù)集成與產(chǎn)業(yè)化”

2017-04-09，改回日期：2017-05-12