發(fā)酵過程中白鰱魚糜抗氧化特性的變化

楊方，朱露露，張曉維，于沛沛，許艷順，姜啟興，夏文水

(江南大學，食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫，214122)

發(fā)酵過程中白鰱魚糜抗氧化特性的變化

楊方，朱露露，張曉維，于沛沛，許艷順，姜啟興，夏文水*

(江南大學，食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫，214122)

研究了白鰱魚糜在發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化，并通過其與水解度、游離氨基酸、分子質(zhì)量分布的相關(guān)性分析，確立了發(fā)酵白鰱魚糜抗氧化活性的形成原因。結(jié)果表明：發(fā)酵過程中，魚糜的2,2-聯(lián)氮-二[3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸]二銨鹽(2,2′-azinobis-[3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate]，ABTS)清除率和鐵離子螯合力逐漸上升，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)清除率先上升后下降；與此同時，水解度和游離氨基酸總量持續(xù)增加，小分子量肽段和疏水性氨基酸含量顯著提高；經(jīng)相關(guān)性分析，含硫氨基酸和Mr在1 000～5 000范圍內(nèi)的多肽可能是發(fā)酵魚糜抗氧化特性產(chǎn)生的原因。

魚糜；生物發(fā)酵；抗氧化活性；水解度；游離氨基酸；分子量分布

研究魚制品的抗氧化特性十分必要，現(xiàn)有文獻對以抗氧化特性為靶向的魚蛋白粉、魚多肽粉的研究較多[1-3]，而對以魚為原料的普通食品的抗氧化特性研究較少。魚蛋白/多肽粉屬于功能性食品，針對特定人群，受益面較小，因而帶有保健功能的普通魚食品預計將有更廣闊的市場前景。

淡水魚水分含量大，肌肉纖維細，內(nèi)源酶活性高，易腐敗變質(zhì)，感官品質(zhì)和安全性急劇下降。生物發(fā)酵技術(shù)通過最終產(chǎn)品較低的pH和優(yōu)勢增長的乳酸菌菌群抑制病原菌和腐敗菌的生長，并通過蛋白、脂質(zhì)水解產(chǎn)生獨特發(fā)酵風味，被證實是一種較好的魚制品加工保藏手段[4-5]。發(fā)酵體系內(nèi)產(chǎn)生的酸，以及豐富的水解酶系，都給抗氧化活力的提高提供了條件；然而，在淡水魚體系內(nèi)，發(fā)酵技術(shù)對抗氧化特性的影響尚不明確。

因此，本課題以發(fā)酵白鰱魚糜作為研究對象，測定發(fā)酵過程中魚糜抗氧化活力變化情況，并通過對抗氧化活性和水解度、游離氨基酸、分子量分布的相關(guān)性分析，闡明發(fā)酵白鰱魚糜抗氧化特性形成原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鰱：(2.5±0.5)kg/條，購于無錫市濱湖區(qū)江南大學附近華潤萬家超市，現(xiàn)場敲頭宰殺，洗凈血污，冰盒運輸至實驗室。

發(fā)酵菌種：植物乳桿菌，實驗室自篩菌株(取材于酸魚)，由國家重點實驗室認定。

試劑：TNBS，F(xiàn)errozine(鐵試劑)，購于Sigma公司；ABTS，DPPH購于Tokyo Chemical Industry公司；其余藥品、試劑為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MDF-U53V深凍冰箱，日本三洋電子有限公司；SQ2119DX西貝樂食品料理機，上海帥佳電子科技有限公司；T18高速分散機，上海易絲生物科技有限公司；隔水式培養(yǎng)箱、DK-8AXX型電熱恒溫水槽，上海一恒科學儀器有限公司；4K-15高速冷凍離心機，德國Sigma公司；UV-1000分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；pH計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；Waters 600 高效液相色譜儀(紫外檢測器為2487型號)，美國沃特世公司；HP 1100高效液相色譜儀(氨基酸專用)，美國安捷倫科技有限公司；Mini-pellicon超濾裝置，美國Millipore公司；KQ 5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵魚糜的制備

根據(jù)XU等[6]方法，發(fā)酵魚糜制備的具體實驗步驟如下：魚體經(jīng)去頭、去皮、去骨后，選取背部肌肉，打漿成為魚糜。添加發(fā)酵液(ω=1%)，NaCl(ω=2%)，葡萄糖(ω=3%)，攪拌均勻后，灌腸，放置30 ℃培養(yǎng)48 h。分別于0、12、24、36、48 h取出樣品測定抗氧化活力。

發(fā)酵液的制備方法為：取-80 ℃深凍冰箱中甘油保藏菌種(植物乳桿菌)，接種到MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)(φ=1%)，30 ℃下培養(yǎng)24 h進行活化，重復3次，作為發(fā)酵液(含有107～108CFU活菌)。

1.3.2 抗氧化活力的測定

測定樣液制備方法：發(fā)酵魚糜樣品與蒸餾水按1∶2的質(zhì)量比在轉(zhuǎn)速(n=12 000)下均質(zhì)30 s后，在14 600g下離心20 min，上清液用3層紗布過濾，濾液作為測試樣液。

根據(jù)YANG等[7]方法，抗氧化活力測定的具體實驗步驟如下：

ABTS清除率測定方法：5.0 mL ABTS溶液(7 mmol/L)與88 μL過硫酸鉀溶液(140 mmol/L)在室溫下避光反應12 h以上后，用5 mmol/L的PBS緩沖液(pH 7.4，含有0.15 mol/L的NaCl)稀釋至溶液吸光值(734 nm處)達1.0以下(約稀釋100倍)，作為自由基反應試劑。將200 μL樣液(稀釋5倍)和2 800 μL自由基反應試劑混合，在室溫下避光反應10 min后在734 nm處讀取吸光值。

DPPH清除率測定方法：將2 mL DPPH溶液(0.15 mmol/L，溶于φ=99.5%的乙醇)與2 mL樣液在室溫下避光反應30 min后，517 nm處讀取吸光值。

金屬離子清除率(Fe2+螯合能力)測定方法：將3.7 mL樣液加入100 μL FeCl2(2 mmol/L)和 200 μL 鐵試劑(5 mmol/L)，室溫反應10 min后，562 nm處讀取吸光值。

空白組用蒸餾水代替樣液。計算方法為：

(1)

1.3.3 pH和水解度(DH)的測定

樣品與水按1∶10的質(zhì)量比均質(zhì)后，測定pH值。

水解度測定方法采用TNBS法[8]：樣品與SDS溶液(ω=2%)按1∶9的質(zhì)量比均質(zhì)，并在85 ℃水浴加熱30 min后離心(10 000g，15 min)，上清液作為測試樣液。用2 mL磷酸緩沖液(pH 8.2)稀釋125 μL樣液并預熱后，加入1.0 mL TNBS溶液(ω=0.1%)在50 ℃下避光反應30 min。接著加入2.0 mL亞硫酸鈉溶液(0.1 mol/L)并在室溫下放置15 min后，420 nm處讀取吸光值。以亮氨酸為標準氨基酸繪制標準曲線(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)

(2)

1.3.4 游離氨基酸的測定

根據(jù)FOH等[3]，樣品與TCA溶液(ω=5%)按1∶5質(zhì)量比均質(zhì)后定容(精確為5倍)。定容液超聲2次，15 min/次，然后靜置1 h。接著用雙層濾紙過濾后并離心(n=10 000，10 min)，上清液為測試樣液。色譜柱ODS Hypersil柱長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，孔徑5 μm。柱溫40 ℃，流動相A：m(乙酸鈉)∶v(水)∶v(三乙胺)∶v(四氫呋喃)=8∶1 000∶0.225∶5，pH 7.2，流動相B：m(乙酸鈉)∶v(水)∶v(乙腈)v(甲醇)=8∶400∶800∶800，pH 7.2。梯度洗脫程序為：0～27.5 min，A∶B=92∶8，流速1 mL/min；27.5～31.5 min，A∶B=40∶60，流速1.5 mL/min；31.5～32 min，100% B，流速1.5 mL/min；32～34 min，100% B，流速1 mL/min；34～35.5 min，A∶B=92∶8，流速1 mL/min。脯氨酸和羥脯氨酸含量在262 nm處測定，其余氨基酸含量在338 nm處測定。

1.3.5 分子質(zhì)量分布

根據(jù)FOH等[3]，采用2000 SWXL型號的TSK凝膠柱，柱長300 mm，內(nèi)徑7.8 mm。柱溫30 ℃，流動相：v(乙腈)∶v(HPLC級超純水)∶v(三氟乙酸)=45∶55∶0.1，流速0.5 mL/min。以細胞色素C(Mr=12)，桿菌酶(Mr=1 450)，乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mr=451)，乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mr=189)為標準品繪制分子量標準曲線。

1.4 數(shù)據(jù)分析

圖表由OriginPro 8.6繪制，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0，2組數(shù)據(jù)差異性分析采用獨立樣本T檢驗，多組數(shù)據(jù)差異性分析采用單因素ANOVA兩兩比較的Duncan模型。顯著性差異定義為p<0.05，不同字母表示同組內(nèi)數(shù)據(jù)差異顯著；*表示在0.05水平上有顯著差異，**表示在0.01水平上有顯著差異。采用Pearson雙變量相關(guān)分析法進行不同因素兩兩之間相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程魚糜抗氧化活力變化

由圖1可知，魚糜在發(fā)酵過程中，ABTS自由基清除率和Fe2+螯合力都隨發(fā)酵時間的增加而上升，而DPPH自由基清除率呈現(xiàn)不同變化規(guī)律——在發(fā)酵前24 h內(nèi)逐漸上升，但在發(fā)酵后期略有下降；發(fā)酵結(jié)束時，ABTS和DPPH自由基清除率約為80%，而金屬Fe2+的螯合力在發(fā)酵過程中一直低于20%，在發(fā)酵初期甚至出現(xiàn)負值。

根據(jù)文獻報道，ABTS法可以測定包括親水多肽和疏水多肽在內(nèi)的所有物質(zhì)總抗氧化活力，而DPPH法主要針對疏水性物質(zhì)的抗氧化活力[9]。因而由圖1可以推斷，在發(fā)酵過程中，蛋白水解產(chǎn)生的多肽總抗氧化活力在提高，而疏水性多肽的抗氧化活力先增加后減少。這可能是因為在發(fā)酵體系內(nèi)，隨著蛋白水解程度加深，疏水性基團被酶切而越來越少，導致疏水多肽的減少。在發(fā)酵過程中，F(xiàn)e2+螯合力一直很低，說明該體系金屬離子螯合/清除能力較弱。有文獻指出，F(xiàn)e2+螯合力和體系內(nèi)羧基含量、支鏈氨基酸殘基數(shù)有顯著相關(guān)性[1]。此外，魚肉中本身含有血紅蛋白，該蛋白中含鐵，而金屬離子螯合能力測定的空白試樣采用的是水，水內(nèi)幾乎不含有Fe2+，發(fā)酵初期，魚肉中血紅素的Fe2+會釋放到發(fā)酵體系內(nèi)，而抗氧化肽來不及清除鐵試劑以外的魚源Fe2+，可能是造成抗氧化活力呈現(xiàn)負值的原因。

圖1 發(fā)酵過程魚糜抗氧化活力變化Fig.1 Change of antioxidant activities of fish surimi during fermentation

2.2 發(fā)酵過程魚糜水解度(DH)變化

由圖2可知，魚糜水解度隨發(fā)酵時間的增加呈現(xiàn)先緩慢上升后加速上升的趨勢，發(fā)酵時間12 h是趨勢變化分界點；發(fā)酵結(jié)束后，水解度達約9%。水解度增加表征酶水解程度加深，大分子蛋白被逐漸降解。發(fā)酵前12 h水解度增加緩慢而后半程快速增加的原因可能是發(fā)酵魚糜體系內(nèi)發(fā)揮水解主要作用的是酸性蛋白酶，隨著發(fā)酵進行，pH下降，在發(fā)酵后期激活了酸性蛋白酶，且酸性蛋白酶同時由外肽酶和內(nèi)肽酶組成，加快了水解效率，導致了水解度的迅速上升。

通過圖1、圖2對比發(fā)現(xiàn)，水解度與金屬離子清除率、ABTS清除率有相近的變化趨勢，但與疏水性多肽抗氧化活力(DPPH清除率)的變化趨勢不一致，表現(xiàn)為DPPH清除率在發(fā)酵前期活力上升，在后期(24～48 h)下降約3%，而水解度卻持續(xù)上升約4.4%。YOU等[10]研究木瓜蛋白酶/復合蛋白酶水解泥鰍蛋白時發(fā)現(xiàn)，23% DH下活性肽的ABTS和DPPH清除率比28%和33% DH下的更高。所以，對抗氧化活力而言，并非水解度越高越好。但是就Fe2+螯合力而言，水解度的增加產(chǎn)生更多的羧基和支鏈氨基酸殘基，會提高這種抗氧化活力。

圖2 發(fā)酵過程魚糜水解度變化Fig.2 Change of hydrolysis degree of fish surimi during fermentation

2.3 發(fā)酵過程魚糜游離氨基酸變化

由圖3可知，白鰱魚糜在發(fā)酵過程中，天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)顯著增加。這些氨基酸除了天冬氨酸、谷氨酸和賴氨酸，其余氨基酸均為疏水性氨基酸，支撐了上述的疏水性基團在發(fā)酵過程中尤其是發(fā)酵后期被酶切的推斷。由圖3還可以發(fā)現(xiàn)，游離氨基酸中含量最高的組氨酸呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢?？赡苁且驗榘l(fā)酵初始，在酸和內(nèi)源酶的作用下，蛋白質(zhì)被水解產(chǎn)生組氨酸，而后在乳酸菌組氨酸脫羧酶的作用下，組氨酸降解，導致組氨酸減少。這種脫羧活力在低pH發(fā)酵過程中更高，因為乳酸菌在酸性環(huán)境中為了維持正常生長，通過代謝產(chǎn)生組胺來調(diào)節(jié)環(huán)境pH值[11]。這是發(fā)酵制品中存在的比較普遍的安全問題-生物胺的生成，需要采取措施進行防控。

圖3 發(fā)酵過程魚糜不同游離氨基酸變化Fig.3 Change of free amino acids of fish surimi during fermentation

由圖4可知，氨基酸總含量主要在后期顯著增長。發(fā)酵前期24 h以內(nèi)，游離氨基酸產(chǎn)生較少，后期大量游離氨基酸產(chǎn)生。但這一先慢后快的增長趨勢和抗氧化活力的先快后慢的增長趨勢不是十分吻合，說明游離氨基酸的增長對抗氧化活力增加的貢獻能力有限。黃明等[12]綜述文獻時，表明大量的游離氨基酸表現(xiàn)出的抗氧化能力較弱。也有文獻認為，當?shù)鞍姿庖褐泻写罅拷M氨酸、含硫氨基酸和芳香族氨基酸時，會有較高的抗氧化特性，主要是因為組氨酸的咪唑基團具有捕捉電子和脂質(zhì)自由基的能力，含硫氨基酸的巰基和芳香族氨基酸的苯環(huán)結(jié)構(gòu)可以貢獻氫質(zhì)子給缺電子的自由基發(fā)揮抗氧化作用，芳香族氨基酸還可以通過共軛結(jié)構(gòu)保證抗氧化活力的穩(wěn)定[10,13]。

2.4 發(fā)酵過程魚糜分子質(zhì)量分布變化

由表1可知，隨著發(fā)酵時間的增加，相對分子質(zhì)量大于5 000的蛋白或多肽總體呈下降趨勢，但是前12 h相對分子質(zhì)量大于10 000的蛋白/多肽的比例略有上升，說明蛋白和蛋白、蛋白和多肽、或多肽和多肽之間發(fā)生交聯(lián)，形成了更大分子量的聚集體，與之前的酸性條件會誘導發(fā)酵魚糜凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)形成的報道吻合[14]。在發(fā)酵12～24 h，Mr在5 000～180的多肽大幅度增加(增長了29%)，24 h之后相對分子量較大的多肽(5 000～2 000)增長速度變慢，相對分子量較小的多肽(2 000～500)增長速度加快，其中，2 000～1 000分子段和1 000～500分子段的含量在發(fā)酵24～48 h分別增加了212%和282%。曾有文獻報道，Mr<3 000的多肽是抗氧化特性產(chǎn)生的主要來源[15]。

圖4 發(fā)酵過程魚糜游離氨基酸總量變化Fig.4 Change of free amino acid content of fish surimi during fermentation

表1 發(fā)酵過程魚糜相對分子質(zhì)量分布變化Table 1 Change of relative molecular mass distribution of fish surimi during fermentation

2.5 抗氧化活性產(chǎn)生原因分析

相關(guān)性分析可以從側(cè)面分析2個參數(shù)之間的聯(lián)系或非相關(guān)性。由表2可知，水解度、游離氨基酸、不同范圍的多肽含量均和抗氧化活力存在一定的相關(guān)性。具體來說，游離氨基酸總量變化和抗氧化活力變化的相關(guān)性相對最小(但也顯著相關(guān))，組氨酸His含量的變化與3種抗氧化活力之間幾乎不存在相關(guān)性；含硫氨基酸(甲硫氨酸Met、半胱氨酸Cys)含量與抗氧化活力之間有較高相關(guān)性，尤其是總抗氧化活力和金屬離子螯合能力；芳香族氨基酸(酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe、色氨酸Trp)含量與抗氧化活性存在一定相關(guān)性，但不顯著，與文獻報道具有一定的一致性[10，13]。針對不同分子量大小的多肽而言，1 000～5 000 Da段的多肽與抗氧化活力最相關(guān)，WU等[13]和HERNNDEZ-LEDESMA等[15]也指出該范圍肽段有更高的抗原化活性。值得注意的是，DPPH清除率和任何指標都不具有顯著相關(guān)性，也許其與疏水性多肽含量相關(guān)性更大。

表2 發(fā)酵過程生化指標和抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between biochemical properties and antioxidant properties during fermentation

3 結(jié)論

魚糜的總抗氧化活力和金屬離子螯合能力隨發(fā)酵時間的增加而上升，疏水性多肽的抗氧化活力在發(fā)酵過程中先上升后下降；發(fā)酵魚糜的抗氧化活力與水解度、游離氨基酸總量、含硫氨基酸、Mr1 000～5 000段的多肽含量均具有顯著相關(guān)性，具體序列結(jié)構(gòu)還有待進一步分析。

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Effectoffermentationonantioxidantactivitiesofsilvercarpsurimi

YANG Fang,ZHU Lu-lu,ZHANG Xiao-wei,YU Pei-pei,XU Yan-shun,JIANG Qi-xing,XIA Wen-shui*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,School of Food Science and Technology,Collaborative Innovation Center of Food Safety and Quality Control in Jiangsu Province,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The study was aimed to investigate the change of antioxidant activities in silver carp surimi during fermentation and clarify the reason for its production based on correlation analysis of degree of hydrolysis (DH),free amino acids and molecular weight distribution.The results showed that ABTS scavenging activities and Fe2+chelating activities increased during fermentation,while DPPH scavenging activities grew up firstly and then went down.Meanwhile,DH and free amino acid content increased,with upward trends in content of low-molecular-weight peptides and hydrophobic amino acids.Correlation analysis showed that Met,Cys and peptides in the range of Mr 1 000-5 000 might contribute to antioxidant properties of silver carp surimi.

surimi; fermentation; antioxidant properties; degree of hydrolysis; free amino acids; molecular weight distribution

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015518

博士，助理研究員(夏文水教授為通訊作者，E-mail：xiaws@jiangnan.edu.cn)。

國家大宗淡水魚類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(No.CARS-45-26)；江蘇省自然科學青年基金(BK2015043269)；江蘇省自然科學青年基金(BK20170185)

2017-08-21，改回日期：2017-09-12