添加劑對漆酶酸堿穩(wěn)定性的影響及保護機理

何小勇，任大軍，鄧志群，劉海，張淑琴，張曉晴

(武漢科技大學 資源與環(huán)境工程學院，湖北 武漢，430080)

添加劑對漆酶酸堿穩(wěn)定性的影響及保護機理

何小勇，任大軍*，鄧志群，劉海，張淑琴，張曉晴

(武漢科技大學 資源與環(huán)境工程學院，湖北 武漢，430080)

為了提高漆酶的穩(wěn)定性，研究了甘油、肌醇和山梨醇3種添加劑對漆酶酸堿穩(wěn)定性的影響，并通過紫外光譜、熒光光譜和圓二色譜分析了添加劑對漆酶的保護機理。研究表明，添加劑對漆酶的保護效果與添加劑的種類和濃度有關。在pH 3的緩沖液中，當肌醇的濃度為0.2 mol/L時漆酶的相對酶活達到最大值(125%)，當甘油或山梨醇濃度增加時，漆酶的相對酶活逐漸增大；當添加的濃度相同時，甘油對漆酶的保護效果強于山梨醇，當添加的濃度為0.6 mol/L時，甘油使漆酶相對酶活提高了29%，山梨醇使漆酶相對酶活提高了15%。漆酶適宜的pH值范圍為2～5，加入添加劑后提高了漆酶的酸堿穩(wěn)定性。通過光譜分析可知，通過與漆酶分子間形成氫鍵，甘油、肌醇和山梨醇可以提高漆酶在溶液中的酸堿穩(wěn)定性。

漆酶；穩(wěn)定性；添加劑；保護機理

漆酶(Laccase,EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，能夠催化降解多種酚類有機物[1]。漆酶催化底物比較廣泛，可以應用于治理紡織印染廢水、含酚廢水和造紙工業(yè)廢水[2]。雖然漆酶的催化底物廣泛，但是由于天然漆酶的穩(wěn)定性較差，在使用時易失活，限制了漆酶的實際應用[3]。因此，研究提高漆酶穩(wěn)定性的方法對其實際應用具有重要意義。目前，酶穩(wěn)定化的主要方法有化學修飾、非共價修飾、固定化和蛋白質(zhì)工程等[4]。加入添加劑屬于非共價修飾的方法，而多羥基化合物是添加劑中重要的一種。賈曉龍[5]研究了幾種多羥基化合物對纖維素酶的影響，研究結(jié)果表明,多羥基化合物能夠提高纖維素酶在極端pH值環(huán)境中的穩(wěn)定性。陳亦等[6]研究發(fā)現(xiàn)，甘油通過提高溶液黏度和表面水化層，阻止酶分子間的聚集，可以提高膽固醇氧化酶的穩(wěn)定性。葉雙雙[7]等考察了多種添加劑對苯丙氨酸羥化酶穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)甘油、海藻糖、棉籽糖和甘露醇均能提高苯丙氨酸羥化酶的酶活保留率。本項目選擇甘油、肌醇和山梨醇3種添加劑對漆酶的酸堿穩(wěn)定性進行研究，對拓寬漆酶的使用范圍具有重要意義。通過紫外光譜、熒光光譜和圓二色譜探討了添加劑對漆酶的保護機理，為添加劑保護漆酶提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二氨鹽(2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)、漆酶(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；肌醇、山梨醇和甘油(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

PB-10型pH計，德國Sartorius公司；UV-2550紫外可見分光光度計，日本津島公司；FP-6500熒光光譜儀和J-810圓二色譜儀，日本Jasco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 漆酶溶液和添加劑溶液的配置

選擇NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系，并用H3PO4和NaOH調(diào)節(jié)酸堿度，配置成pH值為pH 2～7的緩沖液，緩沖液質(zhì)量濃度均為0.01 mg/mL。分別用不同pH值的緩沖液配制添加劑溶液，其中肌醇、山梨醇和甘油各配置成濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mol/L。用不同pH值的緩沖液配制漆酶溶液，使漆酶的質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。將pH值相同的添加劑溶液和漆酶溶液等體積混合，放置24 h后測定不同pH值的混合液的相對酶活，同時取樣測定熒光光譜、圓二色譜和紫外光譜。

1.3.2 酶活力的測定

采用ABTS比色法測定漆酶的酶活[8]。先加入2 mL酶液，最后加入1 mL 0.5 mmol/L ABTS于常溫下啟動反應，測定3 min內(nèi)在420 nm處反應液的吸光度值的變化，以每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物定義為1個酶活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的添加劑對漆酶酶活的影響

為了便于研究添加劑對漆酶酸堿穩(wěn)定性的影響，首先考察添加劑濃度對漆酶酶活的影響，確定添加劑的適宜濃度。在pH 3的漆酶溶液中加入不同濃度的添加劑，測定其酶活并與未加添加劑的漆酶溶液比較，計算漆酶的相對酶活。

從圖1可知，隨著肌醇濃度的增加，漆酶的相對酶活先增大后減小。當肌醇的濃度達到0.2 mol/L時，漆酶的相對酶活達到最大，故肌醇的適宜濃度為0.2 mol/L。加入過量的肌醇，漆酶的活性反而降低，這可能是由于過量的肌醇會阻礙漆酶與ABTS結(jié)合，進而使酶活性降低。劉彩琴[9]等人的研究結(jié)果也表明加入過多的添加劑會使酶活性下降。添加甘油和山梨醇的相對酶活曲線較為相似，都是隨著濃度的上升，漆酶的相對酶活逐漸增大，當添加的濃度相同時加入甘油后漆酶的相對酶活大于加入山梨醇，說明甘油的效果強于山梨醇。當甘油或山梨醇的添加量達到0.6 mol/L時，加入甘油時漆酶相對酶活提高了29%，加入山梨醇后提高了15%。在考察的濃度范圍內(nèi)由于甘油和山梨醇的相對酶活曲線沒有出現(xiàn)極值，因此我們以0.6 mol/L作為甘油和山梨醇的適宜濃度，考察其對漆酶的保護效果。從圖1我們還可看出，添加劑對漆酶的保護效果與添加劑的類型和濃度有關，因此選擇合適的添加劑及其適宜的濃度對其在實際中的應用具有十分重要的意義。

圖1 加入添加劑后漆酶的相對酶活Fig.1 The relative enzyme activity of laccase after adding additives

2.2 添加劑對漆酶的酸堿穩(wěn)定性的影響

從圖2可知，隨著溶液pH值的升高，漆酶的相對酶活先增大后減小，在溶液pH 3時漆酶的相對酶活達到最大值。漆酶的相對酶活在緩沖液pH 2～5時都維持在了100%以上，可以看出其適宜的pH值范圍應該在pH 2～5。當溶液為pH 2～3時，加入甘油對漆酶的保護效果要好于山梨醇或肌醇，而在pH 4的溶液中加入山梨醇后漆酶的相對酶活高于甘油或肌醇?？偟膩碚f甘油的保護效果要好于山梨醇和肌醇，在pH 2和3的溶液中能使漆酶的相對酶活分別提高53%和120%。當溶液pH>5時漆酶的酶活下降較快，加入添加劑對漆酶的保護效果不明顯。在pH 6的漆酶溶液中，加入添加劑后漆酶的相對酶活提高了不到10%。添加劑對漆酶的保護效果與漆酶的適宜pH值范圍有關，當溶液pH值超過其適宜范圍時，添加劑對漆酶的保護效果下降。從圖2不難看出，添加劑可以提高漆酶在不同pH值溶液中的相對酶活，添加劑增強了漆酶的酸堿穩(wěn)定性。

圖2 加入添加劑后漆酶在不同pH溶液中的酶活Fig.2 Enzyme activity of laccase after adding additives in different pH solutions

2.3 添加劑對漆酶的保護機理

2.3.1 漆酶的紫外光譜分析

蛋白質(zhì)的紫外光譜有190～220 nm和250～300 nm兩個吸收峰區(qū)[10]。前者是肽基團的吸收峰區(qū)，后者主要是蛋白質(zhì)中酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸的貢獻[11-12]。由圖3可知，隨著pH值的升高，肽基團的吸收峰逐漸增強，并且吸收峰紅移。增大pH值會誘導漆酶肽鏈伸展，埋藏在內(nèi)部的肽基團會逐漸暴露到水中，進而使漆酶在溶液中的穩(wěn)定性降低。本研究采用的漆酶分子含有33個苯丙氨酸，7個色氨酸和13個酪氨酸，從圖3可以看出漆酶在290 nm處有特征吸收峰出現(xiàn)，但是吸收峰很微弱，無法通過紫外光譜分析溶液pH值對漆酶3種氨基酸殘基的影響。圖4是緩沖液pH 5時漆酶的紫外光譜，從中可以看出加入添加劑后肽鍵的吸收峰強度變?nèi)趿硕椅辗寮t移。所選擇的這3種添加劑都屬于多羥基化合物，它們在溶液中與漆酶之間能形成氫鍵，當溶液pH值升高導致漆酶肽鏈伸展時，多羥基化合物與漆酶之間的這種相互作用力能夠阻止這種不利影響。由于氫鍵的存在，添加劑增強了漆酶的酸堿穩(wěn)定性。在290 nm處是由3種氨基酸吸收峰共同組成的，添加劑對這3種氨基酸殘基微環(huán)境的影響無法通過紫外光譜進行區(qū)分。

圖3 不同pH值下漆酶的紫外光譜Fig.3 UV spectra of laccase at different pH values

圖4 加入添加劑后漆酶的紫外光譜Fig.4 The UV spectrum of the laccase after adding the additive

2.3.2 漆酶的熒光光譜分析

在漆酶分子中能發(fā)射熒光的主要是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸的熒光量子產(chǎn)量低，而酪氨酸的熒光由于常常被熄滅顯得很弱[13-14]。因此，選擇色氨酸的熒光來研究漆酶的構(gòu)象變化。選擇290 nm的激發(fā)波長可以避免其他2個氨基酸的干擾，方便研究漆酶中的色氨酸殘基微環(huán)境的變化。從圖5中可知，隨著溶液pH值的上升，色氨酸殘基的熒光強度逐漸增強，熒光光譜藍移，最大吸收峰從343 nm移動到336 nm。這可能是因為當溶液pH值增大時，漆酶分子會發(fā)生去折疊過程進而使肽鏈得到伸展，從而使埋藏在漆酶分子內(nèi)部的氨基酸殘基暴露在極性溶劑中。這種變化會降低漆酶活性和漆酶的酸堿穩(wěn)定性。圖6是緩沖液pH 5時漆酶的熒光光譜，從中可以看出，加入多羥基化合物后色氨酸殘基的熒光強度有不同程度下降，表明添加劑存在時不利于漆酶肽鏈的展開。最大吸收峰并沒有發(fā)生藍移或紅移，說明當漆酶的氨基酸殘基暴露于溶液中時，添加劑能夠維持氨基酸殘基微環(huán)境的穩(wěn)定，抵抗溶液pH值變化對其造成的影響。這3種添加劑在水溶液中能與漆酶分子形成很多氫鍵，這些氫鍵的存在能使漆酶抵抗溶液pH值變化帶來的不利影響，使漆酶的空間結(jié)構(gòu)不被破壞，這是維持漆酶活性的重要原因。

圖5 不同pH值下漆酶的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of laccase at different pH values

圖6 加入添加劑后漆酶的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of laccase after adding additives

2.3.3 漆酶的圓二色譜分析

蛋白質(zhì)變性時往往發(fā)生α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲之間的相互轉(zhuǎn)化[15-16]。利用圓二色譜可以研究漆酶二級結(jié)構(gòu)的變化。其中α-螺旋結(jié)構(gòu)在192 nm附近有一個正的特征峰，208和223 nm處有2個負的特征譜帶；β-折疊在195～197 nm有正的特征峰，218 nm附近有負的特征譜帶；β-轉(zhuǎn)角在200～205 nm有正的吸收峰。

從圖7可以看出，漆酶的二級結(jié)構(gòu)主要以β-折疊和無規(guī)則卷曲為主，隨著溶液pH值的變化這兩種結(jié)構(gòu)的含量也會發(fā)生變化。在pH 3的緩沖溶液中漆酶沒有出現(xiàn)明顯的β-折疊吸收峰，然而在pH值為5和7的漆酶溶液中出現(xiàn)了的β-折疊的吸收峰,但是其吸收峰很弱。本研究采用的是側(cè)耳屬漆酶，其等電點是4.51[17]，當溶液pH值低于等電點時漆酶產(chǎn)生凈的正電荷，反之漆酶帶負電荷。在蛋白質(zhì)分子中不同基團間存在著靜電作用(靜電吸引或靜電排斥)[18]，當溶液pH值改變時會導致漆酶分子上不同基團所帶的電荷發(fā)生變化，由原來的靜電吸引變成靜電排斥。從圖7中可以看出，pH值變大時漆酶的無規(guī)則卷曲會向β-折疊轉(zhuǎn)變，靜電排斥會導致漆酶構(gòu)象改變，降低漆酶活性和漆酶的穩(wěn)定性。

圖7 不同pH值下漆酶的圓二色譜圖Fig.7 The circular dichroism of laccase at different pH values

圖8是緩沖液pH 5時漆酶的圓二色譜，從圖8可知，加入添加劑后無規(guī)則卷曲的含量變高了，說明加入添加劑能夠有效抑制pH值變化導致的靜電作用對漆酶二級結(jié)構(gòu)的影響，這可能是因為添加劑分子中的羥基與漆酶的酰胺基團能夠形成氫鍵。通過與漆酶分子形成氫鍵，甘油、肌醇和山梨醇能夠削弱溶液pH值變化導致的漆酶分子內(nèi)部的靜電排斥力，提高漆酶分子的穩(wěn)定性。

圖8 加入添加劑后漆酶的圓二色譜圖Fig.8 The circular dichroism of the laccase after adding the additive

3 討論

研究了不同濃度和種類的添加劑對漆酶酶活和酸堿穩(wěn)定性的影響，同時探究了添加劑對漆酶的保護機理。添加劑對漆酶的保護效果不僅與添加劑的濃度有關，還與其種類有關。本研究選擇的添加劑都屬于多羥基化合物，其對漆酶存在不同的保護效果可能是由于這些添加劑分子中的羥基活躍度不一樣，導致其與漆酶分子間形成的相互作用力不同，從而表現(xiàn)出不同的保護效果[19]。加入添加劑后漆酶的相對酶活提高了，添加劑的存在能增強其酸堿穩(wěn)定性。本次選擇的添加劑含有多個羥基，許多研究表明多羥基化合物能夠提高酶的穩(wěn)定性。如劉朝暉等[20]研究了幾種多羥基化合物對β-甘露聚糖酶穩(wěn)定性影響，其研究結(jié)果表明加入多羥基化合物能提高β-甘露聚糖酶的相對酶活，還能夠提高β-甘露聚糖酶的半衰期。趙偉超等[21]的研究發(fā)現(xiàn)甘油、葡萄糖和明膠能夠有效促進重組普魯蘭酶的穩(wěn)定性。本實驗也得到了同樣的結(jié)論，加入甘油、肌醇和山梨醇這類多羥基化合物能提高漆酶在溶液中的穩(wěn)定性。溶液pH值變化時會導致漆酶分子內(nèi)部基團所帶電荷發(fā)生變化，靜電作用會使漆酶構(gòu)象發(fā)生變化，同時溶液pH值的變化也會誘導漆酶分子肽鏈伸展，使原本在疏水環(huán)境中的氨基酸殘基暴露于溶液中，進而導致漆酶失活。本次選擇的3種添加劑能在溶液中與漆酶形成氫鍵，正是由于這些氫鍵的存在，使得當溶液pH值變化時漆酶仍能夠保持正確的空間結(jié)構(gòu)。因此，加入添加劑能夠提高漆酶的酸堿穩(wěn)定性。綜上，添加劑對漆酶的保護效果與添加劑的種類和濃度有關，本次采用的3種添加劑能在溶液中與漆酶分子間形成氫鍵，氫鍵的存在能夠提高漆酶的穩(wěn)定性。通過考察添加劑對漆酶穩(wěn)定性的影響，分析添加劑對漆酶的影響機理，為添加劑提高漆酶的穩(wěn)定性提供參考。

[1] 羅爽,謝天,劉忠川,等.漆酶/介體系統(tǒng)研究進展[J].應用與環(huán)境生物學報,2015,21(6):987-995.

[2] 劉家揚,焦國寶,有小娟,等.真菌漆酶的性質(zhì)、生產(chǎn)及應用研究進展[J].生物技術(shù)通報,2016,32(4):24-33.

[3] WANG Chun-xing,ZHANG Hui-ling,REN Da-jun,et al.Effect of direct-current electric field on enzymatic activity and the concentration of Laccase[J].Indian Journal of Microbiology,2015,55(3):278-284.

[4] 羅貴民.酶工程[M].北京:化學工業(yè)出版社,2016:205-214.

[5] 賈曉龍.逆環(huán)境條件下多元醇對纖維素酶穩(wěn)定性的影響研究[D].大連:大連工業(yè)大學,2014:28-34.

[6] 陳亦,辛瑜,楊海麟,等.保護劑對膽固醇氧化酶穩(wěn)定性機理的研究[J].食品與生物技術(shù)學報,2013,32(6):661-666.

[7] 葉雙雙,周麗,周哲敏.基于保護劑篩選及優(yōu)化策略提高苯丙氨酸羥化酶熱穩(wěn)定性[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(6):56-61.

[8] 吳丹,徐桂英.光譜法研究蛋白質(zhì)與表面活性劑的相互作用[J].物理化學學報,2006,22(2):254-260.

[9] 劉彩琴,阮暉,傅明亮,等.提高α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(11):26-29.

[10] 何為,詹懷宇,王習文,等.一種改進的漆酶酶活檢測方法[J].華南理工大學學報(自然科學版),2003,31(12):46-50.

[11] 寧愛民,侯大年,陳俊強,等.導數(shù)紫外光譜法研究牛血清白蛋白與十二烷基硫酸鈉的相互作用[J].河南科學,2012,30(10):1 430-1 434.

[12] 寧愛民,孟磊,趙仲麟,等.牛血清白蛋白與十二烷基硫酸鈉作用的機理[J].物理化學學報,2013,29(12):2 639-2 646.

[13] 仝艷軍,辛瑜,楊海麟,等.肌氨酸氧化酶的酶學性質(zhì)及失活機理[J].食品與生物技術(shù)學報,2015,34(12):1 239-1 247.

[14] SHI Xiao-yu,ZHANG Li-li,WU Feng,et al.Kinetics for Cu2+induced Sepia pharaonis,arginine kinase inactivation and aggregation[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,91(999):926-933.

[15] 席加富,唐蕾,張建華,等.圓二色譜表征芥藍抗壞血酸過氧化物酶變性過程中的結(jié)構(gòu)變化[J].光譜學與光譜分析,2014(11):3 062-3 065.

[16] CARY P D,KNEALE G G.Circular dichroism for the analysis of protein-DNA interactions[M].DNA-Protein Interactions:Principles and Protocols,2015:339.

[17] 王春杏.電場對漆酶屬性的影響規(guī)律研究[D].武漢:武漢科技大學,2016.

[18] 惠特福德.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能[M].北京:科學出版社,2008:20-56.

[19] 楊小民,楊基礎.不同糖對纖維素酶保護的機理研究[J].清華大學學報(自然科學版),2000,40(2):55-58.

[20] 劉朝輝,武偉娜,劉躍,等.保護劑提高β-甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性的研究[J].天津大學學報,2008,41(1):114-118.

[21] 趙偉超,聶堯,穆曉清,等.采用復合保護劑提高重組普魯蘭酶穩(wěn)定性[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015,41(5):48-53.

Effectandprotectionmechanismofadditivesonacid-basestabilityoflaccase

HE Xiao-yong,REN Da-jun*,DENG Zhi-qun,LIU Hai,ZHANG Shu-qin,ZHANG Xiao-qing

(College of Resources and Environmental Engineering,Wuhan University of Science and Technology,Wuhan 430080,China)

In order to improve the stability of laccase,the effects of three additives (glycerol,inositol and sorbitol) on the acid-base stability of laccase were studied,and the protection mechanism of the additives on laccase was analyzed by UV spectroscopy,fluorescence spectroscopy and circular dichroism.The results indicated that the protective effect of the additives on laccase was related to the type and concentration of the additives.When the concentration of inositol was 0.2 mol/L in buffer at pH=3,the relative activity of laccase reached the maximum (125%).With increasing of the concentration of glycerol or sorbitol,the relative activity of laccase increased gradually.When the concentration was 0.6 mol/L,glycerol increased the relative activity of laccase by 29%,and sorbitol increased the relative activity of laccase by 15%.The optimum pH range for laccase should be pH 2 to 5,and use of additives could improve the acidity of laccase.Spectral analysis showed that these additives could form hydrogen bonds with laccase molecules in the solution,resulting in the improvement on the acid-base stability of laccase.

laccase; stability; additives; protection mechanism

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015196

碩士研究生(任大軍教授為通訊作者，E-mail：dj_ren@163.com)。

國家自然科學基金面上項目(41571306)

2017-07-14，改回日期：2017-08-29