Bacillus cereus MBL13-U膠原蛋白酶的分離純化及其降解動力學分析

劉麗莉，楊陳柳，李玉，梁嚴予，李丹，孟圓圓，代曉凝

(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471023)

BacilluscereusMBL13-U膠原蛋白酶的分離純化及其降解動力學分析

劉麗莉*，楊陳柳，李玉，梁嚴予，李丹，孟圓圓，代曉凝

(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471023)

膠原蛋白；純化；骨膠原蛋白酶；動力學；降解

我國的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，如何有效利用畜禽屠宰后的副產(chǎn)物，成為近年來的研究熱點。利用酶技術(shù)對我國來源廣泛的畜禽骨資源進行深加工，既解決了大量畜禽骨骼的浪費問題，又帶來了一定的經(jīng)濟效益[1-2]。膠原蛋白酶是通過膠原的解螺旋作用降解膠原蛋白卻不作用于其他蛋白底物的酶類。膠原蛋白肽是膠原蛋白經(jīng)降解后所得的小肽混合物,其具有相對分子質(zhì)量小、易吸收、抗氧化、降血壓、增強免疫力等諸多生理活性[3-4]。從來源上，膠原蛋白酶可分為微生物膠原蛋白酶和動物膠原蛋白酶，而微生物源的膠原蛋白酶因其高酶活等優(yōu)點被廣泛采用，如FERREIRA等[5]通過曲霉菌生產(chǎn)膠原酶，并對所產(chǎn)酶分離純化及酶學特性研究。NAGANO等[6]從枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基的上清液中分離膠原酶，研究酶純化后的特異性。ABFALTER等[7]從蠟狀芽孢桿菌ATCC 14579中克隆出膠原酶ColA基因并對其表達機制進行研究。在工業(yè)開發(fā)中膠原蛋白酶可應用于膠原蛋白分級降解獲得膠原多肽，而由于骨骼中主要的蛋白質(zhì)為膠原蛋白，因此選用專用的膠原蛋白酶進行酶解則具有很高的研究價值。

蛋白的降解過程是集復雜和多樣于一體的過程[8-10]，不同的蛋白酶和降解條件都會對蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)生很大的影響，很難在生產(chǎn)應用上掌握和調(diào)控蛋白的降解過程。因此，從反應機理出發(fā)，推導描述蛋白質(zhì)降解過程規(guī)律的動力學關(guān)系，得出動力學參數(shù)，建立符合實驗數(shù)據(jù)的實驗模型，對于蛋白質(zhì)降解過程的深入理解有重要意義[11-12]。本研究以課題組篩選的菌種BacilluscereusMBL13-U為出發(fā)菌種，將其粗酶液依次采用多種分離純化步驟，純化出一種特異降解牛骨膠原蛋白的酶，并對其特性進行了相關(guān)分析。同時，參照相關(guān)研究[13-15]，以米氏方程為基礎(chǔ)，針對骨膠原蛋白酶(bone-specifi collagenase,BSC)降解牛骨膠原蛋白的動力學進行探討，從而構(gòu)建出降解牛骨膠原蛋白的動力學模型。該項研究為新型膠原蛋白酶源的開發(fā)及其未來開發(fā)應用奠定了科學理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛腿骨,洛陽老城區(qū)農(nóng)貿(mào)市場； 牛跟腱Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白,DEAE瓊脂糖凝膠FF，上海源葉生物有限公司；牛血清白蛋白，眾一生物公司；葡聚糖凝膠G100，上海藍季科技；甲醛、HCl、NaOH,洛陽昊化化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

THZ-130B恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學儀器有限公司；高速冷凍離心機，湖南湘儀儀器有限公司；紫外分光光度計，上海精密儀器有限公司；BS-100A自動部分收集器、BT-100數(shù)顯恒流泵、TH-500梯度混合儀，上海青浦滬西儀器廠；電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 牛骨膠原蛋白的制備

新鮮牛骨→除雜→切塊(5～6 cm)→高壓蒸煮(121 ℃，0.1 kPa)→脫脂、脫鈣(0.48% HCl) →水洗→烘干→粉碎(40目篩)→牛骨膠原蛋白[16]

1.3.2 BSC粗酶液的制備

參照課題組前期實驗確定的最佳產(chǎn)酶條件進行培養(yǎng)菌種[17]，將B.cereusMBL13-U以4 mL/100mL的接種量接種于pH 6.4的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35 ℃，160 r/min的條件下反應46 h，以14 800g離心力，4 ℃高速離心25 min，收集上清液即為BSC的粗酶液M1樣。

1.3.3 BSC的分離純化

向M1樣中緩慢加入(NH4)2SO4，使其溶液飽和度達到30%，4 ℃靜置8 h后，在離心力為14 800g，4 ℃條件下高速離心25 min，接著向上清液中加入(NH4)2SO4，使其溶液飽和度達到75%，采取同樣方法離心，收集沉淀；沉淀用去離子水溶解離心，將上清液移入透析袋內(nèi)，4 ℃，2～3 h更換一次去離子水，將透析后的去離子水用BaCl2檢測，直到檢測不出沉淀，透析結(jié)束。透析后冷凍干燥得到M2樣。然后將M2樣溶液用DEAE-Sepharose Fast Flow離子層析柱進行洗脫，洗脫速度為0.8 mL/min，按4 mL/管，定時5 min的速度收集洗脫液，得到M3樣[18]。取M3樣溶液1 mL加入Sephadex G-100凝膠層析柱進行洗脫，洗脫速度為0.5 mL/min，按2.5 mL/管，5 min的速度收集洗脫液，收集酶活較高的部分，干燥后得到BSC的純品。

1.3.4 BSC分子質(zhì)量及純度鑒定

BSC的分子量及純度鑒定采用SDS-PAGE垂直電泳法[19]進行分析，本試驗選擇的分離膠為10%，濃縮膠為5%。

1.3.5 不同蛋白酶對牛跟腱I型膠原蛋白的作用對比

分別將BSC、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶作用于牛跟腱I型膠原蛋白上，在溫度為50 ℃和pH 6.5條件下反應6 h后，沸水浴5 min，冷卻后離心取上清液，對其進行水解度測定。

1.3.6 BSC的底物特異性

將BSC分別作用于牛血清白蛋白，牛跟腱I型膠原蛋白、牛跟腱II型膠原蛋白、牛跟腱Ⅲ型膠原蛋白，在溫度為50 ℃和pH 6.5條件下反應6 h后，沸水浴5 min，冷卻后離心取上清液，分別測其水解度。

1.3.7 BSC降解牛骨膠原蛋白過程中蛋白降解動力學分析

1.3.7.1 BSC降解牛骨膠原蛋白過程監(jiān)測

將分離純化出的BSC作用于牛骨膠原蛋白，研究降解過程中酶添加量(0.12、0.22、0.32、0.42 g/100 mL)和牛骨膠原蛋白添加量(4.14、5.14、6.14、7.14 g/100 mL)對水解度的影響。其中，調(diào)節(jié)反應液至pH 6.5，將其置于恒溫培養(yǎng)搖床中在46 ℃的條件下反應8 h，分別在每隔30 min對應的反應時間下將反應液沸水浴滅酶15 min，以6 570g的離心力離心15 min，得上清液測其水解度。

1.3.7.2 BSC降解牛骨膠原蛋白過程中蛋白降解動力學模型的構(gòu)建

通過BSC降解牛骨膠原蛋白中不同BSC添加量和牛骨粉添加量對其水解度的影響，根據(jù)各研究學者前期的模型構(gòu)建，結(jié)合本試驗的相關(guān)參數(shù)，推導出符合本研究BSC降解牛骨膠原蛋白過程中蛋白降解動力學的模型，并對該模型進行驗證試驗，以確保模型的有效性。

1.4 測定方法

(1)BSC酶活的測定：茚三酮顯色法[20]。

(2)BSC的蛋白質(zhì)含量的測定：Bradford法[20]。

圖1為利用Origin 8.5得到的牛血清白蛋白標準曲線。牛血清白蛋白標準曲線的回歸方程為y=0.021 85x+0.065 75，R2=0.994 13。

圖1 牛血清白蛋白標準曲線Fig.1 The standard curve of bovine serum albumin

(3)水解度的測定：甲醛-電位滴定法[21]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSC分離純化結(jié)果

將(NH4)SO4沉淀后的M2樣進行DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析的分離純化，結(jié)果如圖2。

圖2 BSC的DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析圖Fig.2 The DEAE-Sepharose fast flow ion exchange chromatography of BSC

圖2中結(jié)果表明，整個M2樣的洗脫時間為260 min，期間共出現(xiàn)了30～75 min的洗脫峰I、85～150 min的洗脫峰II、170～235 min的洗脫峰Ⅲ3個明顯分離的洗脫峰，分別對這3個明顯的洗脫峰進行膠原蛋白酶酶活的檢測，發(fā)現(xiàn)僅在洗脫峰Ⅲ的時間范圍內(nèi)檢測出了膠原蛋白酶酶活，證明在170～235 min洗脫時間內(nèi)分離出的為BSC，為了保證BSC的純度，收集180～185 min內(nèi)的洗脫液，此時NaCl的濃度為0.57 mol/L左右，此范圍內(nèi)收集的BSC活達到最高，重復多次試驗，收集BSC洗脫液，于真空冷凍干燥箱內(nèi)干燥得M3樣。將M3樣進行Sephadex G-100凝膠層析，如圖3所示。

圖3 BSC的Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.3 The sephadex G-100 gel chromatogram of BSC

由圖3可知，M3樣的洗脫時間為230 min，在整個分離純化期間共出現(xiàn)了2個完全分離的洗脫峰，洗脫峰I、II出現(xiàn)的時間為40～80 min和120～200 min，分別對洗脫峰I和II中的各管BSC的洗脫液進行酶活檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在洗脫峰II的時間范圍內(nèi)檢測出了膠原蛋白酶酶活，證明在120～200 min的洗脫時間內(nèi)分離純化出的為BSC，為了保證BSC的純度，我們選取155～165 min內(nèi)的洗脫液進行收集，此范圍內(nèi)收集的BSC酶活達到最高，重復多次試驗，收集BSC洗脫液，真空冷凍干燥后的BSC純品。

由表1可知，在BSC粗酶液中總酶活為46.92×103U，蛋白質(zhì)總含量為360.92 mg，經(jīng)過(NH4)2SO4沉淀后BSC中大部分雜質(zhì)已經(jīng)除去，再經(jīng)過2次柱層析的分離純化后BSC的蛋白質(zhì)總含量為1.14 mg，總酶活為6.35×103U，比活力為5.57×103U/mg，純化倍數(shù)達到42.85倍，純化效果良好。

表1 BSC的分離純化結(jié)果Table 1 The isolation and purification results of BSC

2.2 BSC分子量及純度鑒定

分別對各步處理的BSC樣品進行SDS-PAGE純度鑒定，并對最后分離純化出的純酶進行分子質(zhì)量的測定，結(jié)果如圖4所示。

圖4表明，M2樣條帶較多，證明此時的酶液中含有較多的雜蛋白質(zhì)；M3樣僅有幾條明顯的條帶，表明M3樣大部分的雜蛋白被分離除去；當M3樣經(jīng)Sephadex G-100凝膠層析純化過后，只有1條明顯的條帶，證明此時分離純化出的BSC已達到了電泳純的程度，為BSC純酶。目前有關(guān)膠原蛋白酶的研究，如李星碩等[22]純化的膠原酶的分子質(zhì)量為100.0 kDa，龔福明等[25]從枯草芽孢桿菌中提取的膠原蛋白酶分子質(zhì)量為33.0 kDa，劉麗莉等[2]從蠟樣芽孢桿菌中的得到的蛋白酶分子質(zhì)量約為38.0 kDa，而本實驗分離純化的BSC的分子質(zhì)量約為52.0 kDa，可以認定其為一種新型的蛋白酶。

Mark—標準蛋白；1—Sephadex G-100凝膠層析后純化的BSC； 2—DEAE -Sepharose Fast Flow陰離子層析后分離的BSC； 3—(NH4)2SO4沉淀后的粗酶液圖4 BSC的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE of purified BSC

2.3 不同蛋白酶對牛跟腱I型膠原蛋白的作用對比

測定牛跟腱I型膠原蛋白在不同蛋白酶的作用下水解度的變化，結(jié)果見圖5。

圖5 不同蛋白酶對牛跟腱I型膠原蛋白的作用Fig.5 The influences of different protease on type I collagen of bovine achilles tendon

由圖5可知，5種酶降解能力為：BSC﹥胃蛋白酶﹥風味蛋白酶﹥木瓜蛋白酶﹥中性蛋白酶(p<0.05)，結(jié)果表明BSC對降解牛跟腱I型膠原蛋白的作用顯著，因此具有潛在的工業(yè)應用價值。

2.4 不同蛋白底物在BSC作用下水解度的變化

將分離純化的BSC酶作用于不同蛋白底物，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同蛋白底物對水解度的影響Fig.6 The influences of different protein substrates on the degree of hydrolysis

圖6表明，BSC酶對牛血清白蛋白沒有降解作用，而對其他3種類型的膠原蛋白都表現(xiàn)出了降解能力，特別是對I型膠原蛋白的水解度高達31%，顯著高于II、III型膠原蛋白的水解度為16%和22%(p<0.05)，因此確定BSC酶具有特異降解I型膠原蛋白的能力。

2.5 BSC降解牛骨膠原蛋白的動力學分析

2.5.1 不同BSC添加量和牛骨膠原蛋白添加量對降解過程中水解度的影響

針對不同的酶添加量和底物濃度，測定牛骨膠原蛋白的水解度變化,結(jié)果見圖7。

由圖7可知，隨著BSC和骨膠原蛋白添加量的不斷上升，水解度也逐漸提高。同時也可看出，在反應初期，兩者的降解反應速率隨著時間的延長均呈現(xiàn)出先迅速增加后變緩，最終基本保持不變。這是因為反應初期隨著時間的不斷延長，BSC與骨膠原蛋白充分結(jié)合反應，加快了反應速率，但是當?shù)竭_一定的反應時間后，BSC與骨膠原蛋白反應基本完成，反應體系達到飽和，導致反應后期反應速率基本保持不變。

圖7 酶添加量和底物濃度對降解過程中水解度的影響Fig.7 The influence of adding amount of enzyme addition and substrate concentration on DH during degradation process

2.5.2 BSC降解牛骨膠原蛋白動力學的構(gòu)建

BSC降解牛骨膠原蛋白的過程可以用Michaelis-Menten的快速平衡學說來反映[26]，他們所建立的米氏方程可以有效地描述降解反應過程的動力學，即反應用的酶(E)與作用的底物(S)作用所產(chǎn)生的中間產(chǎn)物(ES)會再生成產(chǎn)物(P)，反應過程如式(1)所示：

(1)

結(jié)合前期的許多研究學者[10,13]的數(shù)學推導，BSC降解骨膠原蛋白過程的動力學模型為：

(2)

其中:DH為水解度，%；t為降解時間，h；E0為BSC添加量，g/100 mL；S0為牛骨膠原蛋白添加量，g/100 mL；K2為降解反應速率常數(shù)項，h-1；Kd為BSC失活反應速率常數(shù)項，h-1；Km為米式常數(shù)。

令

(3)

(4)

結(jié)合(2)、(3)、(4)得出BSC降解牛骨膠原蛋白過程中蛋白降解動力學模型為：

(5)

R=αS0exp(-β×DH)

(6)

其中：R為降解速率。

2.5.3 BSC降解牛骨膠原蛋白的動力學各參數(shù)的確定

將圖7中不同的BSC和牛骨膠原蛋白添加量和不同降解時間內(nèi)水解度的變化分別帶入式(5)，利用Origin 8.5分別對其進行非線性擬合，擬合結(jié)果如表2所示。

表2 降解過程擬合結(jié)果表Table 2 The fitting results of the degradation process

由表2中的數(shù)據(jù)可以得出式(5)中對應的各個參數(shù)，如表3所示。

表3 降解過程動力學參數(shù)表Table 3 The kinetic parameters of the degradation process

由表3可以得出，在恒溫條件下，隨著BSC添加量的逐漸增加，α呈現(xiàn)逐步增加的趨勢，隨著骨膠原蛋白添加量的逐漸增加，α反而逐步降低，這恰好與公式(3)相對應，α與BSC添加量成正比，與骨膠原蛋白添加量成反比，同時，在表3中可以看出，β并不隨BSC添加量和牛骨膠原蛋白添加量的變化而變化，基本在0.119 0左右的范圍內(nèi)，由公式(4)中可以看出，在設定相同溫度反應體系的前提下，β可當作常數(shù)。

由式(3)可知，α與BSC添加量和牛骨膠原蛋白添加量的比值呈線性關(guān)系，采用Origin 8.5對表3中E0/S0，α的結(jié)果進行線性擬合，得出結(jié)果為：

(7)

其中:R2為0.956 8。

將式(7)與式(3)結(jié)合，可得K2為583.816 3 h-1。

將α，β帶入式(6)，得出所構(gòu)建的BSC降解牛骨膠原蛋白過程中蛋白降解動力學模型為：

(8)

R=(583.813 6E0+1.296 7S0)exp(-0.119 0DH)

(9)

由張輝[10]的結(jié)果可知，

K4=KdKm

(10)

其中：K4為BSC降解牛骨膠原蛋白過程中BSC失活常數(shù)(h-1)。

將式(7)帶入式(3)和式(4)得：

(11)

由式(11)可知，α、β的乘積與BSC添加量和牛骨膠原蛋白添加量的比值呈線性關(guān)系，采用Origin 8.5對表3中E0/S0，αβ的結(jié)果進行線性擬合，得出結(jié)果為：

(12)

其中：R2為0.942 7。

由式(12)可以得出，BSC降解牛骨膠原蛋白過程中BSC的失活常數(shù)K4為64.115 7 h-1。

2.5.4 BSC降解牛骨膠原蛋白的動力學模型驗證

為了驗證本模型，在反應溫度46 ℃、牛骨膠原蛋白添加量5.14 g/100 mL、酶添加量0.42 g/100 mL、pH 6.5的條件下分別測得不同反應時間的水解度變化。如圖8所示，與模型擬合值基本吻合，相對誤差為0.45%，表明此模型能較好地描述牛骨膠原蛋白的降解過程，具有實際的應用價值。

圖8 水解動力學模型驗證Fig.8 Validation of hydrolysis kinetic model

3 結(jié)論

本研究從課題組篩選到的菌株BacilluscereusMBL13-U的粗酶液中，通過(NH4)2SO4分級沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析、Sephadex G-100凝膠層析，得到分子質(zhì)量為52.0 kDa的BSC酶，其比活力為5.57×103U/mg，純化倍數(shù)達到42.85倍，得率為 13.53%。經(jīng)底物特異性分析該酶為骨膠原蛋白酶，對I型膠原蛋白具有顯著的水解能力。通過對比試驗表明其降解I型膠原蛋白的能力顯著優(yōu)于常用的蛋白酶。通過對不同的BSC添加量和牛骨膠原蛋白添加量對骨膠原蛋白降解過程中水解度影響，建立BSC降解牛骨膠原蛋白的動力學模型。同時得出BSC降解牛骨膠原蛋白過程中BSC的失活常數(shù)K4為64.1157/h。通過驗證試驗確定所建模型與實驗值基本吻合，誤差較小，具有較高的利用價值，為今后大規(guī)模生產(chǎn)提供良好的理論支持。

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PurificationofBacilluscereusMBL13-Ucollagenaseanddegradationkineticsofcollagen

LIU Li-li1*,YANG Chen-liu,LI Yu,LIANG Yan-yu,LI Dan,MENG Yuan-yuan,DAI Xiao-ning

(College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)

collagen; purification; bone specific collagenase(BSC); kinetics; degradation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015222

博士,副教授(本文通訊作者，E-mail：yangliuyilang@126.com)。

國家自然科學基金(31401622)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303084)；河南省重點攻關(guān)項目(152102110080)；河南省教育廳自然科學研究項目(13A550255)；河南省重大專項(161100110900)

2017-07-17，改回日期：2017-09-01