25羥基維生素D檢測方法的可靠性分析

趙蓓蓓 程雅婷 董 衡 李卓陽 李冰玲 1. 廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗學(xué)院；. 廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司（廣東廣州 510005）

25羥基維生素D檢測方法的可靠性分析

趙蓓蓓1,2程雅婷1,2董 衡2李卓陽2李冰玲21. 廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗學(xué)院；2. 廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司（廣東廣州 510005）

維生素D不僅在人體鈣磷代謝和骨質(zhì)鈣化中起著重要作用，而且與2型糖尿病、乳腺癌、高血壓等重大疾病有著密切關(guān)系[1,2]。然而，目前維生素D缺乏卻是一個日益嚴重的全球性問題[3]，全球有近10億人維生素D不足或缺乏[4]，中國上海有近三分之一的人維生素D不足[4,5]。維生素D缺乏將導(dǎo)致佝僂病、軟骨病和骨質(zhì)疏松等疾病，同時多項研究表明維生素D的營養(yǎng)水平若不能維持在最佳范圍內(nèi)，將會增加罹患糖尿病、高血壓、乳腺癌等疾病的風(fēng)險；而過量攝入維生素D者將會導(dǎo)致中毒，因此準(zhǔn)確檢測人體維生素D營養(yǎng)水平越來越受到重視。

在維生素D的體內(nèi)代謝物中，25羥基維生素D（25OHD）由于其在血液中的濃度高且循環(huán)周期長而成為人體維生素D營養(yǎng)評估的最佳檢測指標(biāo)。維生素D主要有維生素D2和維生素D3兩種存在形式，因此準(zhǔn)確反映人體維生素D的營養(yǎng)水平，需同時檢測血清25OHD2和25OHD3兩項指標(biāo)，以兩者之和，即血清25OHD的總量來準(zhǔn)確反映人體維生素D營養(yǎng)水平。目前25OHD的檢測有多種分析技術(shù)和方法，按原理可分為色譜質(zhì)譜法和免疫學(xué)法。不同的方法學(xué)間由于檢測原理和檢測系統(tǒng)的差異，在實際檢測過程中可靠性存在明顯差異[6]。

為了解決25OHD檢測一致性的問題，2010年9月美國健康研究署膳食攝入部成立了維生素D標(biāo)準(zhǔn)化項目（Vitamin D Standardization Program，VDSP），其主要目的是通過對25OHD檢測的標(biāo)準(zhǔn)化，促進維生素D缺乏和不足的檢測、評估及補充治療的標(biāo)準(zhǔn)化[7]。為了達到這一目的，VDSP在世界范圍內(nèi)建立了25OHD檢測的參考方法系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）和參考測量程序（Reference Measurement Procedures，RMPs）的結(jié)果被認為是真值。在真值的基礎(chǔ)上成立了兩類標(biāo)準(zhǔn)化機構(gòu)，分別為美國疾病與預(yù)防控制中心（Centers for Disease Control，CDC）成立的維生素D標(biāo)準(zhǔn)化項目（Vitamin D Standardization Certification Program，VDSCP）和基于準(zhǔn)確度的定量保障項目（Accuracy-Based Quality Assurance Programs，ABQAP）。VDSCP由美國疾病與預(yù)防控制中心發(fā)起，主要針對25OHD檢測試劑生產(chǎn)廠商和大型的第三方獨立醫(yī)學(xué)實驗室，并將參加機構(gòu)的25OHD檢測結(jié)果與RMPs結(jié)果進行比較；ABQAP分別由美國病理學(xué)專家協(xié)會（College of American Pathologists，CAP）和英國維生素D定量保障機構(gòu)（Vitamin D External Quality Assessment Scheme，DEQAS）分別發(fā)起，主要針對普通的醫(yī)學(xué)檢測實驗室和研究實驗室，并將參加機構(gòu)的25OHD結(jié)果與NIST結(jié)果進行比較。

1 基于室間質(zhì)量評價結(jié)果再分析不同檢測方法的可靠性

據(jù)DEQAS報告顯示，截止到2015年11月，已有來自53個國家超過2 100家實驗室參加25OHD的室間質(zhì)評項目，參與的檢測方法種類超過26種[8，9]。其中上報參與評估的檢測方法中，數(shù)量最多的4種方法依次是DiaSorin Liaison Total、IDS-iSYS、LC-MS/MS Method、Roche Total。使用LC-MS/MS 法的參評實驗室超過150家[10]，而且使用LC-MS/MS 法參評的實驗室有逐年增加的趨勢。DEQAS針對25OHD項目所提供的室間質(zhì)量評價（External Quality Assessment，EQA）樣本基質(zhì)，來源于接受放血治療的血色病或紅細胞增多癥患者（采血經(jīng)過患者知情同意，經(jīng)過當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會和英國衛(wèi)生部批準(zhǔn)）；為了研究基質(zhì)效應(yīng)、基質(zhì)干擾等因素，對不同方法學(xué)檢測結(jié)果的影響，DEQAS會選擇性地在某些EQA樣本中，加入某些干擾物質(zhì)。同時，DEQAS自2013年4月開始，在其提供的報告中會體現(xiàn)NIST的結(jié)果供參評實驗室進行全面評估。

DEQAS通過匯總25OHD室間質(zhì)量評價結(jié)果[8-10]，再分析后得出如下結(jié)果：①在EQA樣本中總25OHD濃度相近的情況下，大部分免疫學(xué)方法對中度脂血樣本（三甘油酸酯的濃度為4.0 mmol/L）的檢測結(jié)果與NIST結(jié)果相比，會有明顯的負偏倚。相對免疫學(xué)方法而言，HPLC和LC-MS/MS法的結(jié)果與NIST結(jié)果偏倚較小。免疫學(xué)方法的中度脂血樣本檢測結(jié)果與NIST結(jié)果的差異性，與同批次其他樣本結(jié)果的變異度相比，多無顯著變化，但Abbott，Diasorin Liaison法除外。②在EQA樣本中總25OHD的濃度相近，但含有較高比例25OHD2的（27%，22.3 nmol/L）樣本中，免疫學(xué)方法的檢測結(jié)果與NIST結(jié)果相比存在負偏倚，這一偏倚情況，在Abbott，Diasorin RIA， Diasorin Liaison法中，尤其明顯。這可能是由于這些系統(tǒng)對25OHD2檢測的特異性不夠?qū)е碌摹＂墼贓QA樣本中總25OHD濃度較高的情況下，大部分免疫學(xué)方法的結(jié)果與NIST結(jié)果相比會有明顯的正偏倚，且同種免疫學(xué)方法不同實驗室間的結(jié)果變異性較大。分析原因可能與較高25OHD濃度樣本，一般含有較高濃度的24,25(OH)2D有關(guān)。24,25(OH)2D在配體結(jié)合分析中會對25OHD檢測造成嚴重的交叉反應(yīng)，使檢測結(jié)果出現(xiàn)正偏倚。當(dāng)然這一結(jié)論，DEQAS認為有待持續(xù)準(zhǔn)確地分析24,25(OH)2D的檢測結(jié)果后，進一步證實。④從同種方法學(xué)的25OHD檢測結(jié)果均值與NIST結(jié)果的偏倚情況看，HPLC和LC-MS/MS法的結(jié)果偏倚在－10%～15%范圍內(nèi)波動，而大部分的免疫學(xué)方法的結(jié)果偏倚在－30%～40%范圍內(nèi)波動，反映出免疫學(xué)方法的室間變異性明顯大于色譜質(zhì)譜法。

據(jù)CAP的結(jié)果報告顯示，截止到2015年共有超過400家實驗室參加CAP的ABVD（Accuracy-Based Vitamin D）項目[11]。此項目提供來自于美國CDC的參考值。參評的實驗室中，使用免疫學(xué)方法如Abbott Architect、DiaSorin Liaison Total、Roche cobas、Siemens Diagnostics等的實驗室約占80%，分別為16.1%、15.1%、15.9%、22.5%；使用LC-MS/MS法的實驗室占19.3%（60余家），且亦有逐年增加的趨勢。CAP自2013－2014年總共提供了12個室間質(zhì)評樣本，并從2015年開始重新提供了這12個室間質(zhì)評樣本，同時在之前提供25OHD3、25OHD2的美國CDC參考值的基礎(chǔ)上，增加了3epi-25OHD3的結(jié)果。CAP所提供的25OHD項目的EQA樣本基質(zhì)，來源于數(shù)個捐獻者的新鮮冰凍血清，部分捐獻者抽血前服用維生素D2（采血經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)）。

CAP通過匯總室間質(zhì)量報告[11-12]得出如下結(jié)果：①不同的檢測方法結(jié)果均值與美國CDC的參考值相比，偏倚有明顯的差異，但總體而言LC-MS/MS法結(jié)果的偏倚最小，且不同EQA標(biāo)本間的偏倚變化也最小。②含有25OHD2的EQA樣本檢測結(jié)果，與美國CDC參考值的偏倚，高于不含25OHD2的EQA樣本的結(jié)果偏倚，這一變化在Abbott Architect、DiaSorin Liaison Total、Roche cobas法中體現(xiàn)的尤為明顯。

2 基于44例體檢者樣品的不同檢測方法25OHD結(jié)果可靠性分析

隨機選取2014年7月至2015年2月期間，在廣州金域體檢中心進行體檢的44例健康體檢者，抽取全血各1.0 mL，置于－4℃保存。將同一體檢者的血清樣品，在同一天內(nèi)，分別采用LC-MS/MS法和Roche、Siemens兩種免疫學(xué)方法，進行檢測及比對分析。其中本實驗室的LC-MS/MS法經(jīng)過了嚴格的方法學(xué)驗證，并參與了DEQAS和CAP的EQA項目。

44份血清樣品檢測所用的儀器和試劑：API4000液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Sciex公司）；Cobas e601全自動免疫分析儀（羅氏公司）； ADVIA Centaur XP全自動免疫分析儀（西門子公司）；Milli-Q Gradient 超純水機；雅培25羥基維生素D檢測試劑盒；羅氏總25羥基維生素D檢測試劑盒；甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純，購自德國默克公司；25OHD2和25OHD3標(biāo)準(zhǔn)品均購自西格瑪中國有限公司。

在收集體檢者樣本周期內(nèi)，LC-MS/MS方法EQA結(jié)果與對應(yīng)機構(gòu)提供的參考結(jié)果的分析數(shù)據(jù)見表1和2。本實驗室采用LC-MS/MS法檢測的25OHD結(jié)果與NIST和CDC結(jié)果偏倚在10%以內(nèi)，說明所用LC-MS/MS方法的準(zhǔn)確度較好。

44份血清樣品基于本實驗室3種檢測方法所得的檢測數(shù)據(jù)及偏倚分析情況見表3、圖1。圖1中圓圈標(biāo)識的是樣品中25OHD2的濃度＞10 ng/mL的檢測結(jié)果。由圖1可知，Roche和Siemens法的檢測結(jié)果與LC-MS/MS法的差異較大，且不同的樣本基質(zhì)結(jié)果之間差異沒有規(guī)律可循，偏倚在－60%～30%不等。這一結(jié)果與DEQAS的結(jié)果“大部分的免疫學(xué)方法的結(jié)果與NIST結(jié)果相比偏倚在－30%～40%范圍內(nèi)波動”相吻合；但在實際樣品檢測中，這一偏倚的波動范圍更大。結(jié)合表2和圖1，Siemens的結(jié)果整體波動性比Roche要大，且在大多數(shù)樣本中，呈現(xiàn)出比Roche結(jié)果偏倚更大的趨勢。圖1圓圈標(biāo)識的含有較高25OHD2的樣品的檢測結(jié)果，與LC-MS/MS法相比，偏倚并沒有呈現(xiàn)出更大的趨勢。這一結(jié)果與DEQAS和CAP的結(jié)論中25OHD2含量增加時，免疫學(xué)法結(jié)果與參考值偏倚更大的情況不相符。這可能是由于在實際樣品檢測過程中，不同樣本基質(zhì)對免疫學(xué)法造成的影響，遠大于25OHD2濃度增高所帶來的影響所致。而這一情況的存在，當(dāng)連續(xù)進行25OHD治療的患者的血清基質(zhì)發(fā)生較大變化時，免疫學(xué)法可能無法正確反映治療方案的真實情況。

表 1 本實驗室LC-MS/MS法25OHD結(jié)果與NIST結(jié)果比較分析

表 2 本實驗室LC-MS/MS方法25OHD結(jié)果與CDC結(jié)果比較分析

圖1 基于臨床患者25OHD結(jié)果的Roche、Siemens與LC-MS/MS法的偏倚分析

表 3 44例體檢者標(biāo)本分別采用LC-MS/MS和Roce、Simens法檢測25OHD的結(jié)果比較分析

結(jié)合圖1和圖2綜合分析，Roche和Siemens法與LC-MS/MS方法的偏倚波動范圍在檢測實際樣品時，遠大于在EQA樣本檢測中的波動范圍。這可能是由于EQA結(jié)果是基于多家實驗室均值的比較，在一定程度上減弱了室間差異和基質(zhì)差異帶來的變異。同時從檢測結(jié)果可以看出，Roche和Siemens法與LC-MS/MS方法相比，結(jié)果變異性隨基質(zhì)的不同差異較大，尤其是Siemens法的偏倚在很多樣品中超過25%，甚至達到55%以上，這表明這兩種方法在部分樣本品檢測中，準(zhǔn)確度可能達不到要求。

圖2 基于EQA結(jié)果的Roche、Siemens與LC-MS/MS法的偏倚分析

由于所選取的44份樣品未有脂血狀況，所以未能驗證DEQAS關(guān)于大部分免疫學(xué)方法對中度脂血樣結(jié)果偏低的結(jié)論；且本次LC-MS/MS法未能同時檢測24,25(OH)2D的結(jié)果，所以也未能反映和評估DEQAS關(guān)于在總 25OHD較高時，大部分免疫學(xué)方法樣本結(jié)果偏高的結(jié)論。同時隨機抽取的44例體檢者樣品的25OHD在29.4～65.2 ng/mL之間，基本落在25OHD的最佳濃度水平范圍內(nèi)，沒有覆蓋臨床較低濃度和較高濃度，因此研究結(jié)論可能存在一定的局限性。

綜上所述，在檢測血清25OHD時，采用免疫學(xué)方法，可能受基質(zhì)和25OHD體內(nèi)代謝物的影響較大，這一影響會因樣品基質(zhì)的復(fù)雜性而放大，且可能存在對某些樣品檢測的準(zhǔn)確度不夠的情況。而LC-MS/MS方法較免疫學(xué)方法，與NIST結(jié)果和CDC參考值的偏倚較小，且受基質(zhì)和25OHD內(nèi)源性待測物的影響較小，因此可靠性更好。

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2016年廣州市科技計劃項目(201604020091)

李冰玲 電子信箱：libingling@Kingmed.com.cn

2017-07-03）

鄒 強）