Balb/c3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化電化學(xué)試驗(yàn)方法的研究①

朱金玲，武冬梅，李錦蓮，王景濤

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007； 2.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

Balb/c3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化電化學(xué)試驗(yàn)方法的研究①

朱金玲1，武冬梅2，李錦蓮2，王景濤1

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007； 2.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：利用伏安行為的電化學(xué)方法研究Balb/c3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中嘌呤核苷酸代謝變化規(guī)律，確定細(xì)胞轉(zhuǎn)化的電化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。方法：利用MNNG與TPA誘導(dǎo)Balb/c3T3細(xì)胞體外進(jìn)行轉(zhuǎn)化，同時(shí)利用ITEs進(jìn)一步加速轉(zhuǎn)化效率，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)及伏安行為電化學(xué)檢測(cè)，電化學(xué)法跟蹤BALB/c3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中嘌呤含量的變化。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)第10天開始，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嘌呤的信號(hào)峰值明顯高于對(duì)照組(DMSO組)，細(xì)胞內(nèi)嘌呤含量增多，同時(shí)細(xì)胞增殖加速。ITEs可縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間。結(jié)論： 嘌呤可作為電化學(xué)法檢測(cè)的生物標(biāo)記物，伏安行為的的電化學(xué)法可以快速檢測(cè)體外細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程，與傳統(tǒng)方法相比，縮短了檢測(cè)周期，有望成為一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏、低成本的細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測(cè)新手段。

細(xì)胞電化學(xué)；Balb/c3T3細(xì)胞；細(xì)胞轉(zhuǎn)化

國(guó)際癌癥中心指出，80%～90%的人類腫瘤是由環(huán)境致癌物引起的，目前有效的篩選和檢測(cè)環(huán)境污染物的方法，主要包括Ames 致突變?cè)囼?yàn)、染色體畸變?cè)囼?yàn)、微核試驗(yàn)、單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(即彗星試驗(yàn))、體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)等，其中體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)被認(rèn)為是一種有效的篩選致癌物的方法[1]。但該實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)終點(diǎn)是通過(guò)細(xì)胞形態(tài)的變化決定的，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)且結(jié)果主觀性強(qiáng)。因此建立新的細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測(cè)的方法成為急需解決的問(wèn)題。

細(xì)胞電化學(xué)[2,3]是當(dāng)代生物技術(shù)與微電子技術(shù)、化學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)等多學(xué)科結(jié)合的產(chǎn)物。近年來(lái),人們開始注意活細(xì)胞的電化學(xué)識(shí)別與檢測(cè), 鞠熀先[2]等提出完整細(xì)胞伏安信號(hào)來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)鳥嘌呤快速通過(guò)細(xì)胞膜后在電極表面發(fā)生的氧化反應(yīng)，使用細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)信號(hào)能夠從核苷酸代謝角度反映細(xì)胞活性。本課題組研究了活細(xì)胞電化學(xué)響應(yīng)機(jī)理，發(fā)現(xiàn)完整細(xì)胞的電化學(xué)信號(hào)來(lái)源于細(xì)胞外分泌物中鳥嘌呤和黃嘌呤的氧化反應(yīng)，細(xì)胞裂解后得到的細(xì)胞質(zhì)伏安信號(hào)遠(yuǎn)高于完整細(xì)胞，并能更客觀地反映細(xì)胞的活性[4～6]。細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化過(guò)程中，DNA復(fù)制增加，細(xì)胞增殖速度劇增，核苷酸代謝旺盛，導(dǎo)致嘌呤堿基相對(duì)含量異常增高。所以本實(shí)驗(yàn)利用伏安行為的電化學(xué)法對(duì)Bal/c3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，探討體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中嘌呤核苷酸代謝變化規(guī)律，確定細(xì)胞轉(zhuǎn)化的電化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞BALB/c3T3 clone A31，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品；葡萄糖、HEPES為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;N-甲基-N.-硝基-N-亞硝基胍(N-methy-lN-nitro-N-n itrosoguan id ine, MNNG)、佛波酯( 12-O-tetradecanoy-l phorbo-l 13-ace tate, TPA)、DMSO、 ITEs(牛胰島素500μg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白1000μg/mL、乙醇胺153μg/mL和亞硒酸鈉0.43μg/mL),Sigma公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖，Solarbio公司。

CHI615E 電化學(xué)工作站為上海辰華儀器有限公司產(chǎn)品；3mm玻碳電極為上海辰華儀器有限公司產(chǎn)品；多壁碳納米管多壁碳納米管(MWNT)10～20nm為深圳納米港有限公司產(chǎn)品；YCP-200 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為上海易亮醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；YJ-875SDB超凈工作臺(tái)為哈爾濱藍(lán)皓空氣凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將BALB/c3T3細(xì)胞培養(yǎng)于含有10 %的胎牛血清和1%青霉素-鏈酶素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰酶消化0.5min，調(diào)節(jié)所要細(xì)胞濃度傳代并進(jìn)行分組，然后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化和電化學(xué)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

常規(guī)轉(zhuǎn)化組：實(shí)驗(yàn)分為4組，第1組是MNNG+TPA處理組:將細(xì)胞以1×104/皿接種于直徑為60mm平皿中，37℃，5% CO2濕箱中培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)基血清濃度為10%，培養(yǎng)24h后加入MNNG 1μg/mL，4h后換培養(yǎng)基除去MNNG，繼續(xù)培養(yǎng)7d，于接種后第8天加入濃度為0.1μg /mL的 TPA繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次，同時(shí)補(bǔ)加TPA，第22天除去TPA，第27天甲醇固定細(xì)胞, 10%的Giemsa染液染色，觀察細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)化灶。第2組是MNNG+DMSO組：用0.2%的DMSO代替TPA，第3組是DMSO對(duì)照組：用DMSO代替MNNG和TPA，第4組是正常完全培養(yǎng)基組:不加任何藥品。其他方法同TPA處理組。實(shí)驗(yàn)第1、3、7、10、14、17、21天，分別取出2皿細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和電化學(xué)檢測(cè)。

改良培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化組：按常規(guī)轉(zhuǎn)化組(4組)處理的細(xì)胞在第8天添加TPA的同時(shí)加入改良的DMEM培養(yǎng)基，其中含有1%ITEs和含2%的胎牛血清，且第14天除去TPA, 第19天甲醇固定細(xì)胞，10%的Giemsa染液染色，觀察細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)化灶。實(shí)驗(yàn)第1、3、7、10、14、17、21天，分別取出2皿細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和電化學(xué)檢測(cè)。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)數(shù)

對(duì)以上8組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，利用倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4 轉(zhuǎn)化結(jié)果判定方法

值得說(shuō)明的是,關(guān)于為什么上述斜向垂直環(huán)流圈在某一時(shí)段能夠形成而在另一時(shí)段不能形成的原因則還需進(jìn)一步探索。

體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是以細(xì)胞形態(tài)惡性轉(zhuǎn)化為檢測(cè)終點(diǎn)。對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的判定通常采用細(xì)胞灶法，計(jì)數(shù)克隆數(shù)，觀察鑒定轉(zhuǎn)化灶，單盲法觀察，由2人共同認(rèn)定。轉(zhuǎn)化灶的判定標(biāo)準(zhǔn):正常細(xì)胞灶,灶內(nèi)細(xì)胞排列規(guī)則,束狀,細(xì)胞灶外圍區(qū)的細(xì)胞單層生長(zhǎng),規(guī)則。轉(zhuǎn)化細(xì)胞灶,灶內(nèi)細(xì)胞由正常的長(zhǎng)梭形變?yōu)槎趟鬆?失去接觸抑制,呈復(fù)層生長(zhǎng),排列紊亂,形成交叉和旋渦。吉姆薩染色惡性轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞嗜堿深染，致密多層，自由定向生長(zhǎng)。

1.2.5 軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)

分別制備1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌，按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入60mm平皿中，冷卻凝固，作底層瓊脂放入溫箱中備用。同樣方法將0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基按1:1比例混勻，注入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖的平皿中，形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10～14d。取出平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)。計(jì)算形成率。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)化的電化學(xué)檢測(cè)

1.2.6.1 細(xì)胞樣品的制備

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞棄掉培養(yǎng)液，并加入450μL體積的pH=7.4的PBS緩沖溶液。用封口膜封好皿口以防止水浴鍋中的水倒灌入培養(yǎng)皿中，并將其置于50℃水浴鍋中加熱30min，回收液體進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。

1.2.6.2 電極的制備及電化學(xué)檢測(cè)

電極制備參考劉慧東的方法[7]。采用三電極體系: MWNTs/GCE為工作電極,Ag/Agcl為參比電極,鉑絲電極為對(duì)電極。CV掃描范圍為0.0～1.1V,掃描速率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)吉姆薩染色結(jié)果

見(jiàn)圖1。

正常組(×100) ITES+正常組(×100)

如圖1所示，正常轉(zhuǎn)化組與改良培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化組比較，ITES組總體轉(zhuǎn)化效率提高，轉(zhuǎn)化時(shí)間縮短，且加入ITES的MNNG-TPA組惡性程度極高。

2.2 軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果

見(jiàn)表1。

表1 轉(zhuǎn)化的Balb/3T3細(xì)胞在軟瓊脂上的集落形成率

與空白對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05。與空白對(duì)照組對(duì)比，**P<0.01。

2.3 伏安行為的電化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

見(jiàn)圖2。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品的峰值相對(duì)比發(fā)現(xiàn)，各組所出現(xiàn)的氧化峰所在位置為是黃嘌呤和鳥嘌呤的氧化峰。圖2.A、B中幾乎沒(méi)有氧化峰出現(xiàn)，圖2.C個(gè)別組有低氧化峰，圖2D～G中可以發(fā)現(xiàn)每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組均有氧化峰出現(xiàn)在0.70～0.75V。且隨著時(shí)間的推進(jìn)氧化峰的峰高有明顯的升高。其中TPA+MNNG組與空白對(duì)照組，ITES+TPA+MNNG與ITES組對(duì)比峰高存在明顯的差異。而加入ITES的改良組與常規(guī)轉(zhuǎn)化組相比較，在第10天后存在差異。

3 討論

目前為止，環(huán)境致癌有兩個(gè)階段，暨啟動(dòng)劑和促癌劑。促癌劑在人類環(huán)境中存在極為廣泛，通常認(rèn)為啟動(dòng)劑可以作為DNA 誘變劑，且促癌過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)、可逆。腫瘤的環(huán)境致癌因素眾多,目前得到廣大學(xué)者認(rèn)同的是則是佛波酯轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)[8]，但是由于方法存在很多不足，所以后期有大量的學(xué)者在此基礎(chǔ)之上進(jìn)行改進(jìn)。有研究表明伏安行為的電化學(xué)信號(hào)的來(lái)源，并對(duì)其進(jìn)行電化學(xué)活性成分的分析。嘌呤堿的含量與細(xì)胞的增殖能力呈正比，所以也就可以說(shuō)嘌呤堿的變化可以反映細(xì)胞的增殖情況[2，9，10]。為此我們探討應(yīng)用電化學(xué)方法跟蹤檢測(cè)Balb/c3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中嘌呤含量的變化。 同時(shí)應(yīng)用ITEs改良培養(yǎng)基，縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)細(xì)胞的內(nèi)的鳥嘌呤和黃嘌呤的峰值發(fā)生升高。實(shí)驗(yàn)第10天開始，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嘌呤的信號(hào)峰值明顯高于對(duì)照組(DMSO組)，細(xì)胞內(nèi)嘌呤含量增多，同時(shí)細(xì)胞增殖加速，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明以嘌呤為生物標(biāo)記物，伏安行為的電化學(xué)法可以快速檢測(cè)體外細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程，與傳統(tǒng)方法相比，該方法縮短了檢測(cè)周期， 簡(jiǎn)單、快速、靈敏、成本低，有望成為細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測(cè)新手段。

圖2 A、B、C、D 、E、F、G分別為第1、3、7、10、14、17、21天的各實(shí)驗(yàn)組BALB/3T3細(xì)胞內(nèi)的嘌呤堿的變化

[1]張磊,曾毅.Balb/c 3T3細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及其在環(huán)境致癌物檢測(cè)上的應(yīng)用[J].衛(wèi)生研究,2009,38(2):226-232

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StudyonelectrochemicaltestmethodforBalb/c3T3cellstransformation

ZHUJin-ling1,WUDong-mei2,LIJin-lian2,WANGJing-tao1

(1.Basic Medical College of Jiamusi University，Jiamusi 154007,China;2.Pharmaceutical College of Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Objective: To study the metabolism variation regularity of purine nucleotide and ensure the electrochemical biomarkers during the process of Balb/c3T3 cells transformation by using electrochemical detection methods.MethodsMNNG and TPA were used to induce the transformation of Balb/c3T3 cells in vitro. The transformation efficiency was further accelerated by ITEs. At different time, the transformed cells were observed by cell morphological and soft agar cloning methods. The changes of purine level in BALB/c3T3 cells were detected by electrochemical method.ResultsFrom the 10th day of the experiment, the peak value of purine signal began significantly higher than that of the control group (DMSO group). The intracellular purine content began to increase, cell proliferation rate was accelerated, and conversion time was shortened by ITEs.ConclusionsPurine can be used as biomarker of electrochemical detection; Voltammetric behavior of the electrochemical method can quickly detect the malignant transformational process of cells in vitro; Compared with the traditional method, voltammetric behavior of electrochemical method shortened the detection period, and was expected to become a simple, sensitive, low-cost new method for cell transformation test.

cell electrochemistry; Balb/c3T3 cells;cell transformation

1.黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：H201369；2.佳木斯大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目，編號(hào)：CXTDPY-201602。

朱金玲(1967～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

Q813

A

1008-0104(2017)06-0016-03

2017-04-18)