趙亞琴,郭小娟

(山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006)

Tb3+與磷酸化人中心蛋白1作用的性質(zhì)研究

趙亞琴*,郭小娟

(山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006)

通過熒光發(fā)射光譜、微量熱等溫滴定法和熒光共振光散射方法研究了Tb3+與磷酸化人中心蛋白1(phosphorylated human centrin1,HsCen1p)的作用。結(jié)果表明,HsCen1p與Tb3+的結(jié)合比為1∶4,與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ位點(diǎn)的結(jié)合能力分別為(0.75 ± 0.40)×104, (0.70 ± 0.40)×104,(8.50 ± 0.40)×104和(1.23 ± 0.07)×105(mol/L)-1,其結(jié)合順序?yàn)棰?Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ。另外,研究了Tb3+對(duì)HsCen1p聚集性質(zhì)的影響,發(fā)現(xiàn)蛋白HsCen1p的N端結(jié)構(gòu)域在聚集過程中發(fā)揮重要作用。

磷酸化;人中心蛋白1;Tb3+

中心蛋白是EF-hand超家族蛋白成員之一,是一種分子量比較小(20 kD)的、酸性鈣離子結(jié)合蛋白,在不同的細(xì)胞過程中扮演著不同的角色。中心蛋白是微管組織中心(microtubule-organizing centers,MTOC)的組成成分,定位在MTOC的不同區(qū)域,發(fā)揮多種生物功能[1]。最初,中心蛋白是在單細(xì)胞綠藻Tetraselmisstriata和Chlamydomonasreinhardtii中作為纖維收縮的組成成分發(fā)現(xiàn)的[2-3],后來,在高等植物、酵母、脊椎動(dòng)物和人類細(xì)胞等真核生物中發(fā)現(xiàn)了中心蛋白[4]。人體中有四類不同的中心蛋白,分別為centrin1,centrin2,centrin3和centrin4(縮寫為HsCen1-HsCen4)[5]。四種人中心蛋白都與視網(wǎng)膜相互連接的鞭毛相關(guān),參與視力的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了HsCen4;HsCen3主要定位在基體和中心體末端[7];HsCen2調(diào)節(jié)DNA切除修復(fù)、信使RNA輸出[8];HsCen1 定位于精細(xì)胞的鞭毛基體,通過貢獻(xiàn)精細(xì)胞的母中心體到卵細(xì)胞允許中心體復(fù)制,因此與受精卵的第一次有絲分裂相關(guān)[9]。

蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍、最重要的機(jī)制,蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要內(nèi)容,它參與調(diào)控生物體內(nèi)的許多生命活動(dòng):調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期等諸多細(xì)胞過程[10-11]。中心蛋白磷酸化還可能用于調(diào)節(jié)中心蛋白本身與MTOC其他組分之間的相互作用,并交替調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[12-13]。已有的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)中心蛋白的高度磷酸化可能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[11,14]。蛋白激酶A對(duì)HsCen1磷酸化位點(diǎn)為絲氨酸(170位)。

中心蛋白是一種鈣結(jié)合蛋白,Tb3+與Ca2+有相似配位化學(xué)性質(zhì),因此本文使用Tb3+為熒光探針,研究了Tb3+與磷酸化人中心蛋白1的結(jié)合、對(duì)蛋白聚集性質(zhì)的影響,為人中心蛋白1功能的深入研究提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

七氧化四鋱(Tb4O7),純度達(dá)99.99%,湖南稀土金屬材料研究所;N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(Hepes),分析純,Sigma公司;其它試劑均為分析純。

定點(diǎn)突變采用試劑盒KOD-Plus-Mutagenesis kit (TOYOBO CO. LTD) (JAPAN)購于Trans Gene公司。

1.2 HsCen1的構(gòu)建、表達(dá)、純化及磷酸化

以pGEX-6p-1為表達(dá)載體、人基因組反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板、通過設(shè)定特異性引物和PCR擴(kuò)增、以BamHI和Sal I為內(nèi)切酶,在T4DNA 連接酶的作用下得到重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-HsCen1;經(jīng)過測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)中獲得人中心蛋白1的可溶性表達(dá)。蛋白純化、磷酸化方法與游仆蟲中心蛋白類似[15-16]。將純化得到的蛋白(1×10-4mol/L)與Mg2+(5.71×10-3mol/L)、ATP(1.21×10-3mol/L)、PKA(1.73 μg/μL)溶解在50 mmol/L的Tris-HCl中,30℃條件下恒溫水浴10 h,獲得磷酸化蛋白。

1.3 等溫滴定量熱法(ITC)測(cè)定

采用等溫滴定量熱法(ITC200)測(cè)定Tb3+與HsCen1p的相互作用,裝置包括兩個(gè)相同的池子,其中一個(gè)是樣品池,另一個(gè)是參比池,兩個(gè)池子維持相同的溫度,測(cè)量溫度為30℃,參比池為水溶液,樣品池為蛋白溶液(200 μL),滴定針內(nèi)為Tb3+,第一滴滴定體積0.4 μL,以后每滴滴定體積均為1 μL,為保證充分反應(yīng)每滴的間隔時(shí)間為2 min,測(cè)量得到Tb3+與HsCen1p相互作用的熱力學(xué)參數(shù)。

1.4 熒光光譜測(cè)定

使用Varian-Cary Eclipes Fluorescence Spectrophotometer熒光光譜儀測(cè)定HsCen1p突變體與Tb3+的結(jié)合,激發(fā)波長(zhǎng)都是295 nm,掃描范圍為480～650 nm,激發(fā)狹縫寬度和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm,反應(yīng)時(shí)間間隔為5 min。

1.5 共振光散射

共振光散射熒光光譜的測(cè)定使用F-2500熒光光譜儀。激發(fā)狹縫寬度和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm,掃描范圍為250～600 nm,反應(yīng)時(shí)間間隔為5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 等溫滴定量熱法測(cè)定HsCen1 p與Tb3+的相互作用

以10 mmol/L,pH 7.4的N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸Hepes溶液為緩沖,Tb3+滴定蛋白HsCen1p溶液的等溫量熱結(jié)果如圖1所示。由圖可知,該過程是吸熱反應(yīng),隨著Tb3+加入反應(yīng)熱逐漸增加,繼續(xù)加入Tb3+反應(yīng)趨于平穩(wěn),吸熱反應(yīng)停止。經(jīng)過ITC200程序進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合發(fā)現(xiàn),Tb3+與HsCen1p結(jié)合的摩爾比為4∶1,與HsCen1p四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)分別為:12.3×104,8.5×104,0.75×104, 0.7×104(mol/L)-1;同時(shí)得到了該反應(yīng)的吉布斯自由能變?chǔ)、焓變?chǔ)、熵變?chǔ)等熱力學(xué)數(shù)值(表1)。由表1可知,Tb3+與HsCen1p每一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)的焓變?chǔ)均大于0、吉布斯自由能變?chǔ)均小于0、熵變?chǔ)均大于0,證明該反應(yīng)為熵驅(qū)動(dòng)反應(yīng),是一個(gè)可以自發(fā)進(jìn)行的反應(yīng)。

表1 Tb3+和HsCen1p結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters for Tb3+ binding to HsCen1p.

Fig.1 Tb3+ binding with HsCen1p by isothermal titration calorimetry at 30℃.The concentration of the protein was 50 μmol/L圖1 Tb3+與HsCen1p結(jié)合的等溫滴定量熱分析圖蛋白濃度為50 μmol/L, 反應(yīng)溫度為30℃

2.2 Tb3+與HsCen1 p作用的親和力

人中心蛋白1包含有四個(gè)結(jié)合能力不等同的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)(表1)。為獲得每一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與金屬離子的親和力,本文利用生物技術(shù)方法在HsCen1p的EF-hand區(qū)域引入一個(gè)色氨酸(Trp),通過檢測(cè)Tb3+與HsCen1p色氨酸之間能量轉(zhuǎn)移,求得Tb3+與HsCen1p金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的親和力。圖2A是以295 nm為激發(fā)波長(zhǎng),蛋白HsCen1p-E159W(159位E突變?yōu)閃)與Tb3+結(jié)合后,Tb3+在490、545、590和620 nm波長(zhǎng)處熒光發(fā)射強(qiáng)度隨Tb3+濃度變化圖。圖2B為Tb3+滴定HsCen1p-E159W時(shí),Tb3+在545 nm處敏化熒光變化的滴定曲線,為了消除每次滴定引起的稀釋效應(yīng),熒光強(qiáng)度變化用摩爾熒光強(qiáng)度FM(F545/[protein]) 表示。由圖可見,[Tb3+]/[HsCen1p-E159W]<1時(shí),其熒光強(qiáng)度急劇增強(qiáng),證明發(fā)生了Trp殘基到Tb3+的F?rster型無輻射能量轉(zhuǎn)移。HsCen1p-E159W的Ⅰ、Ⅱ位點(diǎn)不含有Tyr或Trp氨基酸,而第Ⅲ、Ⅳ部位僅在172位有一個(gè)Tyr,無法發(fā)生與Tb3+的無輻射能量轉(zhuǎn)移。因此,圖2中的F?rster型無輻射能量轉(zhuǎn)移歸因于從給體W159到受體Tb3+的無輻射能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)[Tb3+]/[HsCen1p-E159W]> 1時(shí),Tb3+熒光敏化微弱增強(qiáng),[Tb3+]/[HsCen1p-E159W]=4時(shí)Tb3+熒光敏化達(dá)到最大。由此證明每摩爾HsCen1p可以結(jié)合4摩爾Tb3+,其中Ⅳ位點(diǎn)為HsCen1p的最強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)[17]計(jì)算得到Tb3+與Ⅳ位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)KⅣ=1.63×105(mol/L)-1。分別將HsCen1p第Ⅰ、Ⅱ位點(diǎn)A50、F86突變?yōu)樯彼?通過檢測(cè)突變后蛋白Trp與Tb34的F?rster型無輻射能量轉(zhuǎn)移(圖3),計(jì)算得到HsCen1p第Ⅰ、Ⅱ位點(diǎn) 與Tb3+的結(jié)合常數(shù)分別為:KⅠ=3.81×104(mol/L)-1和KⅡ=1.89×104(mol/L)-1。結(jié)合ITC實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Tb3+敏化熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)HsCen1四個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)與Tb3+的結(jié)合順序?yàn)棰?Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ。

2.3 Tb3+誘導(dǎo)HsCen1p的聚集

Tb3+滴定HsCen1p的熒光共振光散射光譜如圖4A所示。由圖可見,HsCen1p在370 nm處出現(xiàn)最大共振光散射峰。隨著Tb3+加入,HsCen1p的共振光散射峰峰形沒有變化,但370 nm處的共振光散射強(qiáng)度逐漸增大,當(dāng)?shù)渭拥腡b3+達(dá)到一定量后對(duì)HsCen1p的370 nm處共振光散射強(qiáng)度增強(qiáng)效應(yīng)變緩。如圖4B所示,[Tb3+]/[HsCen1p]≤2.0時(shí),共振光散射強(qiáng)度微弱增強(qiáng),2.0≤[Tb3+]/[HsCen1p]≤4.0時(shí),共振光散射強(qiáng)度顯著增強(qiáng),直到[Tb3+]/[HsCen1p]=4達(dá)到最大。中心蛋白存在兩類結(jié)合位點(diǎn),其中一類為N端低親和位點(diǎn),另一類為C端高親和位點(diǎn)。Tb3+與C端結(jié)合引起蛋白微弱聚集,當(dāng)與N端結(jié)合引起蛋白強(qiáng)聚集,因此推測(cè)N端結(jié)構(gòu)域在HsCen1p聚集過程中起主要作用。

Fig.3 Titration curve for the addition of Tb3+ to HsCen1p-A50W(A)、HsCen1p-F86W(B) by measuring the fluorescence intensity at 545 nm in 10 mmol/L Hepes and at pH 7.4圖3 pH為7.4、10 mmol/L Hepes溶液中，Tb3+滴定HsCen1p-A50W(A)、HsCen1p-F86W(B)時(shí)545 nm處敏化熒光滴定曲線

Fig.4 Resonance light scattering spectra of HsCen1p induced by Tb3+(A) and the titration curves of HsCen1p with the addition of Tb3+ at 370 nm (B) in 10 mmol/L Hepes,pH 7.4, 25℃, the concentration of protein was 3 μmol/L圖4 在25℃, 10 mmol/L Hepes和pH 7.4條件下,蛋白濃度為3 μmol/L，Tb3+滴定HsCen1p的熒光共振光散射譜圖(A)及其在370 nm處的熒光共振光散射滴定曲線(B)

3 結(jié)論

本文通過等溫滴定量熱法、熒光共振光散射法研究了蛋白HsCen1p與金屬Tb3+的相互作用。結(jié)果表明:HsCen1p與Tb3+的作用為吸熱的、熵驅(qū)動(dòng)反應(yīng);每摩爾HsCen1p可以結(jié)合4摩爾Tb3+,計(jì)算得到了Tb3+與HsCen1p四個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域的親和力,蛋白與Tb3+結(jié)合順序?yàn)棰?Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ;HsCen1p的N端結(jié)構(gòu)域在蛋白聚集過程中起重要作用。

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CharacterizationfortheBindingofTerbiumtoPhosphorylatedHumanCentrin1

ZHAO Yaqin*,GUO Xiaojuan

(KeyLaboratoryofChemicalBiologyandMolecularEngineeringoftheMinistryofEducation,InstituteofMolecularScience,Taiyuan030006,China)

Properties of terbium ions binding to phosphorylated human centrin1(HsCen1p) were characterized by fluorescence emission, isothermal titration calorimetry (ITC) and resonance light scattering (RLS).The results suggested that Tb3+may bind with HsCen1p at the ratio of 4∶1. The conditional binding constants of Tb3+with HsCen1p were calculated to be (0.75 ± 0.40)×104, (0.70 ± 0.40)×104,(8.50 ± 0.40)×104and (1.23 ± 0.07)×105(mol/L)-1with the order of Ⅳ >Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ. In addition, Tb3+-induced aggregation of HsCen1p was also studied by RLS,the N-terminal domain of HsCen1p plays significant role in the protein aggregation.

phosphorylation;human centrin1;Tb3+

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.04.024

2016-12-08；

2016-12-29

國(guó)家自然科學(xué)基金(20901048；21571117)；教育部博士點(diǎn)專項(xiàng)基金(20131401110011)

趙亞琴(1977-)，女，山西平遙人，碩士生導(dǎo)師，從事生物無機(jī)化學(xué)研究。E-mail: zhaoyaqin@sxu.edu.cn

Q591

A

0253-2395(2017)04-0804-05