加味地黃飲子方干預(yù)自然衰老鼠與正常成年鼠免疫功能的對(duì)比性研究*

( 150040)

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院

加味地黃飲子方干預(yù)自然衰老鼠與正常成年鼠免疫功能的對(duì)比性研究*

高山謝寧Δ王海艷ΔΔ唐偉懿Δ馬嫡Δ(哈爾濱150040)

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院

目的：比較加味地黃飲子方對(duì)自然衰老鼠與正常成年鼠免疫功能的影響。方法：選取SD雄性大鼠，24月齡20只作為自然衰老實(shí)驗(yàn)組，選取12月齡20只作為正常成年對(duì)照組。2組大鼠給予加味地黃飲子灌胃，8周后檢測(cè)免疫指標(biāo)。比較2組間白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比例、淋巴細(xì)胞比例，比較T細(xì)胞CD4+、CD8+、CD3+比例，比較NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞比例，比較IgA、IgG、IgM含量的差異 。結(jié)果：自然衰老組大鼠的淋巴細(xì)胞比例升高；T 細(xì)胞CD4+和CD3+比例升高、CD8+比例降低；NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞比例升高；IgA、IgG、IgM含量升高。結(jié)論：加味地黃飲子方可以提高自然衰老大鼠的免疫功能，可通過影響免疫功能發(fā)揮延緩衰老的作用。

加味地黃飲子方；自然衰老鼠；正常成年鼠；免疫功能；對(duì)比性研究

衰老是自然界最復(fù)雜的生理現(xiàn)象之一,是任何生物都不能避免的生命過程。人體在遺傳因素調(diào)控下，隨著時(shí)間推進(jìn)逐漸成熟，而后出現(xiàn)各系統(tǒng)、漸進(jìn)性、不可逆轉(zhuǎn)的自然衰老。本課題擬從對(duì)免疫系統(tǒng)功能影響的角度，對(duì)加味地黃飲子抗衰老的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 自北京維通利華公司購(gòu)入雄性24月齡SD大鼠20只為自然衰老實(shí)驗(yàn)組，12月齡大鼠20只為正常成年對(duì)照組。

1.2 藥物制備與試劑 加味地黃飲子方由古方地黃飲子化裁而成，去掉附子，肉桂變?yōu)楣鹬Γ尤肴藚?、血竭、珍珠等藥物。加味地黃飲子方水煎劑的制備：將3劑成人劑量的加味地黃飲子飲片(共453 g)浸泡2 h，然后武火加熱，煮沸后改用文火慢煎30 min，取煎液2次將其混合過濾，再將濾液文火煎煮濃縮至220 mL(藥液含生藥量2.059 g/mL,黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論實(shí)驗(yàn)室煎制)。NK1.1、CD11b、F4/80、CD4抗體(美國(guó)BD公司)，大鼠 IgA、IgG、IgM ELISA 試劑盒(杭州聯(lián)科公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 流式細(xì)胞儀 6HT(武漢科力瓦貿(mào)易有限公司)，全自動(dòng)血液分析儀 BC-1800(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)，EnVision R 多功能酶標(biāo)儀(上海珀金埃爾默有限公司)。

1.4 干預(yù)方法 2組大鼠釆用加味地黃飲子20.6 g/kg·d-1的劑量灌胃，每日1次，觀察8周。

1.5 指標(biāo)測(cè)定 給藥后第 4、8周，大鼠眼內(nèi)眥取血，EDTA-K3 抗凝，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞比例、中性粒細(xì)胞比例。流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞分型中CD4+、CD8+、CD3+細(xì)胞比例。檢測(cè)外周血NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞比例。檢測(cè)外周血 IgA、IgG、IgM值。

2 結(jié)果

2.1 白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比例、淋巴細(xì)胞比例比較 對(duì)比白細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，成年鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)在4周與8周比較差異無顯著性(P>0.05);老年鼠8周白細(xì)胞計(jì)數(shù)較4周有所下降(P<0.05)，老年鼠4、8周白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于成年鼠(P<0.05)。對(duì)比中性粒細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，成年鼠8周中性粒細(xì)胞比例較4周有所提高(P<0.05)，而老年鼠8周中性粒細(xì)胞比例較4周有所下降(P<0.05)；老年鼠4周中性粒細(xì)胞比例與成年鼠比較差異無顯著性(P>0.05)，老年鼠8周中性粒細(xì)胞比例明顯低于成年鼠(P<0.05)。對(duì)比淋巴細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，成年鼠淋巴細(xì)胞比例在4周與8周比較差異無顯著性(P>0.05)，老年鼠8周淋巴細(xì)胞比例較4周有所上升(P<0.05)，且老年鼠8周淋巴細(xì)胞比例明顯高于成年鼠(P<0.05)，而老年鼠4周淋巴細(xì)胞比例與成年鼠比較差異無顯著性(P>0.05)。詳見表1。

組別n白細(xì)胞(×1000個(gè)/μm3)4周8周中性粒細(xì)胞(%)4周8周淋巴細(xì)胞(%)4周8周成年組2010.3±1.911.5±1.756.7±13.180.8±20.4*44.6±13.749.5±1.06老年組206.5±1.2#4.2±1.1#*62.6±19.534.4±10.3#*47.3±21.765.8±22.1#*

注：與成年組比較，#P<0.05；與組內(nèi)4周比較，*P<0.05

2.2 T淋巴細(xì)胞分型比例比較 對(duì)比CD4+T細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠和老年鼠8周CD4+比例較4周有明顯的提高(P<0.05)，且老年鼠4、8周CD4+比例明顯低于成年鼠(P<0.05)。對(duì)比CD8+T細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠和老年鼠8周CD8+比例較4周有明顯的下降(P<0.05)，老年鼠4、8周CD8+比例明顯高于成年鼠(P<0.05)。對(duì)比 CD3+細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠和老年鼠8周CD3+比例較4周有明顯的提高(P<0.05)，老年鼠4、8周CD3+比例明顯低于成年鼠(P<0.05)。詳見表2。

組別nCD4+4周8周CD8+4周8周CD3+4周8周成年組2061.4±15.992.3±9.7*50.4±8.7 36.9±12.3* 57.4±1.685.6±8.8* 老年組2025.7±3.1#70.6±21.4#75.2±14.0#53.1±10.9#*32.8±5.5#62.0±11.1#*

注：與成年組比較，#P<0.05；與組內(nèi)4周比較，*P<0.05

2.3 NK細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞比例比較 對(duì)比NK細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠和老年鼠8周NK細(xì)胞比例較4周分別有明顯上升(P<0.05)，老年鼠4、8周NK細(xì)胞比例明顯低于成年鼠(P<0.05)。對(duì)比B細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠和老年鼠8周B細(xì)胞比例較4周有明顯的上升(P<0.05)，老年鼠4、8周B細(xì)胞比例明顯低于成年鼠(P<0.05)。對(duì)比巨噬細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠和老年鼠8周巨噬細(xì)胞比例較4周有明顯的上升(P<0.05)，8周巨噬細(xì)胞比例老年鼠與成年鼠比較差異無顯著性(P>0.05)，老年鼠4周巨噬細(xì)胞比例明顯低于成年鼠(P<0.05)。詳見表3。

2.4 IgA、IgG、IgM含量比較 對(duì)比 IgA含量發(fā)現(xiàn)：成年鼠和老年鼠8周IgA含量較4周有明顯上升(P<0.05)，老年鼠4、8周IgA含量明顯低于成年鼠(P<0.05)。對(duì)比IgG含量發(fā)現(xiàn)：成年鼠和老年鼠8周IgG含量較4周有明顯上升(P<0.05)，老年鼠4、8周IgG含量明顯高于成年鼠(P<0.05)。對(duì)比IgM含量發(fā)現(xiàn)：成年鼠和老年鼠8周IgM含量較4周有明顯上升(P<0.05)，4、8周IgM含量老年鼠與成年鼠比較差異無顯著性(P>0.05)。詳見表4 。

組別nNK細(xì)胞4周8周B細(xì)胞4周8周巨噬細(xì)胞4周8周成年組2053.2±1.182.5±18.8*55.4±12.177.9±18.1*61.2±21.581.7±23.2*老年組2045.7±25.4#62.4±15.1#*38.4±6.7#50.6±8.8#*32.4±25.0#77.3±30.4*

注：與成年組比較，#P<0.05；與組內(nèi)4周比較，*P<0.05

組別nIgA4周8周IgG4周8周IgM4周8周成年組2032.7±14.880.5±19.3*26.8±9.4 49.2±15.3*70.1±12.3114.5±36.2*老年組2015.3±3.3#52.9±12.7#*53.4±16.9#76.2±14.0#*68.3±9.7△90.6±25.7*

注：與成年組比較，#P<0.05，△P>0.05；與組內(nèi)4周比較，*P<0.05

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)人體免疫系統(tǒng)的功能隨時(shí)間不斷進(jìn)行調(diào)整重塑，隨年齡增長(zhǎng)功能不斷下降，呈現(xiàn)老化狀態(tài)。[1]對(duì)生理年齡較長(zhǎng)的人群，如百歲老人進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其免疫系統(tǒng)功能良好，保持在較高的水平運(yùn)行。據(jù)分析免疫功能的完好與長(zhǎng)壽存在相關(guān)性。在衰老過程中淋巴細(xì)胞明顯生成減少、凋亡較高，而出現(xiàn)整體水平下降。[2]免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的應(yīng)答水平也隨之下降，所以老年人群多見容易感染、腫瘤高發(fā)的現(xiàn)象。老年人在疾病過程中外界抗原和病原體不斷刺激并消耗T淋巴細(xì)胞。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)T細(xì)胞因?yàn)榈蛲鍪軗p發(fā)生克隆性擴(kuò)增。[3]進(jìn)入老齡期后人體老化代表細(xì)胞T細(xì)胞CD8+比例上升，而清除腫瘤細(xì)胞起著極其重要作用的CD4+數(shù)量下降。[4]衰老使B淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能下降。細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂導(dǎo)致B細(xì)胞分泌免疫球蛋白減少，破壞B細(xì)胞的形成，使免疫球蛋白的多樣性和黏附性下降。[5]研究表明老年人和老齡鼠的B細(xì)胞存在協(xié)同刺激因子的減少、受體信號(hào)減弱等內(nèi)在缺陷，起保護(hù)作用的免疫球蛋白親和性和滴度下降。NK細(xì)胞通過細(xì)胞毒作用對(duì)抗、殺滅腫瘤細(xì)胞。老年期NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用大幅降低，如果保持相應(yīng)的抗腫瘤作用，就需要更多數(shù)量的NK細(xì)胞來補(bǔ)充足量的細(xì)胞溶解能力。[6]

中醫(yī)藥延緩衰老的作用受到日益廣泛的關(guān)注，其研究也越來越深入。在臨床大量應(yīng)用中，筆者觀察到地黃飲子加減方對(duì)改善早衰癥狀有很好的的作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)加味地黃飲子通過影響免疫功能發(fā)揮抗衰老的作用進(jìn)行深入的研究，筆者對(duì)正常的成年大鼠和自然衰老大鼠進(jìn)行加味地黃飲子干預(yù)，觀察它們免疫系統(tǒng)的變化。對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)加味地黃飲子可不同程度的提高自然衰老大鼠淋巴細(xì)胞比例，提高正常的成年鼠和自然衰老大鼠CD4+和CD3+細(xì)胞比例，降低CD8+細(xì)胞比例，提高正常的成年鼠和自然衰老鼠NK細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞比例和血漿 IgA、IgG、IgM的含量。地黃飲子方具有開竅、化痰、補(bǔ)腎、活血的功效，方藥組成中的有效成分為延緩自然衰老發(fā)揮了重要的藥理作用。[7-9]影響自然衰老的因素很多如氧化應(yīng)激衰老、間質(zhì)損傷衰老、糖基化終產(chǎn)物衰老等，這也是我們今后可能的研究方向。本實(shí)驗(yàn)從加味地黃飲子方對(duì)免疫系統(tǒng)的影響粗淺分析其延緩衰老的內(nèi)在原因，試圖從多方面、多角度、多層次去探討加味地黃飲子方延緩衰老的作用機(jī)制。

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ComparativeStudyofInterventionofJiaweiDihuangYinziFangonImmuneFunctioninNaturalAgingRatsandNormalAdultRats

GAOShanXIENingWANGHai-yanTANGWei-yiMADi(Harbin 150040)

First Affiliated Hospital,Heilongjiang University of Chinese Medicine

Objective: to compare the effects ofJiaweiDihuangYinziFangon the immune function in natural aging rats and normal adult rats. Methods: 20 SD male rats of 24 months old were selected as experimental group of natural aging, and 20 rats of 12 months old as normal adult control group. Both groups were treated with intragastric administration withJiaweiDihuangYinziFangto detect immunological index after 8 weeks. Compare white blood cell count the proportions of neutrophils and lymphocytes in the 2 groups, compare the proportions of T-cells of CD4+, CD8+and CD3+, compare the proportions of NK cells, macrophages and B cells, and compare the differences of IgA, IgG and IgM contents. Results: In natural aging group, lymphocytes increased; CD4+and CD3+increased; CD8+decreased; NK cells, macrophages and B cells increased; and the contents of IgA, IgG and IgM increased. Conclusion:JiaweiDihuangYinziFangcan improve the immune function of natural aging rats, and can play the role of anti-aging by affecting immune function.

JiaweiDihuangYinziFang; natural aging rat; normal adult rat; immune function; comparative study

R285.5

A

1007-5615(2017)06-0004-04

* 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目：No.81573863；哈爾濱市科技局青年后備人才項(xiàng)目：No.2017RAQXJ170

Δ 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)(哈爾濱 150040)

ΔΔ 黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院(哈爾濱 150036)

謝寧，男，教授，博士生導(dǎo)師。

(2017-10-17 收稿)