益腎安宮方治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)療效及對(duì)患者外周血T細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響

陳瑞紅，劉 琰，劉玉玲△

1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院(鄭州 450003 )，2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院(鄭州 450052 )

主題詞 流產(chǎn)/中西醫(yī)結(jié)合療法 補(bǔ)腎劑/治療方法 @益腎安宮方 療效比較研究

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)主要指連續(xù)發(fā)生不小于2次的自然流產(chǎn)，是一種婦產(chǎn)科常見疾病，病因較為復(fù)雜，涉及內(nèi)分泌、遺傳、生殖道感染等方面，大部分原因不明[1-2]。相關(guān)研究表明，妊娠婦女體內(nèi)會(huì)發(fā)生十分復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，妊娠結(jié)局與外周血T細(xì)胞亞群分化失衡密切相關(guān)[3-4]，其中Th1/Th2細(xì)胞失衡學(xué)說(shuō)最經(jīng)典，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Th17/Treg這對(duì)免疫細(xì)胞同樣會(huì)影響患者的妊娠結(jié)局。目前,臨床上對(duì)RSA患者的常規(guī)治療為黃體酮注射液，具有一定的保胎作用，但臨床療效不高。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RSA屬于“滑胎”范疇，主要特點(diǎn)為胚胎應(yīng)期而下、且會(huì)反復(fù)發(fā)作，治療的關(guān)鍵是補(bǔ)腎固胎[5]。益腎安宮方為一種中藥制劑，具有益腎養(yǎng)陰、固胎防滑之功效[6]，但目前對(duì)于益腎安宮方用于治療RSA患者的相關(guān)研究甚少。為此，本研究將探討益腎安宮方用于治療RSA患者的療效及其對(duì)外周血T細(xì)胞亞群的比例和細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響。

資料與方法

1 一般資料 選取2015年1月至2016年12月我院收治的89例RSA非孕期患者為研究對(duì)象，按照隨機(jī)數(shù)表法分為治療組和對(duì)照組，本研究已經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。治療組：患者44例，年齡23～42歲，平均年齡(28.17±4.98)歲；平均體重(57.95±8.93)kg；在中醫(yī)證型上屬于腎虛血熱型24例，脾腎兩虛型20例。對(duì)照組：患者45例，年齡21～43歲，平均年齡(28.31±5.02)歲；平均體重(57.89±8.97)kg；腎虛血熱型23例，脾腎兩虛型22例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合RSA相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]的婦女；均有連續(xù)兩次或以上的自然流產(chǎn)史，且末次流產(chǎn)發(fā)生時(shí)間不超過(guò)1年；內(nèi)分泌正常，且對(duì)本研究知情同意者。排除標(biāo)準(zhǔn)：生殖道感染或畸形；患有重要臟器疾病或自身免疫病等；夫婦外周血染色體核型異常。兩組研究對(duì)象的年齡、體重和中醫(yī)證型上等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，有可比性。

2 治療方法 其中對(duì)照組肌肉注射黃體酮20mg(國(guó)藥準(zhǔn)字：H33020828)進(jìn)行治療，1次/d，1周為1個(gè)療程，持續(xù)治療3周。治療組在上述基礎(chǔ)上給予益腎安宮方進(jìn)行治療，若患者為腎虛血熱型，則給予益腎安宮I號(hào)方保陰煎加減，組方為：熟地黃、黃芩、生地黃、山藥、炒白芍、桑寄生和鹽續(xù)斷各15 g，阿膠和墨旱蓮各12 g，甘草5 g。若患者為脾腎兩虛型，則給予益腎安宮II號(hào)方壽胎丸四君子湯加減，組方為：菟絲子30 g，熟地黃、炒黨參、炒白芍、杜仲、桑寄生和鹽續(xù)斷各15 g，炒白術(shù)、阿膠和茯苓各12 g，甘草5 g。兩種組方均為加300 ml清水煮沸，取藥汁服用，1劑/d，每日分3次服用，1周為1個(gè)療程，持續(xù)治療3周。

3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)兩組患者治療后的妊娠結(jié)局進(jìn)行隨訪記錄，將宮內(nèi)妊娠大于12周歸為妊娠成功，分娩嬰兒存活則為活產(chǎn)。采集兩組患者治療前、治療3周后靜脈血各2管，其中1管為5 ml不抗凝，離心后取上清液，通過(guò)ELISA法對(duì)血清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17、TGF-β和IL-4水平進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒來(lái)自美國(guó)Adlitteram Diagnostic Laboratories公司；另1管為8 ml放肝素抗凝管中，根據(jù)達(dá)科為公司給出的有關(guān)淋巴細(xì)胞分裂液操作說(shuō)明書將外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行收集，加入乙酸肉豆蔻佛波醇、莫能霉素及離子霉素(均購(gòu)自Gibco公司)進(jìn)行刺激作用，5 h后收集細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞表面CD4+分子、胞內(nèi)IL-17、IFN-γ、IL-4和相應(yīng)同型對(duì)照抗體進(jìn)行染色作用，通過(guò)FACSCalibur流式細(xì)胞對(duì)Th1、Th17、Th2和Treg細(xì)胞比較進(jìn)行檢測(cè)；利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)T-bet、STAT-3、GATA-3、RORγt和FOXP3mRNA表達(dá)水平。所有操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

結(jié) 果

1 兩組患者治療后妊娠結(jié)局比較 隨訪1年期間，治療組35例妊娠成功，妊娠成功率為79.55%(35/44)，其中30例活產(chǎn)，活產(chǎn)率為85.71%(30/35)。對(duì)照組27例妊娠成功，妊娠成功率為60%(27/45)，其中17例活產(chǎn)，活產(chǎn)率為62.96%(17/27)。治療組的妊娠成功率和活產(chǎn)率均明顯大于對(duì)照組(χ2=4.022，4.302，均P<0.05)。

2 兩組治療前后T細(xì)胞亞群比例情況 治療前兩組Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞比例相比均無(wú)明顯差異(均P>0.05)。經(jīng)治療，治療組Th1和Th17細(xì)胞比例均明顯低于對(duì)照組，Th2和Treg細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)，見表1。

3 兩組治療前后血清各細(xì)胞因子水平比較 治療前兩組IFN-γ、IL-4、IL-17和Treg水平相比均無(wú)明顯差異(均P>0.05)。治療后，治療組IFN-γ和IL-17水平均明顯低于對(duì)照組，IL-4和TGF-β水平均明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組治療前后血清各細(xì)胞因子水平比較

4 兩組各項(xiàng)其他指標(biāo)比較 治療前兩組T-bet、GATA-3、STAT-3、FOXP3和RORγt mRNA表達(dá)水平相比均無(wú)明顯差異(均P>0.05)。經(jīng)治療，治療組T-bet、STAT-3和RORγt mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，GATA-3和FOXP3 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)，見表3。

表3 兩組治療前后T-bet、GATA-3、STAT-3、FOXP3和RORγt mRNA表達(dá)水平比較(×103)

討 論

中醫(yī)學(xué)將RSA歸為“滑胎”，認(rèn)為腎為胎元穩(wěn)固之本，腎虛、沖任不固容易引發(fā)滑胎，所以治療應(yīng)以補(bǔ)腎固胎、養(yǎng)陰清熱為主[8]。通過(guò)補(bǔ)腎來(lái)防止滑胎的治療方式最早出自宋代《女科百問(wèn)》。馮曉玲等[9]研究也表明，采用補(bǔ)腎活血法治療Th1/Th2失衡的不明原因RSA患者可以有效提高治療有效率。益腎安宮方是一種中藥制劑，具有健脾養(yǎng)陰、益腎固胎的功效，應(yīng)用于治療不明原因RSA和先兆流產(chǎn)患者均已取得良好的臨床效果[10]。本研究結(jié)果顯示，治療后隨訪1年期間治療組的妊娠成功率和活產(chǎn)率均明顯大于對(duì)照組，可見益腎安宮方治療RSA患者可以有效改善其妊娠結(jié)果。針對(duì)腎虛血熱型患者，益腎安宮I號(hào)方中的熟地黃、生地黃和黃芩可清熱涼血、養(yǎng)陰安胎；山藥和墨旱蓮可健脾養(yǎng)胃、滋補(bǔ)肝腎；白芍和阿膠可補(bǔ)血斂陰；桑寄生和續(xù)斷可補(bǔ)腎固沖；加甘草以調(diào)和諸藥。全方溫而不燥，共奏補(bǔ)腎養(yǎng)血、清熱涼血、安胎固沖的功效。針對(duì)脾腎兩虛型患者，益腎安宮II號(hào)方以菟絲子作為君藥，該藥味甘性平、善吸收他物之氣以自養(yǎng)，具有益陰固陽(yáng)、補(bǔ)腎壯筋的作用；組方中的黨參、白術(shù)和茯苓可健脾益氣；白芍和阿膠可補(bǔ)血斂陰；桑寄生和杜仲可補(bǔ)腎固沖；加甘草以調(diào)和諸藥，共奏補(bǔ)腎健脾、氣血調(diào)和、安胎固沖的功效。張偉等[11]研究也表明，益腎安宮方具有補(bǔ)腎健脾的功效，可改善胎盤功能，增加保胎有效率，臨床療效顯著。

相關(guān)研究表明[12]，RSA患者的妊娠結(jié)局和T細(xì)胞亞群(Th1、Th2、Th17等)的分化失衡密切相關(guān)。其中Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，其特異性轉(zhuǎn)錄因子為T-bet(T-box家族成員)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4等細(xì)胞因子，其特異性轉(zhuǎn)錄因子為GATA-3(一種鋅指蛋白)，可誘導(dǎo)IL-4的產(chǎn)生。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Th細(xì)胞極性分化具有非常重要的調(diào)控作用，其中T-bet對(duì)Th1細(xì)胞的發(fā)育具有促進(jìn)作用，還會(huì)抑制IL-4的分泌，GATA-3則對(duì)Th2細(xì)胞的發(fā)育具有促進(jìn)作用，兩者可相互抑制。Th17細(xì)胞具有較強(qiáng)的促炎癥作用，主要分泌IL-17等細(xì)胞因子，其特異性轉(zhuǎn)錄因子為STAT-3和RORγt；Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子為FOXP3。Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞存在密切聯(lián)系，其中TGF-β和IL-6是兩者連接的關(guān)鍵：TGF-β含量較高時(shí)可將初始T細(xì)胞活化分化成Treg細(xì)胞；少量的TGF-β和IL-6又可將活化的初始T細(xì)胞表達(dá)RORγt進(jìn)而分化成Th17細(xì)胞[13]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)治療后，治療組Th1和Th17細(xì)胞比例均明顯低于對(duì)照組，Th2和Treg細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組，表明益腎安宮方治療RSA患者可有效調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群分化失衡狀態(tài)。且經(jīng)治療后，治療組IFN-γ和IL-17水平均明顯低于對(duì)照組，IL-4和TGF-β水平均明顯高于對(duì)照組?？梢娨婺I安宮方能夠改善相應(yīng)的細(xì)胞因子水平。通過(guò)檢測(cè)患者T細(xì)胞相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后，治療組T-bet、STAT-3和RORγt mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，GATA-3和FOXP3 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了益腎安宮方能夠有效調(diào)節(jié)患者T細(xì)胞亞群分化失衡狀態(tài)，這可能與益腎安宮方具有健脾養(yǎng)陰、調(diào)節(jié)氣血、益腎固胎的功效有關(guān)[14]。

綜上所述，益腎安宮方治療RSA患者可以有效改善其妊娠結(jié)果，調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群分化失衡狀態(tài)，并有效改善相應(yīng)的細(xì)胞因子水平及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。