電極式食用油過(guò)氧化值試紙的研制

目前我國(guó)各防疫部門檢測(cè)食用油過(guò)氧化值大多按照GB/T5009.37-1996規(guī)定的分析方法（化學(xué)滴定法）。針對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)設(shè)備和技術(shù)要求較高、耗時(shí)長(zhǎng)，市場(chǎng)上已經(jīng)有過(guò)氧化值快速檢測(cè)產(chǎn)品，過(guò)氧化值速測(cè)卡，可以方便使用。已有采用碘化鉀淀粉法研制過(guò)氧化氫檢測(cè)試紙的報(bào)道，但研制出的試紙檢測(cè)靈敏度較低，而且檢測(cè)結(jié)果如不立即觀察，受空氣氧化作用等影響，反應(yīng)物顏色很快發(fā)生變化，對(duì)光和氧敏感，易失效；反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，超過(guò)5分鐘；只能定性和半定量測(cè)量不能對(duì)結(jié)果進(jìn)行正確判斷。

材料與方法

試劑辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購(gòu)于sigma公司、羧甲基纖維素、氣化二氧化硅、檸檬酸、檸檬酸鈉均購(gòu)于Alfaaesar公司。PET基片購(gòu)置于杜邦公司，導(dǎo)電油墨、絕緣油墨均購(gòu)于美國(guó)Acheson公司。

方法原理樣品中的過(guò)氧化物在辣根過(guò)氧化物酶的催化下與TMB反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生微弱電流，由配套的儀器內(nèi)置儀表測(cè)量電流變化并換算顯示為相對(duì)應(yīng)的過(guò)氧化值。

電極式過(guò)氧化值試紙制作首先，采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)在0.25mm厚PET塑料基片上制作工作電極、參比電極和短路電極，工作電極、參比電極和短路電極，采用由Acheson公司購(gòu)買的導(dǎo)電碳墨制作。通過(guò)絲網(wǎng)印刷將導(dǎo)電油墨在PET塑料基片上鋪上分散均勻的油墨薄層后，放到80。C烘箱中烘干60min。其次，采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)在印好電極系統(tǒng)的基片上印刷絕緣漆作為電絕緣隔離層，絕緣漆由Acheson公司購(gòu)買。通過(guò)絲網(wǎng)印刷將絕緣漆在PET塑料基片上鋪上分散均勻的油墨薄層后，放到紫外烘干機(jī)一分鐘烘干。最后，在電極表面固定酶反應(yīng)膜用于過(guò)氧化值的檢測(cè)。取4μL酶反應(yīng)液滴加到電極表面，50℃烘干20min，備用。

樣品食用油過(guò)氧化值檢測(cè)將樣品與萃取液按1：1混合，攪拌均勻，靜置2分鐘，作為待測(cè)溶液。將上述待測(cè)溶液滴加到電極式過(guò)氧化值試紙的加樣口，樣品通過(guò)毛細(xì)作用自動(dòng)吸到電極式過(guò)氧化值試紙反應(yīng)區(qū)，反應(yīng)區(qū)電極上H RP催化過(guò)氧化物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，放出電子，電子再與的3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺反應(yīng)，生成傳電子絡(luò)合物，電子在傳感器檢測(cè)儀的恒定電壓激勵(lì)下發(fā)生定向移動(dòng)形成電流，電流被轉(zhuǎn)換及放大后經(jīng)過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器之后，由單片機(jī)將電信號(hào)轉(zhuǎn)換成過(guò)氧化值濃度直接從液晶顯示其讀數(shù)，同時(shí)還將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器中。

試紙檢測(cè)準(zhǔn)確性測(cè)試按已確定最佳TM B、辣根過(guò)氧化物酶量配方，制作試紙。用制作的試紙測(cè)試過(guò)氧化值為5meq/kg、1meq/kg、15meq/kg、20meq/kg、25meq/kg、50meq/kg樣品，樣品用國(guó)標(biāo)滴定法滴定，做圖，得到線性相關(guān)圖。

試紙穩(wěn)定性測(cè)試將試紙分成10瓶，五瓶常溫保存，五瓶放在60～C烘箱。到時(shí)間后，用試紙檢測(cè)滴定法定值的樣品，比較測(cè)試值與滴定法定值的偏差，以確定試紙保存期。

結(jié)果與分析

試紙制作試紙制作采用絲網(wǎng)印刷方法制作電路，先印刷導(dǎo)電層油墨，烘干后，再印刷絕緣層油墨。由于電路圖形通過(guò)網(wǎng)版印制到PET，一次可以印刷200片試紙的圖形，使用印刷機(jī)印刷電路，每分鐘可以形成幾千片試紙的圖形；采用自動(dòng)化滴液機(jī)將酶液滴到試紙電極上，液體量可以控制，保證負(fù)載在試紙電極上的酶量均一，測(cè)試精度高；試紙制作工序均為半自動(dòng)機(jī)器或自動(dòng)設(shè)備，適合大批量生產(chǎn)。

酶試劑中TMB含量確定試紙中TMB作為電化學(xué)介質(zhì)，在反應(yīng)中起到重要作用，它的量與反應(yīng)速度有密切關(guān)系。在一定范圍內(nèi)，TMB的量越高，線性越好，反應(yīng)越靈敏。但是，TMB通常難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，本研究使用水溶性TMB。水溶性TMB在水中的溶解度也不是很大。因此，TMB的使用量既要考慮反應(yīng)性，也要考慮溶解性。試驗(yàn)中，當(dāng)濃度達(dá)到0.5%時(shí)，測(cè)試過(guò)氧化值5meq/-kg-50meq/kg油樣，線性很好。當(dāng)濃度大于0.5%，斜率沒有明顯變大，只是截距變大了，線性沒有明顯改變，但是TMB已經(jīng)有點(diǎn)難溶解了，但用量為1%時(shí)，明顯看到TNB溶解不完全。因此，試紙酶液中的最佳TMB濃度確定為0.5%。

酶試劑中過(guò)氧化物酶含量確定過(guò)氧化物酶含量低時(shí)，反應(yīng)速度慢，測(cè)試電流較低，過(guò)氧化物酶含量高時(shí)，反應(yīng)速度加快，測(cè)試電流變大，在一定范圍內(nèi)，過(guò)氧化物酶的量越高，線性越好，反應(yīng)越靈敏。但是，當(dāng)濃度達(dá)到0.8%，即使再加多量，電流也沒有增大，說(shuō)明酶量已經(jīng)足夠了。因此，試紙酶液中的最佳TMB濃度確定為0.8%。

試紙檢測(cè)準(zhǔn)確性測(cè)試將樣品與萃取液按1：1混合，攪拌均勻，靜置2分鐘，作為待測(cè)溶液。將上述待測(cè)溶液滴加到電極式過(guò)氧化值試紙的加樣口，樣品通過(guò)毛細(xì)作用自動(dòng)吸到電極式過(guò)氧化值試紙反應(yīng)區(qū)，5秒鐘顯示結(jié)果，記錄結(jié)果，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)+次，計(jì)算平均值。電化學(xué)過(guò)氧化值試紙測(cè)試值與滴定法測(cè)試值相關(guān)系數(shù)為0.9887，具有很好相關(guān)性，可用于臨床。

本研究根據(jù)電化學(xué)生物傳感器原理，利用絲網(wǎng)印刷技術(shù)制作電路，使用點(diǎn)噴方法將酶液固定在試紙電極上，制作用于食用油中過(guò)氧化值檢測(cè)的電化學(xué)試紙。該試紙可在5s內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，最低檢測(cè)極限為5meq/kg，試紙保質(zhì)期為12個(gè)月。該試紙重復(fù)性好，反應(yīng)靈敏，檢測(cè)時(shí)間短，只需5秒，樣品處理方法簡(jiǎn)單，而且抗干擾能力較強(qiáng)，可以大批量生產(chǎn)，在食用油過(guò)氧化值的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)領(lǐng)域?qū)⒂泻芎玫膽?yīng)用前景。