動物源性食品鴨血中鴨成分普通PCR檢測方法探究

摘要：研究鴨血因DNA部分降解而使普通PCB檢測結(jié)果偏離的優(yōu)化方法。對普通PCB方法未檢出但實時熒光定量PCB方法檢出的鴨血DNA通過增加擴增模板量到5uL，擴增產(chǎn)物稀釋100倍進行二次擴增，可以得到的DNA純度較高，凝膠電泳條帶明亮，背景清晰，改進的方法能使普通PCB方法檢測結(jié)果準確性提高，降低假陰性概率。

關(guān)鍵詞：鴨血，普通PCB檢測，假陰性，鴨血DNA，二次擴增

鴨血的營養(yǎng)價值很高，含有豐富的蛋白質(zhì)、多種微量元素（如鐵、銅、鈣等），有補血和清熱解毒的作用，并有預(yù)防和治療缺鐵性貧血的功效。鑒于如此的食用功效，且鴨血液量相對于體積龐大的動物血量相對較少，因此鴨血的價格明顯偏高，部分商家為了盈利可能會在鴨血中摻雜豬血甚至其他動物血來銷售。以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)廣泛被用來鑒定食品中的動物源性成分，由于血液保質(zhì)期短，在加工制作的過程中會加入鹽和凝固劑等化學物質(zhì)，加之在提取鴨血DNA過程中的物理作用等會對DNA造成破壞，使DNA含量降低而使檢測結(jié)果有偏差。

目前檢測鴨成分的方法有普通PCR法和實時熒光定量PCR法，國家檢測鴨成分的唯一標準SN/T 3731.5-2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法第5部分：鴨成分檢測PCR法》是用普通PCR法，實時熒光定量PCR法是不同的試劑盒公司開發(fā)出來的用于科研用方法，暫無實時熒光定量PCR法檢測鴨成分的國家檢測標準。熒光定量PCR在靈敏度、準確度、便捷性上均高于普通PCR，但對于需要出具第三方檢測報告的單位和企業(yè)，只能用國家標準進行檢測，本文對SN/T 3731.5-2013檢測鴨血樣品中鴨成分因鴨血DNA部分降解而導(dǎo)致結(jié)果偏離進行了方法優(yōu)化探索，以提高檢測結(jié)果的準確性。

材料與方法

材料與試劑鴨血：購自南京某大型超市。

DNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST UniversaI GenomicDNA Extraction Kit ver 5.0、TaKaRa Taq（5U/uL）、10×PCRBuffer（Mg²⁺ pIus）、dNTP Mixture（各2.5mM）、PCR體系預(yù)混液Premix EX TaqTM（Probe qPCR）寶生物工程（大連）有限公司。

儀器和設(shè)備：EPS 300電泳儀Tanon；UniversaIGenoSensl800凝膠成像儀：上海勤翔；ABI 2720普通PCR儀美國賽默飛PikoREAL 96實時熒光定量PCR儀（96孔板）：美國賽默飛。

引物：參照標準合成擴增鴨源性成分的引物，引物序列見標準表1。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

DNA提取方法：鴨血DNA提取方法按照DNA提取試劑盒的方法步驟進行提取。

普通PCR檢測：鴨血中鴨成分檢測步驟見SN/T3731.5-2013。

實時熒光定量PCR檢測：將鴨血所提DNA進行鴨源性成分的實時熒光定量PCR檢測，PCR反應(yīng)體系為：預(yù)混液20ML，包括DNA模板1.6uL，Premix Ex TaqTM（ProbeqPCR）10uL，上下游引物各0.4uL，Probe 0.8uL，加ddH20補足20uL。

鴨成分實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；PCR反應(yīng)：95℃ 5s，60℃ 30s，進行40個循環(huán)。根據(jù)擴增曲線Ct值≤35視為檢出鴨成分。

增加模板進行擴增檢測：將鴨血DNA添加不同模板量進行擴增，即PCR反應(yīng)體系中DNA模板分別添加1uL、2uL、5uL、10uL，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見SN/T 3731.5-2013。擴增產(chǎn)物進行電泳檢測。

二次擴增：將1.7擴增后的產(chǎn)物取2uL加入98uLddH₂O進行100倍稀釋，取1uL作為模板進行二次擴增，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見SN/T 3731.5-2013。擴增產(chǎn)物進行電泳檢測。

結(jié)果與分析

鴨血樣品普通PCR和實時熒光定量PCR檢測結(jié)果：對提取的鴨血DNA利用鴨源性引物進行PCR擴增，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，結(jié)果見圖1。對提取的鴨血DNA利用鴨源性引物進行實時熒光定量PCR，結(jié)果見圖2。

由圖1可知，空白對照和陰性對照無條帶產(chǎn)生，陽性對照在226bp有條帶產(chǎn)生，鴨血DNA擴增后在226bp位置無可見條帶，未檢出鴨成分。由圖2可知，實時熒光定量PCR檢測結(jié)果空白對照和陰性對照均為未檢出，陽性對照Ct值分別為18.26，檢出鴨成分，鴨血兩個平行樣Ct值分別為23.21/23.95，檢出鴨成分。普通PCR與實時熒光定量PCR檢測結(jié)果不一致，可以推測鴨血中鴨DNA可能受物理、化學等因素的影響，核酸有降解。

增加模板擴增結(jié)果：對提取的鴨血DNA添加模板量分別為1uL、2uL、5uL、10uL，利用鴨源性引物進行PCR擴增，反應(yīng)后取擴增產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測擴增結(jié)果，結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，添加鴨血模板量1uL、2uL、5uL、10uL，每個模板梯度各2個平行樣，擴增后都是Smear，陽性對照條帶正常而且很亮，排除了反應(yīng)體系及引物的原因。因為鴨血與鴨肉不同，血液的保存期短，儲存不了太長時間，基因組降解可能性大。

二次擴增檢測結(jié)果：由圖4可以看出，對鴨血DNA添加不同模板量1uL、2uL、5uL、10uL擴增后的產(chǎn)物，經(jīng)過1.8步驟進行二次擴增后，空白對照和陰性對照無條帶產(chǎn)生，陽性對照在226bD有條帶產(chǎn)生，不同模板添加量1uL、2uL、5uL、10uL二次擴增的擴增產(chǎn)物，2uL模板添加量在226bp位置有弱條帶，5uL和10uL模板添加量在226bp位置有明亮條帶，無非特異性條帶，擴增結(jié)果良好。

通過增加模板DNA量至5uL后擴增，可以增加目的DNA的含量，通過稀釋后，可以降低雜質(zhì)的含量從而增加目的DNA的含量，提高擴增目的DNA的準確度。目前普通PCR法是國家現(xiàn)有的檢測鴨成分的唯一標準方法，是需要出具正式檢測報告的檢驗檢測機構(gòu)的唯一檢測方法，而普通PCR法有很大的局限，檢測結(jié)果不夠準確，如果單以SN/T 3731.5-2013方法檢測鴨源性成分，可能得到錯誤的檢測結(jié)果，因此通過此優(yōu)化方法來優(yōu)化檢測過程，可以提高檢測結(jié)果的準確度，可為質(zhì)檢部門及第三方檢測機構(gòu)推廣應(yīng)用，作為實驗室檢測血液類食品的常規(guī)檢測手段。