長(zhǎng)小蠹亞科類昆蟲分子鑒定技術(shù)研究進(jìn)展

方文淵，吳志毅，*，張文俊，田宏偉，程 帆，黃凌哲，吳 穎，陳 哲，

(1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江杭州 311215；2.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江杭州 310016)

長(zhǎng)小蠹類昆蟲隸屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)長(zhǎng)小蠹亞科(Platypodinae)，該亞科昆蟲又稱“食菌小蠹”(ambrosia beetles)或“針孔小蠹”(pinhole beetles)，世界已知種類1 500余種[1-2]。該類害蟲主要為害樹木及木材[3]，在木質(zhì)部?jī)?nèi)營鉆蛀寄生生活，蟲道縱橫交錯(cuò)，蟲道內(nèi)常有伴生菌，導(dǎo)致木材變質(zhì)，嚴(yán)重影響木材質(zhì)量，降低木材的使用價(jià)值，有些種類還可傳播樹木病害，加速植物死亡；其為害的寄主有些為豆科紫檀屬、黃檀屬等名貴樹木或木材，是一類具有重要經(jīng)濟(jì)意義的林木害蟲。因長(zhǎng)小蠹類昆蟲危害大，易通過人為傳播，擴(kuò)散防治困難，對(duì)其的檢疫工作受到世界許多國家的重視。新西蘭、澳大利亞、日本、美國等國家均將長(zhǎng)小蠹的部分類群確定為檢疫性有害生物。2007年我國發(fā)布的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中，異脛長(zhǎng)小蠹屬非中國種及長(zhǎng)小蠹屬非中國種被確定為檢疫性有害生物。

20世紀(jì)以來，隨著國際貿(mào)易的不斷增長(zhǎng)，長(zhǎng)小蠹類昆蟲隨木材及木質(zhì)包裝在世界各國擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)日益增大。日本檢疫部門從進(jìn)境原木中截獲大量的長(zhǎng)小蠹，并發(fā)現(xiàn)一些新種[4]。美國和加拿大檢疫部門從進(jìn)境木材中截獲10余種長(zhǎng)小蠹類有害昆蟲，部分種類已在北美地區(qū)定殖[5]。20世紀(jì)末期至今，國家對(duì)進(jìn)口木材一直實(shí)行零關(guān)稅政策；同時(shí)我國對(duì)木材量需求逐年增長(zhǎng)，近10余年來，我國原木、板材等木材進(jìn)口量大幅增長(zhǎng)，年均增長(zhǎng)20%以上。隨著木材的大量進(jìn)境，疫情檢出率逐年升高，在截獲的眾多有害生物中，長(zhǎng)小蠹是截獲頻次較多的一大類林木害蟲，口岸檢驗(yàn)檢疫部門每年都從進(jìn)境木材中截獲大量的長(zhǎng)小蠹，年均增長(zhǎng)15%。同時(shí)長(zhǎng)小蠹的一些種類具有很強(qiáng)的擴(kuò)散入侵性。

隨著木材的大量進(jìn)口，伴隨著大量的長(zhǎng)小蠹昆蟲的發(fā)生，使我國森林生態(tài)和木材資源受到極大的威脅，造成巨額的損失，且該類害蟲的傳播、入侵能力較強(qiáng)，一旦入侵，將會(huì)對(duì)入侵地區(qū)產(chǎn)生嚴(yán)重危害。例如，原產(chǎn)非洲的平行長(zhǎng)小蠹(Euplatypusparallelus)，后隨原木、木質(zhì)包裝等傳入澳州和東南亞等國家和地區(qū)[2，6]，現(xiàn)已廣布于東南亞地區(qū)。柱體長(zhǎng)小蠹(Platypuscylindrus)，原發(fā)生于歐洲少數(shù)國家，后來傳播擴(kuò)散到歐洲大部分地區(qū)[7]。

目前，我國對(duì)國內(nèi)外長(zhǎng)小蠹類形態(tài)學(xué)系統(tǒng)分類鑒定、顯微形態(tài)鑒定等研究均較少，許多方面尚為空白。口岸植物檢疫部門在進(jìn)境木材中截獲的該類昆蟲檢疫鑒定方面還較薄弱，對(duì)一些潛在危險(xiǎn)性類群的檢疫鑒定還無法解決。植檢技術(shù)人員因相關(guān)檢疫鑒定資料專著、文獻(xiàn)等的缺乏，進(jìn)境木材截獲的長(zhǎng)小蠹類部分種類只能鑒定到科、屬級(jí)的水平。這種現(xiàn)狀對(duì)出入境檢疫部門進(jìn)一步研究和掌握國外該類昆蟲中重要木材害蟲種類、危害性及防疫工作十分不利，影響對(duì)國外該類昆蟲潛在危險(xiǎn)性種類科學(xué)、合理地確定。同時(shí)，由于長(zhǎng)小蠹類的鑒定對(duì)分類專業(yè)水平要求高，且需長(zhǎng)期從事檢疫鑒定積累經(jīng)驗(yàn)。因此，一種簡(jiǎn)便而快速的檢疫鑒定方法對(duì)于該類害蟲的防治具有重要意義，查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)DNA條形碼技術(shù)在昆蟲的分類鑒定中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因此，我們期望通過DNA條形碼技術(shù)對(duì)長(zhǎng)小蠹類昆蟲進(jìn)行快速檢疫鑒定。

1 DNA條形碼技術(shù)及原理

自林奈建立雙命名法以來，有170多萬種物種被命名，在此過程中形態(tài)學(xué)家需要付出極大的努力，而傳統(tǒng)物種鑒定方法存在一定的局限性。物種的表型可塑性、遺傳變異性、對(duì)專業(yè)知識(shí)的高要求性等，導(dǎo)致鑒定錯(cuò)誤非常普遍。為了克服這些問題，學(xué)者們提出通過DNA對(duì)物種進(jìn)行鑒定[8-11]。

2003年3月，美國冷泉港召開Taxonomy and DNA會(huì)議，在這次會(huì)議上，加拿大科學(xué)家Hebert 等[12-13]首次提出DNA Barcode的概念，即生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段，自DNA條形碼技術(shù)被提出后，在短短幾年中大量的物種條形碼基因被測(cè)定。

眾所周知，A、T、C和G 4種堿基的排列構(gòu)成基因的信息存于DNA中，每個(gè)位點(diǎn)都可以由這4種堿基組成，那么一條含有n個(gè)堿基組成的基因，可能形成的序列就有4n種。10億個(gè)物種編碼序列只需15個(gè)堿基就可以，雖然實(shí)際上堿基的排列并不是隨機(jī)排列，部分位點(diǎn)存在高度的保守性，但是從理論上可以確定一段幾百個(gè)堿基組成的序列也足以包含能夠鑒定該物種的信息[14]。

2003年加拿大科學(xué)家Hebert等[12]提出以線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(COI)基因5′端648 bp 的序列作為標(biāo)準(zhǔn)，建立DNA條形碼物種鑒定系統(tǒng)。Hebert等[12-13]通過對(duì)7個(gè)不同門的中100個(gè)物種進(jìn)行分析，研究COI基因的組成，結(jié)果表明通過COI基因的系統(tǒng)發(fā)育分析可將96%的物種分類到正確的門中。此后又對(duì)地球上物種豐富度最高的六足綱進(jìn)行同樣的分析[15]，選擇的研究對(duì)象為其中物種豐度最高的8目100屬，并表明指定的50個(gè)新分類群的正確順序。最后，他們通過對(duì)COI序列的測(cè)定，了解該基因?qū)[翅目昆蟲正確鑒定的能力，由于在這個(gè)屬之間的序列差異最低。因此，對(duì)鱗翅目昆蟲物種鑒定具有極大的挑戰(zhàn)性，而且該目中昆蟲物種數(shù)最多。在這個(gè)測(cè)試中，涉及到200個(gè)親緣關(guān)系密切的物種，隨后分析結(jié)果對(duì)150個(gè)新物種進(jìn)行鑒定，結(jié)果鑒定成功率為100%。自此，開啟了以COI作為物種鑒定標(biāo)準(zhǔn)的熱潮。

2 DNA條形碼技術(shù)在長(zhǎng)小蠹及其他昆蟲中的應(yīng)用

2.1DNA條形碼技術(shù)在長(zhǎng)小蠹類昆蟲分類鑒定中的應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)在長(zhǎng)小蠹類昆蟲的應(yīng)用相對(duì)較少，國內(nèi)外的相關(guān)研究報(bào)道也較少。王銀竹等[16]通過線粒體基因COI基因5’端的549 bp序列對(duì)長(zhǎng)小蠹科5屬10種進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化研究，結(jié)果表明根據(jù)MP、ML及NJ構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，NJ樹顯示的進(jìn)化關(guān)系與Wood等[2]及Bright[1]提出的最新長(zhǎng)小蠹分類系統(tǒng)一致。歷史上長(zhǎng)小蠹類昆蟲分類一直比較混亂，且分類地位也存在爭(zhēng)議，通過分子手段對(duì)長(zhǎng)小蠹的研究表明，最新的分類系統(tǒng)與分子研究結(jié)果相一致。由于長(zhǎng)小蠹類昆蟲的分子研究極其缺乏，對(duì)現(xiàn)有的分類系統(tǒng)的佐證缺乏大量的數(shù)據(jù)，因此對(duì)于DNA條形碼技術(shù)在長(zhǎng)小蠹類昆蟲中的應(yīng)用迫在眉睫。此外，王銀竹[17]通過反向雜交技術(shù)(PCR-RDB)對(duì)長(zhǎng)蠹科及長(zhǎng)小蠹科22種昆蟲進(jìn)行快速檢疫鑒定研究。通過線粒體基因COI序列，構(gòu)建特異性反向雜交探針，通過探針與特定序列的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)9種長(zhǎng)蠹、9種長(zhǎng)小蠹及3種小蠹的快速鑒定，靈敏度達(dá)到pg級(jí)。

Jordal[18]對(duì)長(zhǎng)小蠹科80種以及8個(gè)外類群進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化研究，通過COI、EF-1a、CAD、ArgK和28S5個(gè)基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示Tesserocerini、Notoplatypus和Platypodini為3個(gè)姊妹群，且在進(jìn)化中Tesserocerini和Notoplatypus最早出現(xiàn)分化；從進(jìn)化樹中可以看出，各屬的關(guān)系比較混亂，并不能形成一個(gè)獨(dú)立的分枝，表明現(xiàn)有的分類并不能與分子鑒定結(jié)果形成統(tǒng)一的結(jié)論。由于長(zhǎng)小蠹類昆蟲的分子數(shù)據(jù)匱乏，現(xiàn)有的分子數(shù)據(jù)與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果存在較大的出入，因此對(duì)長(zhǎng)小蠹分類研究我們還有許多工作需要完成，最終形成分子鑒定結(jié)果與形態(tài)特征相一致的結(jié)果。

2.2DNA條形碼技術(shù)在其他昆蟲中的應(yīng)用對(duì)于昆蟲而言，線粒體基因COI為母系遺傳基因，作為系統(tǒng)發(fā)育研究的條形碼基因無疑可以滿足大部分昆蟲分類鑒定的需求。最初，COI基因中648 bp的基因被作為標(biāo)準(zhǔn)的條形碼基因用于物種鑒定，被廣泛的認(rèn)可；隨后的研究中，發(fā)現(xiàn)COI基因5’端的100 bp片段在用于博物館樣品鑒定中也同樣具有很高的鑒定成功率[19]，最后，通過大量的研究證明該片段對(duì)于真核生物的鑒定中也同樣具有非常高的成功率。COI基因作為DNA條形碼基因被廣泛用于物種的鑒定，同樣也是評(píng)價(jià)生物多用性的分子手段。除了線粒體基因中的COI基因被廣泛用于物種鑒定外，線粒體基因中其他12個(gè)蛋白編碼基因，以及核糖體基因12sRNA和16sRNA也被用于物種的鑒定。

近年來，DNA 條形碼技術(shù)在等翅目[20]、鞘翅目[21]、蜻蜓目[22]、直翅目[23]、彈尾目[24]、蜉蝣目[25]等中均已開展。

2.3DNA條形碼的局限性任何一種方法都不可能是萬能的，DNA條形碼在物種鑒定方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，同樣也存在它的局限性[26]?；贒NA的物種分類鑒定的方法是依據(jù)種間和種內(nèi)遺傳變異，但是對(duì)于近期分化的新種鑒定顯得比較困難，而且也不存在一個(gè)通用基因或者單一的一個(gè)基因作為DNA條形碼基因就能對(duì)所有的物種進(jìn)行分類鑒定，這也是不切實(shí)際的。DNA條形碼的鑒定是基于現(xiàn)在已經(jīng)確定的物種，對(duì)其基因進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析才得到的。這就需要大量的科學(xué)家尤其是傳統(tǒng)生物分類學(xué)家、分子生物學(xué)家、統(tǒng)計(jì)學(xué)家以及生物信息學(xué)家等相互合作，此外也需要許多的研究機(jī)構(gòu)的合作、信息的互通才能建立DNA條形碼的數(shù)據(jù)庫，從而為今后物種鑒定分類做好前期基礎(chǔ)性工作。

DNA條形碼基因通常選擇500～1 000 bp的片段，這個(gè)長(zhǎng)度相對(duì)于一個(gè)物種而言是非常短的，包含的信息也相對(duì)較少，因此在對(duì)于一些物種的鑒定中仍然會(huì)出現(xiàn)分析錯(cuò)誤的現(xiàn)象，當(dāng)然對(duì)于物種進(jìn)化關(guān)系的深入研究數(shù)據(jù)量可能也不夠。對(duì)于通過DNA條形碼技術(shù)對(duì)物種進(jìn)行鑒定的應(yīng)用價(jià)值仍然存在爭(zhēng)議，這種分類方法無疑降低了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類鑒定方法的難度，但是物種的分類只單獨(dú)通過基因的方法顯然也會(huì)增加鑒定錯(cuò)誤的可能性。

3 展望

盡管DNA條形碼的分類鑒定方法存在許多問題，但是該方法在物種分類鑒定中仍然存在極大的優(yōu)勢(shì)[27-28]。因此，應(yīng)該大力發(fā)展基于DNA的分類鑒定的方法，利用其快速、簡(jiǎn)便、所需鑒定人員少等優(yōu)點(diǎn)，使其為地球生物的起源、進(jìn)化的研究帶來質(zhì)的改變。正如基于DNA條形碼分類鑒定的優(yōu)勢(shì)和局限性，我們應(yīng)將DNA序列、形態(tài)學(xué)以及生態(tài)學(xué)相互結(jié)合，這樣才能更加準(zhǔn)確地對(duì)物種進(jìn)行分類鑒定。通過DNA條形碼技術(shù)無疑大大加快了地球物種分類鑒定的速度，大量的研究也同樣證明該方法的可行性。

長(zhǎng)小蠹類昆蟲由于具有種類繁多、形態(tài)特征相似度高等特點(diǎn)，給形態(tài)學(xué)家?guī)砹酥T多困難。在口岸截獲的長(zhǎng)小蠹類昆蟲，許多樣品均為卵、幼蟲、蛹及殘肢，無法從形態(tài)上進(jìn)行鑒定，因此通過DNA條形碼技術(shù)可以快速方便地進(jìn)行檢疫鑒定，可為害蟲的風(fēng)險(xiǎn)分析打下基礎(chǔ)。此外，截獲的樣品由于時(shí)間原因，蟲體內(nèi)的部分DNA已經(jīng)降解，可以通過研究開發(fā)微型DNA條形碼(Mini DNA barcoding)，從而增強(qiáng)DNA條形碼技術(shù)在長(zhǎng)小蠹類昆蟲的檢疫鑒定應(yīng)用研究。由于長(zhǎng)小蠹類昆蟲在國內(nèi)外通過分子鑒定研究的匱乏，我們需要加大對(duì)該方面的研究，增加長(zhǎng)小蠹類昆蟲的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。不僅可以加快長(zhǎng)小蠹類昆蟲的遺傳進(jìn)化關(guān)系的研究，而且對(duì)于檢疫部門對(duì)該類害蟲的截獲、風(fēng)險(xiǎn)分析、防治均具有重要的指導(dǎo)意義。