吸煙相關(guān)慢性阻塞性肺疾病中microRNAs差異性表達的研究進展

李 男，毛明清，宋 楠，加 慧，李云霞，夏書月*

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院2015級碩士研究生，遼寧沈陽110034；2.沈陽醫(yī)學(xué)院2016級碩士研究生；3.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科）

吸煙相關(guān)慢性阻塞性肺疾病中microRNAs差異性表達的研究進展

李 男1，毛明清2，宋 楠2，加 慧3，李云霞3，夏書月3*

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院2015級碩士研究生，遼寧沈陽110034；2.沈陽醫(yī)學(xué)院2016級碩士研究生；3.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructivepulmonary disease，COPD）是一種以持續(xù)性氣流受限為特征的慢性炎癥性疾病。吸煙是導(dǎo)致COPD的重要原因之一。microRNAs（miRNAs）是一類高度保守的短鏈非編碼RNA，參與調(diào)控基因的表達。研究表明吸煙可致miRNAs的表達上調(diào)或下調(diào)進而參與COPD的生物學(xué)過程，提示miRNAs可能成為COPD的診斷及治療的新靶點。

慢性阻塞性肺疾??；miRNAs；差異性表達；吸煙

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種可防治的常見疾病，其特征為持續(xù)存在的氣流受限，其與慢性支氣管炎和肺氣腫有密切關(guān)系［1］。慢性炎癥反應(yīng)不但會導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)變化和小氣道縮窄，還可能會引起肺實質(zhì)破壞及正常的防御和修復(fù)機制被破壞，導(dǎo)致肺氣腫及小氣道纖維化，從而使附著在小氣道的肺泡減少，肺的彈性回縮力降低，進而降低呼氣時氣道通氣能力［2］。COPD發(fā)生率正在逐年升高［3-4］。據(jù)統(tǒng)計，COPD居全球死亡原因第3位，世界銀行/世界衛(wèi)生組織資料表明，至2020年COPD將位居世界疾病經(jīng)濟負擔(dān)第5位［5］，嚴(yán)重地影響人類的生活質(zhì)量及生存指數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs（miRNAs）可參與如肺癌、COPD、哮喘、特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（IPF）等多種肺部疾病的發(fā)病過程［6］，尤其在COPD炎性反應(yīng)方面關(guān)系密切，因此，miRNAs可能成為COPD診斷與治療的新靶點。

1 COPD發(fā)病機制研究現(xiàn)狀

COPD的危險因素主要包括相互影響的個體易感因素和環(huán)境因素兩大方面。個體因素主要是α1-抗胰蛋白酶（alpha 1 antitrypsin，α1-AT）缺乏，且是目前唯一明確的遺傳因素，但國內(nèi)尚未正式報道缺乏該酶所致的COPD病例。環(huán)境因素主要包括吸煙、職業(yè)因素（如煤礦工人）、大氣污染、被動吸煙、呼吸道感染等［7］。COPD發(fā)病機制主要包括：氧化-抗氧化失衡、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、炎性反應(yīng)、凋亡-抗凋亡失衡、免疫失衡、自然基因突變等［8-16］，且大部分與吸煙存在相關(guān)性。根據(jù)我國COPD流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，吸煙者的COPD發(fā)病率為13.2%［17］，吸煙者患COPD比不吸煙者多3～5倍［18］，吸煙被認為是導(dǎo)致COPD最重要的環(huán)境因素。香煙煙霧中含有千種有害物質(zhì)［19］，除了尼古丁、重金屬及致癌物質(zhì)等，其含有的氧化劑包括烷基、烷?；⑦^氧化氫的有機自由基、a、β-不飽和醛、超氧化物、N2O和一氧化氮等，可通過觸發(fā)NF-κB促進炎癥反應(yīng)［20］，而丙烯醛、甲基乙烯基酮、環(huán)戊烯酮等具有細胞毒作用的物質(zhì)，可以損害細胞質(zhì)膜和影響細胞活力，從而引起呼吸上皮的凋亡或壞死，導(dǎo)致COPD的發(fā)生及進展［21］。香煙煙霧含有高濃度的自由基氧化物，進入呼吸道后不僅能促使吸煙者肺內(nèi)肺泡巨噬細胞產(chǎn)生大量的氧自由基，可使肺局部巨噬細胞凋亡、中性粒細胞聚集和激活并釋放白細胞介素 6［22］、白細胞介素 8［23］、腫瘤壞死因子α［24］等多種炎性介質(zhì)和中性粒細胞蛋白酶、胰蛋白酶等多種蛋白酶［25］，加劇氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)氧化-抗氧化失衡。同時，產(chǎn)生的氧自由基還可以滅活α1-AT，導(dǎo)致肺內(nèi)蛋白酶-抗蛋白酶平衡失調(diào)［26］。

2 miRNAs的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及研究方法

miRNAs是由基因組編碼的一組非編碼小RNA分子，由18～22個核苷酸組成，其通過與相應(yīng)的靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（UTR）以堿基配對形式結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的表達，參與多種細胞生物學(xué)進程［27］。miRNAs約占人類基因組的3%，調(diào)控了約30%編碼蛋白質(zhì)的mRNA［28］。數(shù)據(jù)顯示，目前miRNAs有24 521種，含有30 424種成熟miRNAs產(chǎn)物，存在于206個物種中［29］。miRNAs來源于初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（pri-miRNA），在細胞核內(nèi)經(jīng)核糖核酸內(nèi)切酶Ⅲ（Drosha）進行第一步剪切形成前體miRNAs（pre-miRNA）后，通過Exportin-5的轉(zhuǎn)運機制將其轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)內(nèi)，隨后在另一類核糖核酸內(nèi)切酶Ⅲ（Dicer）的第二次剪切形成成熟miRNAs［30］。有證據(jù)表明 microRNAs與細胞分化、增殖、生長、遷移和凋亡都有著密切的關(guān)系，是參與調(diào)節(jié)細胞生物功能的重要分子［31］。miRNAs目前的研究方法主要包括miRNAs的分離純化和miRNAs的檢測與鑒定兩個方面，其檢測鑒定技術(shù)包括克隆測序法、Northern印跡技術(shù)、微陣列芯片、原位雜交、實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、新一代大規(guī)模測序技術(shù)等，為mRNAs的生物學(xué)功能及遺傳學(xué)等方面研究提供了重要的研究基礎(chǔ)［32-33］。

3 吸煙相關(guān)COPD中miRNAs差異性表達

研究表明，煙熏（cigarette smoke，CS）可誘發(fā)人和鼠肺等組織的miRNAs的表達發(fā)生變化，高達70余種miRNAs表達異常。吸煙者血漿中43種miRNAs顯著高于非吸煙者［34］。Izzotti等［35］研究發(fā)現(xiàn)，暴露于環(huán)境香煙煙霧（environmental cigarette smoke，ECS）中的大鼠通過下調(diào)體內(nèi)miRNAs，如let-7、miR-10、miR-26、miR-30、miR-34、miR-99、miR-122、miR-123、miR-124、miR-125等，可調(diào)節(jié)機體的應(yīng)激反應(yīng)、細胞凋亡、組織增殖及血管形成等生物過程。以下主要對吸煙相關(guān)COPD中差異性表達的miRNAs進行總結(jié)，見表1。Shi等［36］對肺組織樣品中的11個候選miRNAs進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COPD患者和非COPD吸煙者較非吸煙者miRNAs表達譜中 miR-181a、miR-203、miR-338、miR-1和miR-199a表達異常，在COPD患者中miR-1和miR-199a的表達顯著下調(diào)，miR-181a和miR-338的表達則顯著上調(diào)，而miR-203在非COPD吸煙者中的表達顯著高于對照組，在COPD患者中的表達則顯著低于對照組；對外周血樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)這5個miRNAs中僅有miR203在COPD患者和非COPD吸煙者中表達上調(diào)；進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-203可通過靶向TAK1和PIK3CA來抑制NF-κB信號通路，導(dǎo)致TNF-α和IL-6的表達水平下降，進而誘導(dǎo)COPD的發(fā)生。Shen等［37］研究發(fā)現(xiàn)，吸煙可致COPD患者體內(nèi)miR-149-3p表達下調(diào)，通過TLR-4/NF-κB信號通路促進IL-1β和TNF-α炎癥因子的表達，加重COPD的炎性反應(yīng)。Conickx等［38］研究發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p在吸煙無氣道障礙和COPD患者中較不吸煙患者表達量明顯下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)其與氣道阻塞密切相關(guān)，在吸煙所致的炎癥和COPD的發(fā)展中起保護作用。Akbas等［39］通過測定吸煙COPD患者與健康吸煙人群的血清中miRNAs，發(fā)現(xiàn)在吸煙COPD患者中，miR-20a、miR-28-3p、miR-34c-5p和 miR-100表達下調(diào)，而miR-7表達上調(diào)，這些miRNAs差異性表達可能參與到COPD的發(fā)病機制。根據(jù)Xie等［40］的研究發(fā)現(xiàn)，重度吸煙者及COPD患者miR-21表達較健康不吸煙者顯著上調(diào)，而miR-181a表達則顯著下調(diào)，提示COPD患者血清中miR-21和miR-181a的表達水平及其比率（靈敏度0.854、特異度0.850）可用于判斷COPD的進展程度，也可能與重度吸煙COPD急性期發(fā)作相關(guān)。李蓓等［41］使用內(nèi)毒素氣道滴入聯(lián)合煙霧法建立COPD大鼠模型，應(yīng)用高通量測序技術(shù)和實時PCR檢測大鼠肺組織miRNAs的表達譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，COPD模型組大鼠肺組織有20種miRNAs表達上調(diào)，其中表達顯著上調(diào)前10位依次為miR-30c-2、miR-199a-5p、miR-30a、miR-145、miR-151、miR-674-5p、miR-214、miR-423、miR-28、miR-181b；而表達顯著下調(diào)的miRNAs只有miR-376b-3p。相應(yīng)的靶基因mRNA則對應(yīng)上調(diào)或下調(diào)，其中miR-30c、miR-145、miR-181b、miR-181a、miR-181d、miR-199可能是潛在的調(diào)控靶標(biāo)，它們主要在細胞免疫、血管生成、纖維化形成、細胞周期調(diào)控等方面發(fā)揮作用。Dang等［42］通過檢測外周血單個核 細 胞（peripheral blood nuclear cells，PBMC）miRNAs表達譜發(fā)現(xiàn)，與無氣流受限的吸煙者相比，COPD患者中有8種表達上調(diào)miRNAs和3種表達下調(diào)miRNAs，其中miR-24-3p、miR-93-5p、miR-320a、miR-320b和 miR-1273g-3p在 2組PBMC中均有表達，miR-1273g-3p在無氣流受限的吸煙者中最高表達，而miR-320a和miR-320b在COPD患者中表達更高。相關(guān)性分析顯示，miR-24-3p、miR-320a和miR-320的表達與肺功能FEV1%呈負相關(guān)，而miR-1273g-3p表達與其呈正相關(guān)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，通過核苷酸寡聚化域樣受體（NOD-like receptor，NLR）和Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）通路，miR-24-3p可調(diào)控下游靶基因IL-18、IL-1β、TNF、CCL3和 CCL4，miR-93-5p可調(diào)控下游靶基因IκBα，而這些下游的細胞因子均與COPD的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。

綜上所述，吸煙相關(guān)COPD患者中存在多種miRNAs的差異表達，并通過相關(guān)機制參與COPD的發(fā)生發(fā)展。吸煙是致使COPD患者miRNAs異常表達的重要影響因素。miRNAs檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，將有助于研究者對miRNAs在COPD發(fā)病機制中的作用進行深入研究，以期探索特異性miRNAs作為新靶點，為COPD的診斷、靶向治療及預(yù)后評估等提供新的思路和方法。

表1 吸煙相關(guān)COPD中miRNAs的差異性表達

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Research Progress of Differential Expression of microRNAs in Smoking Related Chronic Obstructive Pulmonary Disease

LINan1，MAOMingqing2，SONGNan2，JIA Hui3，LIYunxia3，XIA Shuyue3*
（1.Postgraduate of Grade 2015，Shenyang Medical College， Shenyang 110034，China； 2.Postgraduate of Grade 2016；3.Department of Respiratory Disease，The Center Hospital Affiliated to Shenyang Medical College）

Chronic obstructive pulmonary disease （COPD） is a chronic inflammatory disease characterized by persistent airflow limitation.Smoking is one of the important causes of COPD.MicroRNAs （miRNAs） are highly conserved small non-coding RNAs with a regulatory function on gene expression.Studies have shown that smoking can cause the dysregulation of miRNAs，which is involved in the development and progression of COPD.It is suggested that miRNAs could be developed as new targets for diagnosisand treatment of COPD.

chronic obstructivepulmonary disease； miRNAs； differential expression；smoking

R563.9

A

1008-2344（2017）05-0432-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.05.016

遼寧省教育廳計劃項目（No.L2014419）；沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃項目（No.F16-156-9-00）

夏書月（1962—），女（漢），主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：大氣細顆粒物對呼吸道影響的臨床和基礎(chǔ)研究.E-mail：syx262@126.com

2017-02-23

（毛亞萍編輯）