納米材料體外細(xì)胞毒性研究現(xiàn)狀與展望

汪保林 邱慧

摘要 納米科學(xué)是上個世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的新興學(xué)科，是21世紀(jì)最有前途的新科學(xué)技術(shù)之一。隨著納米材料應(yīng)用的日益廣泛，其所帶來的健康風(fēng)險也越來越大，對其生物安全性的研究也刻不容緩。文章就納米材料的毒性影響因素，對細(xì)胞造成的毒性效應(yīng)機制及其體外細(xì)胞毒性的評價方法進(jìn)行詳細(xì)闡述，并綜述了近幾年來關(guān)于納米材料毒性研究的最新進(jìn)展及對納米技術(shù)安全性評估進(jìn)行了系統(tǒng)的討論。

關(guān)鍵詞 納米材料；細(xì)胞毒性；影響因素；評價方法

Abstract Nanoscience emerged in the last 1980 s and is developed as one of the most promising new science and technology in the 21st century. With the increasing widespread application of nanomaterials，their health risk has been greatly increased and researches on its biological safety are imperatively needed. In this paper，the toxic influential factors，the cytotoxicity mechanism of nanomaterials and the evaluation methods on cytotoxicity of nanomaterials in vitro were elucidated in detail. Simultaneously，the latest developments on the toxicity of nanomaterials and the security assessment of nano technologies were also systematically discussed.

Key Words Nanomaterials；Cytotoxicity；Influential factors；Evaluative methods

中圖分類號：R-331；R319文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.052

從“納米牙膏”到“納米防曬霜”，全球目前已有300多種運用納米技術(shù)上市的產(chǎn)品。納米技術(shù)開始走進(jìn)人們的生活圈，它們在環(huán)境和人群中的暴露率大大增加。目前對納米材料可能的、潛在的安全性問題報道甚少。因此，對納米顆粒生態(tài)安全性的評估也刻不容緩。雖然納米材料的應(yīng)用在一般情況下都不會造成嚴(yán)重的直接暴露，但納米材料一旦進(jìn)入機體就會在體內(nèi)蓄積，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的生物毒性。大量研究表明：正常無害的大分子物質(zhì)一旦做成納米級可能會具有潛在毒性。與此同時，工程化納米材料在醫(yī)學(xué)診斷和治療上的有效利用，造成機體對納米顆粒的細(xì)胞攝取，循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運與分布的特殊動力學(xué)行為，也成為了納米材料致生物毒性的主要原因[1]。綜上所述，只有全面了解納米材料的毒性行為，才能更好地應(yīng)用納米材料并發(fā)展納米技術(shù)。

1 納米材料的毒性影響因素

納米材料的毒性取決于多種因素，除了與材料的純度，尺寸大小，化學(xué)結(jié)構(gòu)，團(tuán)聚狀態(tài)，劑量大小及所帶電荷相關(guān)外，還與曝露時間，曝露途徑以及納米材料的表面修飾、表面活性密切相關(guān)[2]。不同納米材料的毒性效應(yīng)存在差異，一般情況下，納米顆粒粒徑越小，其潛在毒性越大[3]。而這種差異與顆粒本身的其他特殊性質(zhì)如表面特征，聚合狀態(tài)以及化學(xué)組成等有密切關(guān)系[4]。

在體外毒性實驗中，納米顆粒會被分散于細(xì)胞培養(yǎng)基中，此時，顆粒處于水溶液環(huán)境，包括粒徑等其他特征會發(fā)生相應(yīng)變化，而這些變化很可能會影響到顆粒與生物體的作用方式及強度大小。動物實驗發(fā)現(xiàn)：經(jīng)體外灌注產(chǎn)生的納米毒性效應(yīng)與顆粒的粒徑和表面積息息相關(guān)，即隨著納米顆粒減小，其表面積會增大，隨后會產(chǎn)生更強的炎性反應(yīng)[1]。與此同時，劑量大小也是影響納米顆粒細(xì)胞毒性的重要關(guān)鍵因素。在0～15 ppm的研究范圍內(nèi)，納米SiO2對鼠胚胎成纖維細(xì)胞和人體皮瘤細(xì)胞無明顯毒性作用，但當(dāng)納米SiO2顆粒劑量高于138 μg/mL時，會導(dǎo)致細(xì)胞膜的嚴(yán)重?fù)p傷[5]。多數(shù)納米金屬及其金屬氧化物顆粒在水溶液中易發(fā)生團(tuán)聚效應(yīng)，團(tuán)聚后的顆粒其粒徑大小決定了顆粒是通過細(xì)胞內(nèi)吞作用，ROS誘導(dǎo)的吞噬作用還是其他機制進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[6]。暴露途徑?jīng)Q定了生物屏障和納米材料間的作用關(guān)系。就目前的研究來看，肺部是納米顆粒主要的攝入器官，呼吸途徑毒性是明確的，納米材料可引起機體呼吸系統(tǒng)的炎性反應(yīng)，但口服、皮膚接觸，正常機體非疾病狀態(tài)時，納米材料其實無法突破生物屏障。據(jù)報道，細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷，因此細(xì)胞易與表面帶正電荷的顆粒、離子以及小分子物質(zhì)發(fā)生相互作用，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[7]，在細(xì)胞內(nèi)蓄積并產(chǎn)生嚴(yán)重的生物毒性。Richards，D等研究表明，無機材料包覆的納米顆粒的表面電荷及表面疏水性是細(xì)胞毒性的可控因素，表面帶正電荷的納米材料相對其他帶負(fù)電荷或中性的納米材料而言具有更強的毒性效應(yīng)，且納米顆粒的細(xì)胞毒性效應(yīng)也會隨著表面疏水性的增強而增強[8]。目前，對于多數(shù)納米材料的毒性評價都只停留在簡單的表面毒性方面，對于其毒性機制的研究尚不深入，急需廣泛關(guān)注。

2 納米顆粒細(xì)胞毒性發(fā)生機制

研究細(xì)胞毒性效應(yīng)產(chǎn)生主要包括以下3個方面：線粒體活性的抑制，細(xì)胞膜完整性、通透性的改變，其次是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死。具有不同理化性質(zhì)的納米材料可通過不同的毒性機制產(chǎn)生不同的炎性反應(yīng)及毒性反應(yīng)。Lai等將納米顆粒與細(xì)胞相互作用后誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性及其他反應(yīng)機制歸納為如下幾點[9]：1）與細(xì)胞膜發(fā)生相互作用，引起離子轉(zhuǎn)運及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的不穩(wěn)定性甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡；2）與線粒體發(fā)生相互作用，改變新城代謝途徑或者干預(yù)抗氧化防護(hù)體系和ROS的產(chǎn)生；3）與DNA發(fā)生作用，破壞DNA片段結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)胞周期的分裂和蛋白質(zhì)的合成；4）與細(xì)胞骨架發(fā)生相互作用，阻礙囊泡的運轉(zhuǎn)，產(chǎn)生機械性損傷并導(dǎo)致細(xì)胞死亡；5）與磷脂、蛋白質(zhì)或者其他生物大分子作用，造成不同程度的細(xì)胞損傷。

線粒體是對各種細(xì)胞損傷最為敏感的細(xì)胞器之一，在細(xì)胞損傷時最常見的病理改變主要包括線粒體大小，數(shù)量以及結(jié)構(gòu)的改變，凋亡或受損的線粒體最終可由細(xì)胞的自噬過程加以處理并被溶酶體降解消化。Chou cc[21]等指出，小鼠經(jīng)灌注SWCNT后，肺組織病理切片中發(fā)現(xiàn)肺巨噬細(xì)胞可經(jīng)內(nèi)吞作用攝入SWCNT，并隨著時間和劑量的增加肺巨噬細(xì)胞內(nèi)沉積的SWCNT顆粒越多，甚至能產(chǎn)生肉芽腫病變。上述研究充分證明了碳納米管確實可以與細(xì)胞膜表面發(fā)生相互作用，并在細(xì)胞內(nèi)沉積，繼而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。但是，目前關(guān)于CNT進(jìn)入細(xì)胞的途徑研究尚處于探索階段，需要進(jìn)一步深入證實。

納米顆粒誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的機制主要是當(dāng)金屬型納米顆粒分散在適當(dāng)試劑當(dāng)中會催化ROS的生成，發(fā)生Fenton反應(yīng)，從H2O2氧化得到OOH-和OH-等氧化離子。此外，一些惰性納米材料雖然不具備自發(fā)生成ROS的能力，但是當(dāng)納米離子能夠靶向聚集在線粒體時，在一些生物條件下能夠誘導(dǎo)ROS的生成。低水平的氧化應(yīng)激會促使機體保護(hù)性反應(yīng)的發(fā)生，而高水平的氧化應(yīng)激則會導(dǎo)致機體的過氧化損傷[10]。細(xì)胞組織在受到自由基的氧化脅迫時，構(gòu)成細(xì)胞組織的各種物質(zhì)如糖類、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及DNA等大分子物質(zhì)會發(fā)生各種氧化反應(yīng)，導(dǎo)致交聯(lián)、變性、斷裂等氧化損傷以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，產(chǎn)生機體組織和器官的病變，最終導(dǎo)致毒性反應(yīng)。

Nel等[10]也提出ROS的生成和機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)是納米材料誘導(dǎo)多種生物毒性效應(yīng)的重要機制。納米SWCNTs，SiO2，ZnO對小鼠胚胎成纖維的毒性研究結(jié)果表明，納米ZnO的細(xì)胞毒性高于其他非金屬納米顆粒，可引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平的顯著上升，谷胱甘肽的大量耗竭，丙二醛以及超氧化物歧化酶含量的明顯降低，在此證明氧化應(yīng)激可能是納米材料細(xì)胞毒性的一個主要途徑[4]。An等[11]發(fā)現(xiàn)，碳納米管可結(jié)合于DNA上，導(dǎo)致DNA的損傷，造成機體遺傳毒性。綜上可知，納米材料會造成細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)損傷，存活率下降，細(xì)胞內(nèi)氧化自由基水平升高以及DNA斷鏈等毒性反應(yīng)，致使細(xì)胞在一定條件下發(fā)生凋亡。

3 體外細(xì)胞毒性實驗研究現(xiàn)狀

體外毒性檢測主要包括2個方面：納米顆粒在無細(xì)胞體系中的活性和納米顆粒與細(xì)胞的相互作用。納米顆粒在細(xì)胞體系中的活性包括蛋白質(zhì)的反應(yīng)，補體激活以及氧化自由基的產(chǎn)生等。檢測納米材料與細(xì)胞的作用首先是要區(qū)別是什么細(xì)胞毒性，而一般藥物的毒性作用不是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡就是細(xì)胞壞死。

3.1 氧化應(yīng)激檢測方法

納米顆粒致細(xì)胞毒性的一個重要途徑就是誘導(dǎo)發(fā)生氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激反應(yīng)主要的檢測方法有：通過DCFH-DA[12]熒光標(biāo)記法，黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法，羅丹明123熒光染色，硫代巴比妥酸法等檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量；Amplex Red熒光染色可檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氫過氧化物；C11-BODIPY熒光染色，GSH試驗方法[13]等檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化；免疫印跡法檢測SOD的表達(dá)，氯化硝基四氮唑蘭（NBT）可檢測細(xì)胞內(nèi)SOD的活性，DTNB可檢測機體抗氧化系統(tǒng)的損傷。

3.2 細(xì)胞凋亡檢測方法

細(xì)胞凋亡是指機體在一定的生理或病理條件下，遵循一定程序自身結(jié)束生命的過程。細(xì)胞核濃縮、染色體凝聚、DNA片段化、細(xì)胞縮小、分解，凋亡小體的形成等是細(xì)胞凋亡的主要形態(tài)變化特征，但對周圍細(xì)胞無明顯影響?？捎糜跈z測細(xì)胞凋亡的試驗主要包括如下幾種方法：

形態(tài)學(xué)觀察：普通光學(xué)顯微鏡（Ordinary Optical Microscopy），熒光顯微鏡（Fluorescence Microscope）和透射電子顯微鏡（Transmission Electron microscopy，TEM）可對染毒細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行分析。凋亡細(xì)胞形態(tài)依據(jù)為：細(xì)胞染色質(zhì)濃集，靠近核膜，產(chǎn)生核邊集現(xiàn)象；染色質(zhì)斷裂、核膜裂解，凋亡小體形成等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)。

DNA損傷所引起的細(xì)胞毒性效應(yīng)檢測方法主要有彗星試驗，TUNEL法，流式細(xì)胞儀法[14]等檢測手段，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡的常用方法包括：1）DNA熒光檢測；2）抗熒光抗體染色熒光檢測；3）末端標(biāo)記法檢測；4）線粒體膜電位檢測。彗星試驗是將少量分散的細(xì)胞與低熔點瓊脂糖液混合后鋪在預(yù)冷的瓊脂板上制成的，經(jīng)細(xì)胞裂解和堿性解旋，并在堿性環(huán)境下進(jìn)行電泳；當(dāng)DNA存在斷裂損傷時，細(xì)胞核會形成一個類似彗星的圖像，根據(jù)彗星的頭部和尾部的含量比率，進(jìn)而確定細(xì)胞DNA損傷的程度。TUNEL法的原理是：當(dāng)細(xì)胞凋亡時，染色體DNA會斷裂并產(chǎn)生大量的3-OH粘性端，在相關(guān)轉(zhuǎn)移酶的作用下，將脫氧核糖核苷酸與過氧化物酶或堿性磷酸酶的反應(yīng)形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3-OH端，并通過熒光定量分析或酶聯(lián)顯色技術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。AMES試驗及微核檢測法可用于納米材料誘導(dǎo)的基因遺傳毒性檢測[15]。FITC-Annexin V/PI雙熒光標(biāo)記法[16]，DNA階梯法（DNA ladder）[17]，Caspase[18]發(fā)光實驗也可用于檢測細(xì)胞凋亡。

3.3 細(xì)胞壞死檢測方法

細(xì)胞壞死是在病理條件下產(chǎn)生的被動死亡（凋亡是主動死亡），如物理性或化學(xué)性的損害因子及缺氧與營養(yǎng)不良等均導(dǎo)致細(xì)胞壞死。壞死細(xì)胞的膜通透性增高，致使細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器變形或腫大，早期核無明顯形態(tài)學(xué)變化，最后細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)含物釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致炎性反應(yīng)。細(xì)胞膜完整性是一個可以用來評價細(xì)胞活力的指標(biāo)，因此細(xì)胞壞死檢測可包括LDH法[19]，熒光物質(zhì)檢查法，臺盼蘭法（Trypan Blue）[20]，中性紅（Neutral Red Assay）[21]以及碘化丙啶（PI）[22]染色法等。乳酸脫氫酶（LDH）是細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的蛋白酶，主要存在于正常細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受損傷或凋亡時會釋放到細(xì)胞外；LDH能催化乳酸形成丙酮酸鹽，丙酮酸鹽和四氮唑鹽反映形成紫色的結(jié)晶物質(zhì)甲瓚，可在490～500 nm出測量吸光度值，從而判斷細(xì)胞壞死程度，此法操作簡便、快捷，是常用的納米材料細(xì)胞毒性評價的方法。目前，熒光物質(zhì)已成為流式細(xì)胞儀或微孔板細(xì)胞檢測中的理想物質(zhì)，這些熒光物質(zhì)可以是細(xì)胞膜通透的或者是細(xì)胞膜非通透的，他們或者直接結(jié)合與核酸，或者要求主動的細(xì)胞代謝來產(chǎn)生可檢測的熒光，從而檢測細(xì)胞活性。這類方法檢測速度快，通量大、成本低，越來越受到科研工作者的青睞。染料排斥法是測定細(xì)胞存活率常用方法，其原理是存活得細(xì)胞可排斥多種染料而不著色，嚴(yán)重受損細(xì)胞因細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，染料可以通過細(xì)胞膜而被著色，臺盼藍(lán)（Trypan Blue）以及碘化丙啶（PI）是該法常用的染料。中性紅（Neutral Red）是弱的陽離子染色劑，能通過細(xì)胞擴(kuò)散，積累在細(xì)胞溶酶體里，如果細(xì)胞膜發(fā)生改變，中性紅的攝入量就會減少及漏出，可通過測量中性紅攝入的光子譜來區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞，判別細(xì)胞毒性。Wilhelmi等采用LDH法來檢測納米顆粒對RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性[23]，方法簡便，結(jié)果可靠。

免疫印記法與CDDE（Cell Death Detection ELISA）法，吖啶橙/溴乙非啶（Acridine Orange/ethidium Bromide）[24]試驗及FITC-Annexin V/PI[25]雙熒光標(biāo)記也可用于細(xì)胞毒性檢測，上述方法可用于區(qū)別細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死。Radziun等[16]采用Annexin V-FITC/PI雙熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞散點示意圖左下角為正常細(xì)胞百分含量，右下角為早期凋亡細(xì)胞百分含量，右上角為晚期凋亡細(xì)胞百分含量，以及左上角為壞死細(xì)胞百分含量。

3.4 細(xì)胞生長抑制檢測方法

細(xì)胞生長抑制實驗的方法包括MTT，XTT，WST-1/WST-8，MTS，TTC，Alamar Blue，[3H]胸腺嘧啶摻入法，Brude摻入法及細(xì)胞計數(shù)法等多種細(xì)胞增殖毒性研究方法。MTT，XTT，WST-1/WST-8，MTS，TTC等屬于四氮唑鹽類物質(zhì)，可以被線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原成有色甲瓚，然后通過酶標(biāo)儀記錄吸光度OD值，繼而檢測細(xì)胞毒性的大小。MTT比色法是目前納米材料細(xì)胞毒性分析最常用、最經(jīng)典的方法，MTT在溶液中呈淺黃色，可以被線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原生成難溶性的深紫色結(jié)晶甲瓚（formazan），并沉淀在細(xì)胞中（死細(xì)胞無此功能），在特定溶劑中完全溶解，通過酶標(biāo)儀在570 nm波長附近測定光吸收值。由于甲瓚形成量與細(xì)胞數(shù)成正比，從而可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。CCK-8是一種MTT的衍生化合物，可以被線粒體內(nèi)的一系列的氧化脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚晶體。細(xì)胞增殖速率越快，甲瓚產(chǎn)生的越多，顏色也會越深；因此細(xì)胞毒性越大顏色就越淺。對于同種細(xì)胞，溶液顏色的深淺與細(xì)胞數(shù)目呈正比。WST-8、MTS以及XTT產(chǎn)生的甲瓚晶體都是水溶性的，無需用加DMSO進(jìn)一步溶解，操作更加簡便。其次，WST-8產(chǎn)生甲瓚的比XTT和MTS產(chǎn)生的更加穩(wěn)定，測出的結(jié)果重現(xiàn)性更好。另外，MTT、XTT等相比WST-8其線性范圍更寬，靈敏度也更高。因此，CCK-8是檢測細(xì)胞活性最有利的手段之一。AlamarBlue比色法：細(xì)胞快速增殖過程中，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境會由氧化環(huán)境轉(zhuǎn)化為還原環(huán)境，其呼吸鏈中的NADPH/NADP，F(xiàn)ADH/FAD和NADH/NAD等的比值也會升高；AlamarBlue被細(xì)胞攝取后，在細(xì)胞質(zhì)中會被以上代謝中間體還原，而釋放到細(xì)胞外；被還原AlamarBlue的累積會使培養(yǎng)基由靛青藍(lán)轉(zhuǎn)變成粉紅色，并通過酶標(biāo)儀或分光光度儀來檢測培養(yǎng)基中OD值和熒光強度的變化，繼而分析細(xì)胞增殖的情況。相對MTT、WST、CCK等四唑鹽類物質(zhì)，AlamarBlue毒性最小，價格便宜，且染色后細(xì)胞還可以繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞毒性試驗的檢測手段多種多樣，但是一味的選擇最快、最貴的方法是不明智、不合理的。一些有關(guān)碳納米管的毒性研究結(jié)果分歧也相當(dāng)大。Worle-Knirsch[22]等指出，用MTT比色法進(jìn)行細(xì)胞活性測定得出碳納米管對A549細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)，而實際上，碳納米管可能會與MTT復(fù)合物反應(yīng)，繼而形成復(fù)雜的結(jié)合物，導(dǎo)致其不能被DMSO溶解，使測定吸光度下降，最終造成細(xì)胞活性下降的假陰性結(jié)果。然而，使用WST-1方法對細(xì)胞存活力進(jìn)行測定時，發(fā)現(xiàn)碳納米管并無細(xì)胞毒性。Richards[8]等采用MTT、中性紅、IL-8及透射顯微鏡等四種方法對碳納米管進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測。有趣的是，四種方法顯示出了不同結(jié)果。研究者將上述發(fā)現(xiàn)歸結(jié)于以下兩點：首先經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)納米材料能吸收MTT染料和中性紅染料而產(chǎn)生假陰性與假陽性結(jié)果；其次，碳納米材料具有吸收培養(yǎng)基中存在的營養(yǎng)物質(zhì)的潛能，這些都將降低細(xì)胞生長數(shù)并且誤導(dǎo)實驗結(jié)果。因此建議采用2種或2種以上的方法，包括CCK-8，MST，INT，XTT，WST-1，TTC等方法來同時測定納米材料的細(xì)胞毒性或者至少采用一種不會產(chǎn)生不良反應(yīng)可能性的研究手段來確證細(xì)胞毒性效應(yīng)。例如用顯微鏡來評估細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)，以便能夠?qū)嶒灲Y(jié)果的可靠性進(jìn)行相互佐證，防止出現(xiàn)類似錯誤的假象。

3.5 納米材料細(xì)胞毒性的最新檢測方法

納米微粒毒性研究的一大難題就是納米粒的毒性可能隨著其理化性質(zhì)（形狀，大小，凝結(jié)效應(yīng)，表面修飾，化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)晶作用）的改變而使納米材料變得復(fù)雜化，多樣差異化而難以評定。傳統(tǒng)的毒性測試使用的動物模型往往是不切實際的，因為它的時間密集，低容量，價格昂貴，并且只能檢測有限的效應(yīng)終點。鑒于上述問題，North等[26]提出了中心機制型高通量檢測技術(shù)（Mechanism-centered High-throughput Testing）。該方法可很好的解決納米材料因種類差異與數(shù)量龐大所引起的迫切問題依賴可預(yù)測性的新型毒性檢測系統(tǒng)，高通量篩選技術(shù)（High-throughput Screening，HTS）也許會成為評估納米材料生物毒性的最有效的方法。然而就目前研究而言，這種方法單獨用于評估大批量納米材料的毒性實驗是不大可能成功的，需要有效的體內(nèi)研究相互確證[9]。一些研究者還指出[27]，HTS將不會替代傳統(tǒng)毒性檢測方法，但是其對納米材料毒性深入研究的優(yōu)化作用有一定的幫助。Sayes[28]等基于對納米材料的特殊理化參數(shù)（尺寸大小，表面電荷等）與生物特性（如LDH的釋放）的測量，開發(fā)出一種數(shù)學(xué)模型以反應(yīng)工程化納米材料的特性是如何影響細(xì)胞的反應(yīng)。該研究表明，計算模型的建立對暴露于納米材料所引起的生物效應(yīng)的評估能夠很好地運用于預(yù)測納米材料毒性檢測。Sadik等人[29]研究出了一種便攜、可溶解氧的電化學(xué)傳感器陣列，該方法能夠檢測出工程納米材料（量子點和富勒烯），且具有快速提供納米毒性信息的能力。

4 討論

盡管目前對一些納米材料的生物效應(yīng)已經(jīng)有了一些評定，但是各種類型納米顆粒的潛在毒性和可能的機制影響還不是十分清楚。納米材料因其特殊的尺寸、形狀、組分和表面修飾的不同，生物多樣性也明顯超過常規(guī)化學(xué)物品?？紤]到納米材料的高產(chǎn)量和對潛在危害物篩選的急迫性，當(dāng)前，科學(xué)界的首要任務(wù)就是在今后一兩年內(nèi)，達(dá)成納米科技對人體及環(huán)境影響的國際公約，并建立科學(xué)、完善的檢測方法。但現(xiàn)在關(guān)于納米材料的毒理學(xué)研究較少，無論是體內(nèi)代謝，細(xì)胞作用還是生化反應(yīng)，都沒有系統(tǒng)的理論。因此，初步建立評價納米材料毒性與其特殊理化性質(zhì)和體內(nèi)物質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系模型，是為全面、準(zhǔn)確地評價納米材料的毒性提供科學(xué)依據(jù)，為如何減弱或消除其毒性提供參考。流式細(xì)胞術(shù)是一種高通量、多參數(shù)細(xì)胞分子生物學(xué)檢測技術(shù)，在毒理學(xué)研究領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用。已有研究表明，將高通量篩選技術(shù)與基于細(xì)胞毒性機制的實驗方法相結(jié)合，與相關(guān)的納米材料毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，可有效地建立多樣化的理化參數(shù)與細(xì)胞毒性的關(guān)系模型[9]。近年來，一些研究者們也開始轉(zhuǎn)變傳統(tǒng)的研究思路，逐漸從生物系統(tǒng)的整體性分析入手，探索藥物生物毒性的診斷理論和方法學(xué)的新途徑。代謝組學(xué)作為一種全新的組學(xué)技術(shù)，始于上個世紀(jì)90年代中期，它利用高靈敏度、高分離效率的儀器，考察了生物體受遺傳和外界環(huán)境刺激或干擾后其所有代謝產(chǎn)物的質(zhì)和量的動態(tài)變化，來揭示藥物對生物體的毒性實質(zhì)和機制。Zomer等人也開始從代謝組學(xué)角度對多種常見的毒性物質(zhì)（如：鎘、D-半乳糖胺、四氯化碳、對乙酰氨基酚等）進(jìn)行了系統(tǒng)的毒性效應(yīng)評價[30]。Hadrup等人也運用代謝組學(xué)的方法來挖掘納米銀對小鼠造成的毒性作用的靶向器官、靶向位點以及作用的生物標(biāo)志物和作用機制[31]。

體內(nèi)、體外毒性研究面臨的最大問題還是評價方法的不確定性和隨意性，目前沒有能直接反應(yīng)納米材料毒性的客觀指標(biāo)存在。從生物學(xué)體內(nèi)的角度來看，最容易做，最容易把握的哺乳動物就是小鼠，但是真的上升到模式動物時，在納米毒性靶向不確定的情況下，這種假想是不存在的。例如，果蠅是模式動物，但在遺傳方面運用較多，胚胎干細(xì)胞是理想的篩選胚胎毒性的方法，但也只局限在胚胎毒性，在毒性方面只有經(jīng)過大批量的篩選才能確定納米毒性的整體水平，單單做了幾種細(xì)胞，是不能說明納米毒性有多小，什么劑量下才能很好的控制納米毒性。雖然動物試驗?zāi)艹掷m(xù)提供有關(guān)納米毒性的最新信息，但卻有一定的局限性，還需考慮經(jīng)濟(jì)與倫理方面的問題。目前，已有相關(guān)技術(shù)手段用于模擬與預(yù)測納米顆粒在活體內(nèi)的表現(xiàn)，因此希望在將來能夠開發(fā)可以替代活體試驗的檢測手段。

對于這些挑戰(zhàn)，安生·曼雷德教授也表示，納米技術(shù)充滿了原始的創(chuàng)新性，是具有戰(zhàn)略性、前瞻性的新興科技，它同時也是一把“雙刃劍”。雖然工程化納米材料可能會產(chǎn)生一些毒性效應(yīng)，但就目前的研究結(jié)果和數(shù)據(jù)并不能充分的指出這些毒性效應(yīng)將會成為主導(dǎo)生命健康的大問題。納米材料具有潛在的臨床價值，我們應(yīng)該積極客觀的看待納米材料帶給我們的影響。例如，一些納米材料能夠靶向作用于線粒體并且啟動程序性的細(xì)胞死亡，這一特性能夠成為一種新型的癌癥化療方法。不過要想納米材料很好的應(yīng)用于我們的生活，造福于人類，納米材料的安全性評估是刻不容緩的。

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