從炎性細胞因子與Dickkopf—1變化研究補腎活血方對絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎的干預(yù)作用

李明曦 張繼勝 侯秀娟 朱躍蘭

摘要 目的：研究自擬中藥補腎活血方對絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis，KOA）患者血清白細胞介素1（Interleukin 1，IL-1）、腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor α，TNF-α）、雌二醇（Estradiol，E2）、Dickkopf-1（Dkk-1）水平的影響。方法：將60例符合標準的KOA患者隨機分為治療組與對照組，每組均30人。治療組予自擬補腎活血方，1劑/d，分早晚2次服；對照組予雙醋瑞因50 mg/d；療程均為4周，測定患者治療前后血清IL-1、TNF-α、E2、Dkk-1含量。結(jié)果：治療組控顯率與總有效率分別為60%、96.67%；對照組控顯率與總有效率分別為53.33%、93.33%。實驗室指標檢測顯示，2組治療后血清IL-1、TNF-α水平均較治療前降低（P<0.01）；2組治療后的組間比較顯示，IL-1含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），TNF-α含量差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。血清E2水平檢測結(jié)果顯示，治療組治療后較治療前增加（P<0.01），對照組治療后較治療前有所增加，但差異無統(tǒng)計學（P>0.05），治療組與對照組治療后的組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。血清Dkk-1水平方面，2組治療前后比較及2組治療后組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：絕經(jīng)后KOA的主要病機為腎虛血瘀，補腎活血中藥可改善絕經(jīng)后KOA的癥狀；補腎活血方可能通過調(diào)節(jié)雌激素水平以及炎性細胞因子起到干預(yù)絕經(jīng)后KOA的作用；補腎活血方對于Wnt信號通路中Dkk-1無明顯作用，可能Wnt信號通路不參與補腎活血方的干預(yù)途徑。

關(guān)鍵詞 補腎活血；雌二醇；Dickkopf-1；絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎；炎性細胞因子

Abstract Objective：To study the curative effect of Bushen Huoxue Decoction， nourishing kidney and removing blood stasis， on serum interleukin 1， tumor necrosis factor α， Estradiol and Dickkopf-1 level in patients with postmenopausal knee osteoarthritis. Methods：A total number of 60 patients with knee osteoarthritis meeting the diagnosis criteria were randomly divided into treatment group and control group with 30 patients in each group. Patients in the treatment group were given with Bushen Huoxue Decoction a dose and twice daily， while patients in the control group were taken Diacerein Capsule for 50 mg/d. The observation period was 4 weeks. The contents of IL-1， TNF-α， E2， Dkk-1 of all patients were detected before and after treatment. Results：In treatment group， the controlled effective rate was 60% and the total effective rate was 96.67%. While in the control group， the controlled effective rate was 53.33% and the total effective rate was 93.33%. Comparison in serum IL-1 and TNF-α of both the two groups before and after treatment within their groups showed that there was remarkably significant difference （P<0.01）. Comparison of the two groups after treatment between the group showed no significant difference for IL-1 （P>0.05） and significant difference for TNF-αcontent （P<0.05）. Serum E2 of the treatment group before and after treatment showed obviously significant difference （P<0.01）， while that of the control group before and after treatment indicated no significant difference （P>0.05）. Comparison after treatment between the group showed there was remarkably significant difference （P<0.01）. Serum Dkk-1， there were no significant differences within the two groups before and after treatment， and the same result between groups after treatment. Conclusion：The main pathogenesis of postmenopausal KOA may be due to kidney deficiency and blood stasis and Bushen Huoxue Decoction may well improve symptoms of postmenopausal knee osteoarthritis and intervene postmenopausal KOA by regulating the levels of estrogen and inflammatory cytokines. Bushen Huoxue Decoction has no obvious effect for Dkk-1 of Wnt signal pathway， and Wnt signal pathway may not participate in Bushen Huoxue Decoction intervention way.

Key Words Nourishing kidney and removing blood stasis； E2； Dkk-1； Postmenopausal knee osteoarthritis； Inflammatory cytokines

中圖分類號：R285.6文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.025

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是以關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、活動受限、有骨摩擦音、局部炎性反應(yīng)為臨床表現(xiàn)，以不規(guī)則的軟骨損害、軟骨下骨硬化、骨贅增生、軟骨下囊腫、滑膜炎、關(guān)節(jié)囊攣縮、肌肉萎縮、韌帶松弛等為病理表現(xiàn)的一種退行性疾病，嚴重威脅人類健康和生活質(zhì)量。其中KOA中老年以后最常見，KOA是引起中老年人活動不利、下肢疼痛不適的主要原因，該病雖不像腫瘤一樣威脅著人類的生命，但因其患病率高，關(guān)節(jié)疼痛所導致的功能障礙嚴重影響患者的生活質(zhì)量和社會公共衛(wèi)生。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女的OA發(fā)病率明顯增高，且嚴重程度加深，這也促使廣大學者開展了對絕經(jīng)后OA生理病理的研究。因此，本研究以絕經(jīng)后KOA患者為研究對象，以補腎活血中藥復(fù)方為干預(yù)手段，以Wnt信號通路及其相關(guān)因素DKK-1以及相關(guān)炎性反應(yīng)因子為切入點，研究補腎活血中藥治療絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床療效并初步探討其相關(guān)機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月至2013年12月就診于東方醫(yī)院風濕科門診及病房的絕經(jīng)后女性膝骨性關(guān)節(jié)炎患者為本課題的研究對象。設(shè)計類型為隨機對照臨床試驗，設(shè)計方法采用隨機序列的產(chǎn)生（查詢隨機數(shù)字表）和隨機隱藏（序列編碼密閉不透光的信封）。樣本量估算：本試驗為小樣本量探索性試驗，為以后的大樣本量試驗研究提供數(shù)據(jù)與支持，故設(shè)治療組與對照組為1∶1，每組各30例，由于本試驗脫失率預(yù)設(shè)為10%，故共需納入66例。

共納入北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院風濕科2013年1月至12月住院患者66例，按照隨機序列的產(chǎn)生與隨機隱藏方法分為治療組與對照組，在受試過程中出現(xiàn)6例脫落病例，最終確定為60例有效病例，每組各30人，年齡49～70歲。脫落原因為藥物對癥狀改善不明顯停止用藥2例、病房患者治療中途出院4例。

2組在年齡、病程間的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。見表1。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 符合1986年美國風濕病學會推薦的膝骨關(guān)節(jié)炎診斷標準，且為絕經(jīng)后女性。

1.2.2 中醫(yī)辨證標準 參照《中藥新藥臨床運用指導原則》2002版中關(guān)于中藥新藥治療骨關(guān)節(jié)炎的臨床研究指導原則中中醫(yī)癥候診斷標準，辨證屬肝腎虧虛，瘀血阻絡(luò)證。

1.3 納入標準 1）凡符合西醫(yī)膝骨關(guān)節(jié)炎診斷標準；2）符合中醫(yī)證候診斷標準證屬肝腎虧虛，瘀血阻絡(luò)型；3）年齡50～75歲絕經(jīng)1年以上女性；4）接受非甾體抗炎藥（NSAIDS）的患者進入試驗前藥物劑量需穩(wěn)定至少30 d，并且在以后的治療中藥物劑量維持不變。接受其他病情改善藥物治療的患者須中斷用藥30 d以上；5）知情同意，愿意配合觀察者。

1.4 排除標準 1）合并有類風濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、風濕性關(guān)節(jié)炎、大骨節(jié)病及痛風等其他風濕性疾??；2）關(guān)節(jié)不穩(wěn)、嚴重變形、半月板損傷、嚴重腫脹積水、韌帶撕裂等需要外科手術(shù)的嚴重患者；3）妊娠或哺乳期婦女；4）對治療藥物過敏者；5）合并有心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)疾病或精神疾病的患者；6）患者未按規(guī)定用藥，無法判定療效或資料不全無法判定療效者；7）為非生理性停經(jīng)婦女。主要包括嚴重貧血、營養(yǎng)不良、具體的內(nèi)分泌疾病、嚴重的肺結(jié)核、下生殖道閉鎖、生殖器發(fā)育不良等所引起的停經(jīng)。

1.5 脫落標準 1）受試者依從性差，或合并使用本臨床方案禁止使用的藥物，或加用其他藥物或中途自行換藥的；2）觀察中失訪、自然脫落者，包括治療有效，但不能完成整個臨床觀察療程以致臨床資料不全等影響治療療效和安全性判定的；3）發(fā)生嚴重不良事件與并發(fā)癥，不能繼續(xù)接受臨床研究的。

1.6 治療方法 治療組：口服自擬補腎活血方，由補骨脂10 g、桑寄生15 g、川牛膝12 g、白芍12 g、骨碎補9 g、雞血藤15 g、川芎15 g、穿山龍15 g等藥物組成，所用中藥飲片來自于北京同仁堂，采用韓國制造煎煮機煎熬。1劑/d，早晚各1次，療程為4周。

對照組：予雙醋瑞因膠囊口服，商品名稱為安必丁，為膠囊劑型，由昆明積大制藥股份有限公司提供，分裝批準文號：國藥準字J20100150。50 mg/粒，1次/d，療程為4周。

1.7 IL-1、TNF-α的測定 取備檢血清10 μL進行測定，采用雙抗體一步夾心法。使用全波長熒光酶標儀在450 nm的波長下進行吸光度（OD值）的測定，并制作標準曲線計算樣本濃度。由北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號201406，產(chǎn)品編號分別為DZE10081、DZE10110。

1.8 E2、DKK-1的測定 取備檢血清10 μL進行測定，分別采用采用放免法、酶聯(lián)免疫法。使用全波長熒光酶標儀，在450 nm的波長下進行吸光度（OD值）的測定，并制作標準曲線計算樣本濃度。由北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號201405，產(chǎn)品編號分別為DZE10719、DZE10233。

1.9 血清提取 使用國產(chǎn)冷凍高速離心機，型號：珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司，產(chǎn)品型號：TGL-16R，生產(chǎn)許可證號：粵食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20010350號，產(chǎn)品標準：YZB/粵珠0005-2006，編號：AQB018A。

1.10 觀察指標 安全性指標：1）一般指標（血壓、心率、呼吸、脈搏）；2）血尿便常規(guī)；3）肝腎功能；4）心電圖；實驗室指標：IL-、TNF-α、E2、Dickkopf-1。

1.11 療效判定標準 中醫(yī)癥狀療效評定方法：采用尼莫地平法，即療效指數(shù)=（治療前評分-治療后評分）/治療前評分×100%。

1.12 統(tǒng)計學方法 本臨床研究的計數(shù)資料采用χ2檢驗。計量資料，當數(shù)值正態(tài)時，組內(nèi)治療前后采用配對t檢驗，組間治療前后采用獨立樣本t檢驗；數(shù)值非正態(tài)時，組內(nèi)治療前后比較采用2個相關(guān)樣本的非參數(shù)比較，組間治療前后比較采用2個獨立樣本的非參數(shù)比較。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均采用SPSS 13.0，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床總療效評價 經(jīng)χ2檢驗后顯示，2組患者控顯率比較差異無統(tǒng)計學意義（P=1.00>0.05），提示2組控顯率相當；經(jīng)秩和檢驗分析，Z=-0.712，P=0.471>0.05，提示2組患者的總有效率差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

2.2 IL-1測定值比較 治療組與對照組血清IL-1治療前后比較顯示，治療組治療后較治療前降低（P<0.05）；對照組治療后較治療前降低（P<0.05）；治療組與對照組治療前IL-1值比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.959>0.05，t=0.051）；治療組與對照組治療后IL-1值比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.346>0.05，t=0.950）。見表3。

2.3 TNF-α測定值比較 治療組與對照組血清TNF-α治療前后比較顯示，治療組治療后較治療前降低（P<0.05）；對照組治療后較治療前降低（P<0.05）；治療組與對照組治療前TNF-α值比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.817>0.05，t=-0.232）；治療組與對照組治療后TNF-α值比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000<0.05，t=-22.243）。見表4。

2.4 E2測定值的比較 治療組與對照組血清E2治療前后比較顯示，治療組治療后較治療前升高（P<0.05）；對照組治療后較治療前差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；治療組與對照組治療前E2值比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.239>0.05，t=1.189）；治療組與對照組治療后E2值比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000<0.05，t=27.253）。見表5。

2.5 Dickkopf-1測定值比較 治療組與對照組血清Dkk-1治療前后比較顯示，治療組治療后較治療前差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；對照組治療后較治療前差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；治療組與對照組治療前Dkk-1值比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.658>0.05，t=0.445）；治療組與對照組治療后Dkk-1值比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.784>0.05，Z=-0.274）。見表6。

3 討論

Wnt/β-catenin信號通路無論在胚胎時期還是在出生后，對軟骨、骨骼的分化及發(fā)育均起著重要的調(diào)節(jié)作用，但該通路在成年后處于低表達狀態(tài)。Wnt/β-catenin信號通路在OA發(fā)病中的作用是近年來研究的熱點，β-catenin是Wnt經(jīng)典通路的核心分子，上游分子信號的傳遞需通過β-catenin才能發(fā)揮效應(yīng)。維持β-catenin在細胞內(nèi)的穩(wěn)定是Wnt/β-catenin信號通路中最重要的事件之一，過度增加或抑制β-catenin都會導致OA的發(fā)生，但其發(fā)生機制各有不同。生理狀態(tài)下，β-catenin可以促進軟骨細胞成熟，抑制凋亡，但過多表達則會加速關(guān)節(jié)軟骨細胞的成熟，刺激蛋白酶的活化，加速軟骨基質(zhì)的降解，最終導致關(guān)節(jié)軟骨破壞。當表達過低時，關(guān)節(jié)軟骨則會凋亡過度，不足以維持和修復(fù)正常的軟骨，這些都說明β-catenin的表達異常與OA的發(fā)生密切相關(guān)。一些細胞外抑制因子對Wnt/β-catenin信號通路起著調(diào)節(jié)作用，其中DKK-1的作用尤為引人關(guān)注，Dkk-1通過抑制Wnt信號來抑制成骨細胞的分化，而促進破骨細胞的分化，進而改善OA的病理表現(xiàn)和臨床癥狀，且Dkk-1基本上只作用于成骨細胞或（和）骨細胞，故調(diào)節(jié)Dkk-1可以只作用于骨骼系統(tǒng)以調(diào)節(jié)Wnt信號，而不影響其他器官。熊健斌[1]對新西蘭白兔進行動物實驗，構(gòu)建KOA模型后分為空白對照組（注射1 mL生理鹽水）、模型組（注射1 mL生理鹽水）、Dkk-1組（等量0.07%純化Dkk-1），結(jié)果顯示Dkk-1組較另2組病情顯著好轉(zhuǎn)，可以說Dkk-1的升高對KOA起到了一定的治療效果。甘坤寧[2]等研究顯示，OA組患者血清DKK-1水平顯著低于正常人組，可說明血清Dkk-1水平越高，對OA的發(fā)展越有抑制作用。也有不同的實驗結(jié)果顯示Dkk-1的高表達會導致OA的發(fā)生。在小鼠的動物實驗中發(fā)現(xiàn)，Dkk-1的高表達會使小鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松，成骨細胞數(shù)量顯著減少，而敲除Dkk-1的一組小鼠則表現(xiàn)為骨量的提高和成骨能力的增強[3-4]。還有國內(nèi)學者進行相關(guān)研究，王超華[5]等觀察KOA患者軟骨組織中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因及蛋白的表達，得出β-catenin在軟骨細胞中的高表達可能是導致關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要因素。許傳勇[6]等觀察β-catenin及其下游基因MMP-7在KOA大鼠滑膜細胞Wnt/β-catenin信號通路中的表達，結(jié)果顯示其β-catenin、MMP-7含量顯著增高，這說明Wnt/β-catenin信號通路在KOA大鼠滑膜細胞中是被激活的，該通路的活化可能是導致軟骨降解、OA形成的機制之一。本次研究顯示，2組治療后比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；治療組與對照組治療后較其治療前均差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），因此還不能說明補腎活血方對Wnt信號通路相關(guān)因素DKK-1具有調(diào)節(jié)作用，這可能與本次研究樣本量較少，觀察時間較短有關(guān)。但從2組治療前后均值來看，均比治療前有所降低，可作為今后研究的參考。

絕經(jīng)后女性患KOA的風險較絕經(jīng)前顯著升高，很多流行病學研究均顯示女性絕經(jīng)與KOA發(fā)病相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)越早，其發(fā)生KOA的可能性越大，所形成的骨贅嚴重程度較絕經(jīng)期晚的女性更大。雌激素的作用受到了廣泛關(guān)注，它可對細胞因子中的一種或者多種因子起到抑制作用，從而保護軟骨組織，細胞因子和雌激素之間的相互作用也可以對破骨細胞產(chǎn)生明顯影響；雌激素可以對組織和血清中的生長因子起到調(diào)節(jié)作用，而絕大部分生長因子對OA是有保護作用的；人和動物的關(guān)節(jié)軟骨細胞上都有E2受體（α、β）的存在，這說明關(guān)節(jié)軟骨是E2的靶組織，E2直接或者間接作用于滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞使其分泌各種因子，這些因子又對這些細胞的代謝和功能起到調(diào)節(jié)作用，這一過程對關(guān)節(jié)軟骨起到了保護作用；雌激素還可以通過擴張肌肉血管來增加血供，從而為肌肉提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)，維持正常肌肉活動，以維持人體各大關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性。王偉[7]調(diào)查西安市城鄉(xiāng)部分地區(qū)年齡40歲以上居民，男性704名，女性746名，調(diào)查顯示女性O(shè)A發(fā)病率為17.2%，男性則為6.8%；女性骨贅出現(xiàn)率為26.5%，男性為11.4%，差異均有統(tǒng)計學意義。此項研究還提示隨著絕經(jīng)年齡的提前，KOA的發(fā)病率越高，骨贅的嚴重程度也越重。徐苓[8]等在北京市城區(qū)抽取60歲以上男性1012名和女性1507名，研究發(fā)現(xiàn)北京市老年婦女有46.6%人群可診斷為膝關(guān)節(jié)放射學OA，臨床OA的患病率為15.4%；老年男性放射學OA和臨床OA患病率分別為27.6%、7.1%，顯著低于老年女性，這提示了雌激素與OA發(fā)病之間可能有密切關(guān)聯(lián)。國外的一項研究顯示[9]，在50歲之前男性患OA的概率是高于女性的，而在50歲之后，女性O(shè)A的患病率則明顯高于男性，提示雌激素與KOA的發(fā)病密切相關(guān)。本項研究顯示，治療組治療后E2水平明顯增高，治療組治療后較其治療前差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01），而對照組治療后較其治療前差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），反映出補腎活血方可以上調(diào)E2水平。補腎活血方中配伍有川牛膝、桑寄生、骨碎補等補益腎氣的藥物，可以補充腎中精氣，從而調(diào)節(jié)E2的含量。

IL-1被認為是導致軟骨功能衰退最具影響力的細胞因子之一[10-11]，可促進軟骨和滑膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）的表達，刺激滑膜細胞產(chǎn)生中性蛋白酶和膠原酶等，進一步導致滑膜炎性病變[12]；也可使膠原纖維類型發(fā)生變異，加速蛋白多糖的消耗。IL-1可以通過介導白細胞介素6（Interleukin，IL-6）使軟骨細胞合成蛋白多糖受到抑制，從而導致蛋白多糖產(chǎn)量下降，還可以促進關(guān)節(jié)軟骨酶的產(chǎn)生和增強多種酶類的活性，進而促使膠原酶對膠原的降解、金屬蛋白酶對基質(zhì)蛋白多糖的消化?；|(zhì)的異常結(jié)構(gòu)又導致軟骨細胞生存環(huán)境的惡化，形成了一個惡性循環(huán)，由此形成了OA軟骨退變這一典型病理變化[13]。TNF-α是一種多功能的炎性反應(yīng)細胞因子，是機體炎性反應(yīng)與免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，TNF-α與IL-1僅有3%的同源性，且作用于不同的受體，但兩者表現(xiàn)出了很多相似的生物學特征。當TNF-α處于較高濃度時，可產(chǎn)生與IL-1相同的作用，且2者作用可相互協(xié)同，協(xié)同作用可能是通過對產(chǎn)生TNF-α與IL-1的細胞相互正反饋調(diào)節(jié)及TNF-α可促進IL-1R蛋白磷酸化實現(xiàn)的[14]。由此可知，2者共同構(gòu)成炎性反應(yīng)遞質(zhì)，形成強烈的協(xié)同效應(yīng)[15]。TNF-α還可以促進軟骨細胞和成纖維細胞合成多種膠原酶，加強了對軟骨基質(zhì)的降解作用[16]。本項研究結(jié)果表明，由于補腎活血方中配伍了具有抗炎、抑制炎性反應(yīng)細胞過度分泌及調(diào)節(jié)機體免疫功能等藥理作用的中藥，故該方藥不僅可以強筋健骨，補益肝腎，還能很好的降低IL-1及TNF-α水平。

綜上所述，腎虛血瘀是絕經(jīng)后KOA發(fā)病的基本病機，自擬補腎活血方可緩解患者臨床癥狀，同樣可以降低血清中致炎因子IL-1、TNF-α水平，并且提高血清E2的含量，可以說明該處方是治療絕經(jīng)后KOA的有效臨床制劑。在對Dkk-1的調(diào)節(jié)作用方面，本次研究結(jié)果未顯示該指標有意義的比較結(jié)果。從國內(nèi)外文獻來看，Dkk-1的水平變化對OA的發(fā)生發(fā)展是有影響的，但補腎活血方對于調(diào)節(jié)Dkk-1的作用機制還需要進一步研究，Wnt信號通路涉及多個信號靶點，補腎活血方是否對其他靶點有干預(yù)作用將在今后的研究中進一步探討。該研究因病例樣本相對較少，可為今后大樣本研究提供參考。

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