紫外線誘變白靈菇K5擔(dān)孢子研究

陳 珣，楊 鎮(zhèn)，肇 瑩，肖 軍，賀黎黎，張春鳳

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧沈陽 110161； 2.鳳城市大業(yè)食用菌有限責(zé)任公司，遼寧 鳳城118100）

紫外線誘變白靈菇K5擔(dān)孢子研究

陳 珣1，楊 鎮(zhèn)1，肇 瑩1，肖 軍1，賀黎黎2，張春鳳2

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧沈陽 110161； 2.鳳城市大業(yè)食用菌有限責(zé)任公司，遼寧 鳳城118100）

采用紫外照射法對白靈菇K5的擔(dān)孢子進行誘變處理。結(jié)果表明：在紫外燈功率為15 W，照射距離為20 cm，誘變時間為7 min條件下，白靈菇K5致死率可達到74.29%。同時，通過初篩獲得白靈菇K5生長狀況良好的單孢菌株5株，確定其為下一步白靈菇誘變育種工作菌株。

白靈菇；擔(dān)孢子；紫外線誘變；致死率；初篩

白靈菇（Pleurotus nebrodensis）又名白阿魏蘑、阿魏蘑菇，學(xué)名白靈側(cè)耳，由于其形似靈芝而得名。白靈菇分類上屬于擔(dān)子菌門、側(cè)耳科、側(cè)耳屬［1］。白靈菇的子實體營養(yǎng)非常豐富，菌肉肥美，香味濃郁，口感嫩滑，食藥用價值較高，很受消費者歡迎，被譽為“草原上的牛肝菌”［2］。

目前，我國食用菌育種工作中，白靈菇育種工作相比其它食用菌較晚一些。傳統(tǒng)的食用菌育種方法主要包括人工馴化育種、孢子分離育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合育種、雜交育種。誘變育種主要是利用物理或化學(xué)的方法來處理細胞群體，促使其少數(shù)細胞的遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起其遺傳變異發(fā)生，從而選出少數(shù)具有優(yōu)良性狀的菌株。誘變育種所運用的理化因子稱為誘變劑。由于誘變育種能有效地提高突變的頻率，因此在食用菌新品種選育上應(yīng)用甚廣，而其中一種重要的誘變劑就是紫外線。紫外線輻射屬于非電離輻射誘變劑，使用簡便，但效果十分顯著，是誘變產(chǎn)生突變種的重要途徑。本實驗通過對白靈菇品種K5擔(dān)孢子紫外線耐受性研究和誘變單孢菌株的初篩，旨在為白靈菇紫外線誘變育種的進一步工作打下基礎(chǔ)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試品種

白靈菇品種K5為本課題組自主選育品種，其特點：低溫、短柄。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水 1 000 ml。

1.1.3 儀器設(shè)備

超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，電子顯微鏡。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子采集

種菇選定后消毒，剪去種菇菌柄的2／3，75%的酒精表面消毒，無菌水沖洗數(shù)次，最后用無菌紗布吸干菇體表面水分。將消過毒的種菇插入孢子采集支架上，支架下放有濾紙，外面用燒杯套住。

1.2.2 紫外線誘變與致死率計算

在無菌條件下，用接種針挑取一定量的孢子，注入10 ml無菌水中搖勻，再從中取出1 ml孢子液，加入9 ml無菌水中。如此反復(fù)稀釋，一直到稀釋液中大概有106個／m l。取少量孢子懸浮液，約0.1 ml，置于9 cm培養(yǎng)皿中，用玻璃棒在瓊脂平板上均勻涂布。置距離紫外燈20 cm處進行紫外照射，分別照射1～15 min，每個處理重復(fù)3次。以同樣的操作，將未經(jīng)紫外線處理的孢子稀釋液涂平板作為對照。從紫外線照射處理開始，直到涂布完平板的每個操作步驟都需在紅燈下進行。

將涂勻的平板，用黑布包好，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，將培養(yǎng)好的平板取出進行菌落計數(shù)，根據(jù)對照平板和處理平板上的菌落數(shù)，計算致死率［3］。

致死率（%）＝100-（處理后每0.1 ml菌落數(shù)／對照每0.1 ml菌落數(shù)）×100

1.2.3 誘變單孢菌株初篩

選取致死率在70%～80%之間的照射平板，用黑布包好，在25℃條件下黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每天取出鏡檢。當(dāng)清楚看出單個孢子及萌發(fā)出的芽管時，將確定只有一個孢子萌發(fā)的瓊脂塊直接移到固體斜面培養(yǎng)基上，置于適溫條件下培養(yǎng)。以菌落形態(tài)大小為指標(biāo)進行初篩，挑取生長快、菌絲強壯、邊緣整齊、鏡檢菌體較一致的單孢菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變、致死率分析

由表1可見，處理時間在2 min內(nèi)，致死率比較低，說明短時間內(nèi)的紫外線處理，對該孢子的生長影響并不大；以后隨著時間的增加，致死率穩(wěn)步上升，當(dāng)處理時間增至7 min時，致死率有了明顯的增加，致死率達到74.29%；當(dāng)處理時間為14 min時，致死率已達到100%，故初步斷定該孢子對紫外線的最長耐受時間為14 min。

紫外線誘變現(xiàn)在傾向于采用致死率70%～80%，認為該條件下的人工誘變可以提高突變頻率，能夠創(chuàng)造自然界原來沒有的性狀。本實驗紫外線誘變處理7 min時，致死率達74.29%，因此，本實驗選擇紫外線誘變7 min作為致死時間。

2.2 誘變單孢菌株初篩

選取紫外誘變時間為7 min的白靈菇K5擔(dān)孢子的照射平板，顯微鏡下挑取單孢50株，固體斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)。以菌落形態(tài)大小為指標(biāo)進行誘變菌株初篩，篩選獲得5個生長快、菌絲濃密、邊緣整齊、鏡檢菌體較一致的單孢菌落，分別命名為：K5-1號、K5-2號、K5-3號、K5-4號、K5-5號。

從圖1可見，相同培養(yǎng)條件下，篩選菌株與淘汰菌株相比，生長速度快、菌絲濃密、表現(xiàn)出了較強的生長活力。

表1 白靈菇K 5不同處理時間的菌落數(shù)與致死率Table 1 The colony count and fatality rate of K 5 at different p rocessing time

圖1 白靈菇K 5誘變單孢菌株優(yōu)劣對比Figure 1 Com parison of the advantages and disadvantages of among the K5 mutagenesis strains

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)代育種理論認為，被誘變的微生物致死率在70%～80%時，產(chǎn)量性狀的正突變率較高［4］。本試驗對白靈菇品種K5擔(dān)孢子進行紫外線誘變，當(dāng)處理時間為 3 min時，致死率就已達到41.90%，說明白靈菇孢子對紫外線較為敏感。處理時間為7 min時，致死率已達到74.29%。因此，選取7 min誘變的白靈菇擔(dān)孢子進行初篩，獲得5株生長速度快，菌絲強壯的單孢菌株，暫定其為今后白靈菇紫外線誘變育種研究的出發(fā)菌株。

日常生產(chǎn)過程中，食用菌作為一種大型真菌，會以一定的頻率發(fā)生自發(fā)突變。但自發(fā)突變的幾率很低，一般只在10-6～10-9間，變異程度也較輕微，所以育種成功率相對較低。而誘變育種則可以大大提高育種的成功率，誘變育種是指利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻而分散的細胞群，促進其突變率顯著提高，使人們可以簡便、快速地篩選出各種類型的突變菌株，作為生產(chǎn)和研究之用。紫外線來源方便，實際效果優(yōu)良，故本試驗將其作為誘變方法。

我國食用菌育種中，白靈菇育種相對較晚，品種種類不夠豐富，有的品種在生產(chǎn)上有一定的難度，所以要加快選育生產(chǎn)性狀好、適宜商品化栽培的優(yōu)良白靈菇新品種的步伐，才能更好的適應(yīng)現(xiàn)代社會的需求。本試驗選用的白靈菇K5品種為遼寧省主栽品種，具有低溫、短柄的特點，為打破該品種子實體低溫生長的制約，使白靈菇品種農(nóng)藝性狀得到改良，本試驗采用紫外線這一誘變劑完成了對白靈菇K5誘變單孢菌株的初篩，為進一步的誘變育種工作奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 王振和，王斌，武忠偉，等.31個白靈菇菌株的培養(yǎng)特性及親緣關(guān)系初探［J］.食用菌，2007（3）：20～22.

［2］ 陳忠純，林汝楷.側(cè)耳屬種間有性雜交研究［J］.食用菌學(xué)報，1998，5（2）：8～12.

［3］ 劉曲濱，肖方正，陳子健，等.鉻酵母中鉻含量的測定［J］.飼料工業(yè)，2000，21（6）：34～35.

［4］ 周德慶.微生物學(xué)教程［M］.高等教育出版社，1993：249.

The Study of Basidiospore of Pleurotus nebrodesis K5 with UV Mutagenesis

CHEN Xun1，YANG Zhen1，ZHAO Ying1，XIAO Jun1，HE Li-li2，ZHANG Chun-feng2（1．Institute of Edible Fungi Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang，Liaoning 110161； 2．Fengcheng Daye Edible Fungus Limited Liability Company，F(xiàn)engcheng，Liaoning 118100）

s：The basidiospores of K5 wasmutagenized by ultraviolet radiology.The results showed that：The fatality rate of K5 was74.29%when irradiated for 7min with 15W ultraviolet lamp 20 cm away from it.At the same time，five strains of single spore strain of K5 were obtained.And these strainswere determined as the original strains used for ultravioletmutagenesis breeding during next step.

Pleurotus nebrodensis；Basidiospore；UV mutagenesis；Fatality rate；Primary screen

Q813.5

B

1002-1728（2017）06-0082-03

10.3969／j.issn.1002-1728.2017.06.020

2017-12-15

陳珣（1979-），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌遺傳育種和栽培研究。E-mail：chenxun＿82＿ren＠126.com通訊作者：肖軍（1974-），女，碩士，研究員，主要從事食用菌遺傳育種和栽培研究。E-mail：xiaojun20002＠163com