干旱脅迫棉花轉錄組DNA損傷修復相關基因的分析

(新疆大學生命科學與技術學院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2017.11.005

干旱脅迫棉花轉錄組DNA損傷修復相關基因的分析

包秋娟，張麗麗，海那爾·烏拉孜巴依，張富春

(新疆大學生命科學與技術學院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

目的研究干旱脅迫下，棉花 DNA 損傷修復基因的表達情況，從整體水平探討棉花DNA損傷修復相關基因表達與抗旱的相關性。方法用2.5%PEG6000處理棉花幼苗，利用RNA-Seq技術對干旱脅迫下棉花幼苗的轉錄組進行測序。結果從棉花干旱脅迫響應的轉錄組中，篩選獲得差異表達的 DNA損傷修復相關基因共51個，其中差異表達的上調基因23個，差異表達的下調基因28個，干旱脅迫能夠影響棉花DNA損傷修復相關基因的表達。選取4個差異基因進行生物信息學分析及qRT-PCR驗證，HMGB1、recA1、UDGs和GMP synthase基因的表達變幅有一定的差異，但基因的表達趨勢一致，棉花轉錄組測序結果通過qRT-PCR驗證是可靠的。結論DNA損傷修復相關基因可能與干旱脅迫有一定的相關性，干旱脅迫能夠影響棉花DNA損傷修復相關基因的表達。

棉花；干旱脅迫；轉錄組測序；DNA損傷修復相關基因；差異表達

0 引 言

【研究意義】植物在正常生存條件下基因組DNA分子結構非常穩(wěn)定，但在各種生物及非生物逆境脅迫下DNA 極易遭到損傷[1]。由于植物固著土壤的生存方式使植物不能像動物一樣避逆，長期不斷地暴露在各種非生物和生物脅迫之下，導致DNA受到損傷，包括DNA堿基氧化和烷基化，形成嘧啶二聚體，DNA交聯(lián)，DNA單鏈斷裂(SSB)和DNA雙鏈斷裂(DSB),使得植物維護基因組DNA完整性存在嚴峻挑戰(zhàn)，為了確?；蚪M結構完整和化學性質穩(wěn)定，植物已經進化出了一系列DNA損傷修復機制[2-6]。DNA損傷修復途徑主要有直接修復途徑、堿基切除修復途徑(BER)、核苷酸切除修復途徑(NER)、堿基錯配修復途徑(MMR)、同源重組修復途徑(HR)和非同源的末端連接途徑(NHEJ)[7-9]。其中BER是修復由于氧化、烷基化、脫氨和脫嘌呤/脫嘧啶引起的堿基損傷的主要修復途徑，主要針對堿基改變較輕微的DNA損傷[10-12]。DSBs是細胞最嚴重的一種損傷類型，能直接導致細胞凋亡,甚至使細胞死亡[13-14]。修復DNA雙鏈斷裂損傷主要有兩種方式: 同源重組修復(HR)，主要是低等真核生物修復方式，另一種是非同源末端連接修復(NHEJ)主要是脊椎動物及高等植物修復方式[15-17]。轉錄組測序技術(RNA-Seq)可檢測某一特定時間或處理的生物體中所有轉錄本，利用RNA-Seq技術可在整體水平研究干旱脅迫下DNA損傷修復基因的表達情況?！厩叭搜芯窟M展】陳歡[18]利用微陣列轉錄組數(shù)據(jù)分析表明耐輻射球菌DNA修復是呈階段性的，并且氧化脅迫可使DNA修復基因上調表達。Mishra等[19]利用轉錄組學分析黑腹果蠅鉻誘導的DNA鏈斷裂及修復，證實了NHEJ途徑參與DNA雙鏈斷裂修復?！颈狙芯壳腥朦c】目前研究 DNA 損傷修復機制主要集中于動物和原核生物，植物DNA 損傷修復機制的研究起步較晚。研究棉花DNA損傷修復在抗旱中的作用，對于棉花抗逆性研究具有十分重要的作用。【擬解決的關鍵問題】研究采用RNA-seq 測序技術獲得棉花干旱脅迫響應的轉錄組數(shù)據(jù)，從棉花DNA 損傷應激基因入手研究植物耐旱機制，并使用熒光定量PCR驗證在干旱脅迫條件下基因的表達情況，為研究棉花DNA損傷修復途徑響應干旱脅迫奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取籽粒飽滿、大小一致的棉花新陸早17號種子用70%乙醇處理 1 min 后用滅菌水沖洗7～8次,再用15%過氧化氫浸泡5 h后用滅菌水沖洗5～6次，將洗凈的棉種浸泡至滅菌水中24 h后，將棉花種皮剝去播種到固體MS培養(yǎng)基中，進行無菌培養(yǎng)，一周后將棉花幼苗轉至Hoagland營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，一周更換一次營養(yǎng)液直至植株處于4～5片真葉時選長勢相近的6株棉花，3株作為對照(在培養(yǎng)瓶中加入營養(yǎng)液)，3株用2.5%PEG6000脅迫營養(yǎng)液處理，均處理36 h后迅速置于液氮中，于-80℃冰箱中保存。棉花種子由新疆農業(yè)科學院經濟作物研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 轉錄組數(shù)據(jù)庫中差異表達的DNA損傷修復相關基因

采用DESeq進行差異基因分析，將變化倍數(shù)(Fold Chang)≥2且錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR<0.05)作為篩選標準，檢索棉花干旱轉錄組中參與DNA損傷修復途徑相關的差異基因。

1.2.2 DNA損傷修復相關基因的生物信息學

用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸序列的理化性質； NCBI保守結構域數(shù)據(jù)庫CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsbcgiRID=1K7GNVX3015&mode=all)分析預測氨基酸序列的保守結構域；PSORTⅡ(http://www.genscript.com/tools/psort)預測蛋白質的亞細胞定位；SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽；TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白質的跨膜結構；GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl)預測α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲等在整體結構中所占的比例。

1.2.3 實時熒光定量PCR

用NCBI Primer-blast在線設計引物，以Gh-EF1α作為內參基因(引物見下表)。使用 ABI 7500 Real Time熒光定量PCR 儀，參照QIAGEN的 SYBR Green RT-PCR 試劑盒說明書進行熒光定量檢測。Real-time PCR反應體系為20 μL：SYBR Green 10 μL，上下游引物各0.3 μL，模板c DNA 1.0 μL，RNase-free dd H2O 8.4 μL。熒光定量參數(shù)設置為： 95℃ 2 min；95℃15 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s(實時熒光信號采集)；40個循環(huán)；采用 2-△△Ct相對定量法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 棉花DNA損傷修復途徑響應干旱差異基因

從轉錄組數(shù)據(jù)共篩選獲得差異表達的 DNA損傷修復相關基因51個，其中差異表達的上調基因23個，差異表達的下調基因28個。從DNA損傷修復途徑中挑選4個差異表達基因進行后續(xù)分析。表1

表1 DNA損傷修復相關基因
Table 1 Genes of DNA damage repair

基因IDGeneID描述DescriptionFDR值FDRlog2變化倍數(shù)log2FC調控Regulatedevm.TU.Gh_D01G2231HighmobilitygroupB1(HMGB1)0.0084041.497295upevm.TU.Gh_A01G0250DNArepairproteinrecA1(recA1)0.000112.00427upevm.TU.Gh_D05G1136DNAglycosylasesuperfamilyprotein(UDGs)0.00875-1.6972downevm.TU.Gh_A05G1018GMPsynthase0.044075-1.97657down

2.2 DNA損傷修復相關基因的生物信息學

2.2.1氨基酸一級結構及理化性質預測

高遷移率族蛋白(HMGB1)ORF為519 bp，共編碼172個氨基酸，預測分子量為19 522.37 Da，等電點為5.31，為不穩(wěn)定的蛋白； DNA修復蛋白recA 1(recA1)ORF為2 115 bp，共編碼704個氨基酸，預測分子量為77 553.62 Da，等電點為8.04，為穩(wěn)定蛋白；DNA糖基化酶超家族蛋白(UDGs)ORF為1 140 bp，共編碼379個氨基酸，預測分子量為41 082.74 Da，等電點為9.49，為不穩(wěn)定的蛋白；鳥嘌呤一磷酸合成酶(GMP synthase)ORF為1 116 bp，共編碼371個氨基酸，預測分子量為40 225.78 Da，等電點為9.38，為不穩(wěn)定蛋白。表2

表2 氨基酸理化性質預測
Table 2 Prediction of Physical and Chemical Properties of Amino Acids

基因Gene氨基酸殘基數(shù)(個)Numberofaminoacidresidues分子量(Da)Molecularweight等電點(PI)Isoelectricpoint蛋白質不穩(wěn)定指數(shù)ProteininstabilityindexHMGB117219522.375.3155.61recA170477553.628.0435.91UDGs37941082.749.4943.54GMPsynthase37140225.789.3847.1

2.2.2 保守結構域預測

在線預測分析HMGB1、recA1、UDGs和GMP synthase的保守結構域，結果表明，HMGB1有一個HMG-box超家族，在55～110個氨基酸的位置有DNA結合位點，提示HMGB1作為轉錄因子可能對其他基因具有非常重要的調控作用。recA1有一個Rad51超家族和NAM超家族。UDGs和GMP synthase均有一個Ademine glyco超家族。

2.2.3 亞細胞定位、信號肽和跨膜結構域的預測

對HMGB1、recA1、UDGs和GMP synthase在線預測，結果表明，HMGB1主要定位于細胞核，占總體的82.6%，線粒體和分泌系統(tǒng)的囊泡也有分布，不具有信號肽，不存在跨膜螺旋區(qū)，為非跨膜蛋白。recA1主要定位于細胞核，占總體的65.2%，過氧化物酶體和線粒體中也有分布，不具有信號肽，為非跨膜蛋白。UDGs主要定位于細胞核，占總體的78.3%，細胞質和過氧化物酶體中也有分布，不具有信號肽，為非跨膜蛋白。GMP synthase主要定位于細胞核，占總體的78.3%，細胞質、過氧化物酶體和細胞骨架中也有分布，不具有信號肽，為非跨膜蛋白。

2.2.4 二級結構預測

蛋白質的二級結構主要有 α 螺旋、延伸鏈、 β折疊，無規(guī)則卷曲等。用GOR4在線預測二級結構()，HMGB1二級結構中，α 螺旋占的比例最高為 58.14%，延伸鏈占 38.37%，無規(guī)則卷曲占最少比例為3.49%。recA1二級結構中，無規(guī)則卷曲占的比例最高為 52.56%，延伸鏈占 18.18%，α 螺旋占29.06%。UDGs二級結構中，無規(guī)則卷曲占的比例最高為 53.56%，延伸鏈占 21.64%，α 螺旋占24.8%。GMP synthase二級結構中，無規(guī)則卷曲占的比例最高為 52.56%，延伸鏈占 23.18%，α 螺旋占24.26%。表3

表3 二級結構預測
Table 3 Secondary structure prediction

基因Geneα-螺旋α-helix延伸鏈Extensionchain無規(guī)則卷曲IrregularcurlHMGB1100(58.14%)66(38.37%)6(3.49%)recA1206(29.06%)128(18.18%)370(52.56%)UDGs94(24.8%)82(21.64%)203(53.56%)GMPsynthase90(24.26%)86(23.18%)195(52.56%)

2.2.5 實時熒光定量PCR

采用qRT-PCR方法， 分別檢測對照和處理棉花葉片中HMGB1、recA1、UDGs和GMP synthase mRNA 轉錄水平的變化。結果表明，HMGB1和recA1在干旱脅迫后表達量呈上調，而UDGs和GMP synthase表達量呈下調。qRT-PCR與轉錄組測序結果比較表明，在干旱脅迫下棉花HMGB1、recA1、UDGs和GMP synthase基因的表達變幅有一定的差異，但基因的表達趨勢一致，表明棉花轉錄組測序結果通過qRT-PCR驗證是可靠的。圖1，圖2

注：***表示P<0.001，**表示P<0.01，*表示P<0.05

Note:***indicateP<0.001,**indicateP<0.01,*indicateP<0.05

圖1 差異表達基因的qRT-PCR驗證
Fig.1 qRT-PCR validation of differentially expressed genes

圖2 qRT-PCR驗證RNA-Seq結果
Fig.2 qRT-PCR was used to validate RNA-Seq results

3 討 論

植物在離子脅迫、氧化脅迫和滲透脅迫下都會導致DNA損傷變異[20]，導致細胞和遺傳毒害。目前的研究多集中在某一修復途徑[21-22]，而在整體水平研究DNA 損傷修復機制還鮮見報道。研究利用RNA-seq 測序技術，分析DNA損傷應激通路相關基因響應干旱脅迫的表達情況，從轉錄組數(shù)據(jù)共篩選獲得差異表達的 DNA損傷修復相關基因51個，說明干旱脅迫對棉花DNA有一定的損傷，能夠影響棉花DNA損傷修復相關基因的表達，破壞DNA的修復系統(tǒng)，提示DNA損傷修復相關基因可能與干旱脅迫有一定的相關性。其中被GO和KEGG注釋的差異基因參與堿基切除修復的基因最多(8個)，其次是參與同源重組修復(2個)，參與核苷酸切除修復、非同源的末端連接途徑和錯配修途徑中無差異表達基因，這表明2.5%PEG6000模擬干旱可能導致DNA發(fā)生輕微損傷，部分DNA發(fā)生雙鏈斷裂。能被注釋到GO和KEGG數(shù)據(jù)庫中參與BER、NER、MMR、HR和NHEJ途徑的差異表達基因并不多，只占轉錄組數(shù)據(jù)庫中與DNA損傷修復相關差異基因的10%，其余注釋為DNA修復(DNA repair)、細胞響應DNA損傷(Cellular respense to DNA damage)和DNA損傷檢驗點(DNA damage chockpoint),說明目前對DNA損傷修復途徑相關基因的注釋還不全面。隨機選取4個差異基因進行qRT-PCR驗證，結果表明，干旱誘導HMGB1和recA1基因的表達，抑制UDGs和GMP synthase基因的表達。高遷移率族蛋白(HMGB)因其相對分子量小在電泳中遷移率高而得名[23]，是三類高遷移率組(HMG)染色體蛋白之一，能彎曲DNA并優(yōu)先結合扭曲的DNA，它作為核蛋白復合物裝配中的建筑促進者可以實現(xiàn)重組和啟動轉錄[24]。已有研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有的HMGB都可以修飾、彎曲或改變染色質/DNA的結構，從而調節(jié)基因轉錄[25-27]。Ito[28]等研究表明HMGB1參與小鼠核和線粒體DNA損傷修復，Mukherjee和Lange 等[29-30]說明了HMGB1參與NER、MMR、HNEJ和BER損傷修復途徑，是一個精通DNA修復的全能蛋白。在轉錄組數(shù)據(jù)庫中，對HMGB1的注釋只參與了BER途徑，說明注釋數(shù)據(jù)庫有待于進一步完善。recA1作為DNA重組修復蛋白能在重組修復蛋白recBCD或recFOR的作用下參與DNA的重組修復[31]，它是同源重組的一個重要組成部分[32]。多種DNA 糖基化酶能夠特異性識別、結合DNA的損傷部位，并移除受損傷的堿基，暴露出一個位點，即AP位點[33-34]。AP位點在其內切酶的作用下形成了核苷酸縫隙，之后在DNA 多聚酶 β作用下填補縫隙，最后在連接酶的復合體的作用下密封斷開的DNA，完成BER修復[35]。在轉錄組中，只篩選到一個差異表達的DNA 糖基化酶基因，且為下調，提示在干旱脅迫36 h后，堿基切除修復過程已經完成了識別、結合過程。GMP synthase是一種能使細胞生長和DNA復制的重要核苷酸生物合成酶，Hosman等猜測核苷酸生物合成酶和轉錄調控之間的關聯(lián)可能對細胞抵御基因組不穩(wěn)定是重要的[40]。目前對GMP synthase如何參與DNA修復的過程還未見報道，轉錄組數(shù)據(jù)對GMP synthase的注釋為參與堿基切除修復。對HMGB1、recA1、UDGs和GMP synthase的生物信息學分析表明HMGB1、UDGs和GMP synthase主要定位于細胞核，不含跨膜區(qū)域且沒有信號肽，屬于胞內不穩(wěn)定蛋白，recA1主要定位于細胞核，是無信號肽穩(wěn)定的非跨膜蛋白。HMGB1有一個HMG-box超家族，說明HMGB1可能作為轉錄因子發(fā)揮作用，二級結構預測其α螺旋占的比例最高，其次是延伸鏈，最后是無規(guī)則卷曲。recA1有Rad51超家族和NAM超家族，說明recA1參與減數(shù)分裂和DNA重組修復，二級結構預測其無規(guī)則卷曲占的比例最高，其次是延伸鏈，最后是α螺旋。UDGs和GMP synthase均有一個Ademine glyco超家族，推測其參與堿基切除修復，二級結構預測其無規(guī)則卷曲占的比例最高。實驗的結果為干旱脅迫下棉花DNA損傷修復機制的研究提供了響應的數(shù)據(jù)。

DNA損傷修復是生物維護自身基因組穩(wěn)定而做出的反應，DNA損傷修復過程是復雜的并呈現(xiàn)動態(tài)變化。雖然目前對DNA損傷修復的研究越來越成熟，但還是有很多問題沒有得到解釋。

4 結 論

研究采用RNA-seq 測序技術獲得棉花干旱脅迫響應的轉錄組數(shù)據(jù)，分析了干旱脅迫對DNA損傷修復系統(tǒng)的影響，篩選出DNA損傷修復相關差異表達基因共51個，其中差異表達的上調基因23個，差異表達的下調基因28個，選取4個差異基因進行qRT-PCR驗證，證明與轉錄組表達趨勢一致，DNA損傷修復基因受干旱脅迫影響，其中下調基因略多于上調基因表明干旱對DNA損傷修復途徑有一定的破壞。干旱脅迫能夠影響棉花DNA的損傷修復，該研究的結果為干旱脅迫下棉花DNA損傷修復機制的研究提供了基礎。

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AnalysisofDNADamageRepairRelatedGenesinDroughtStressCottonTranscriptome

BAO Qiu-juan, ZHANG Li-li, Hainar Wulazibai, ZHANG Fu-chun

(CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,Urumqi830046,China)

ObjectiveThe study aims to investigate the expression of DNA damage repair related genes in cotton under drought stress, and to explore the correlation between the expression of DNA damage repair related genes and drought resistance at the whole level.Method2.5% PEG 6000 was used to treat cotton, and transcriptome was sequenced using RNA-Seq technology of cotton seedlings under drought stress.ResultA total of 51 genes with differentially expressed DNA damage were filtered from the transcripts of cotton drought stress response, among which there were 23 differentially up-regulated expressed genes and 28 differentially down-regulated expressed genes, which showed that drought stress could affect the expression of DNA repair related genes in cotton. 4 genes were selected by bioinformatics analysis and verification results showed that the expression of qRT-PCR, HMGB1, recA1, UDGs amplitude and GMP synthase gene displayed some differences, but the gene expression trends were consistent, showing that cotton transcriptome sequencing results verified by qRT-PCR were reliable.ConclusionThe DNA damage repair related genes may be related to drought stress, so drought stress could affect the expression of DNA damage related genes.

cotton; drought stress; transcriptome sequencing; DNA damage repair related gene; differential expression

Supported by: Joint Key Fund of National Natural Science Foundation of China and Xinjiang "Exploration of key genes related to high-efficiency water utilization in cotton and creation of drought resistant germplasm"(U1303282)

ZHANG Fu-chun (1962-), male, native place: Urumqi, Xinjiang. Professor,research field: Molecular biology. (E-mail)zfcxju@xju.edu.cn

S562；Q756

A

1001-4330(2017)11-1999-07

2017-09-28

國家自然科學基金-新疆聯(lián)合基金重點項目“棉花水分高效利用的關鍵基因的挖掘及抗旱種質材料的創(chuàng)制”(U1303282)

包秋娟(1993-)，女，新疆麥蓋提人，碩士研究生，研究方向為植物分子生物學，(E-mail)1515643021@qq.com

張富春(1962-)，男，新疆烏魯木齊人，教授，博士，研究方向為分子生物學，(E-mail)zfcxju@xju.edu.cn