先天性少毛癥一例致病基因突變研究

周娜 史傳奎 張開慧 劉毅 蓋中濤

250022濟(jì)南，山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院兒科醫(yī)學(xué)研究所（周娜、張開慧、劉毅、蓋中濤），皮膚科（史傳奎）

·論著·

先天性少毛癥一例致病基因突變研究

周娜 史傳奎 張開慧 劉毅 蓋中濤

250022濟(jì)南，山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院兒科醫(yī)學(xué)研究所（周娜、張開慧、劉毅、蓋中濤），皮膚科（史傳奎）

目的通過新一代測序技術(shù)，在分子水平明確1例先天性少毛癥患兒遺傳學(xué)病因。方法患兒女，9歲3個(gè)月，出生即頭發(fā)少，呈絨毛狀，生長緩慢。皮膚科檢查示頭發(fā)細(xì)軟呈淡黃色、羊毛狀，稀疏，頭頂發(fā)量稍多，四周發(fā)量稀少，發(fā)際線上移，前額增寬。眼科檢查無明顯異常?；純焊改讣懊妹镁鶡o相似異常表型，患兒父母非近親結(jié)婚。抽取患兒及其母親、妹妹外周靜脈血，對基因組DNA進(jìn)行新一代測序分析，并對疑似致病性突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證及生物信息學(xué)分析。結(jié)果患兒CDH3基因存在2個(gè)突變，分別是第5號外顯子c.1057G＞T（p.D353Y）雜合突變和第10號外顯子c.1767delC（p.I589Ifs）雜合突變，均為新突變，軟件預(yù)測具有致病性。Sanger測序驗(yàn)證示c.1057G＞T（p.D353Y）雜合突變來自患兒母親；傳遞分析示c.1767delC（p.I589Ifs）雜合突變來自患兒父親。結(jié)論該先天性少毛癥患兒攜帶的c.1057G＞T（p.D353Y）和c.1767delC（p.I589Ifs）雜合突變可能導(dǎo)致其發(fā)生先天性少毛癥伴青少年黃斑營養(yǎng)不良，應(yīng)嚴(yán)密觀察并按時(shí)進(jìn)行全面眼科檢查，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)并盡早對癥治療眼部癥狀。

稀毛癥；突變；DNA突變分析；CDH3基因

先天性少毛癥是一組罕見的遺傳性毛發(fā)疾病，具有臨床和遺傳上的異質(zhì)性，通常會(huì)在出生時(shí)或嬰幼兒時(shí)期發(fā)病，可為家族聚集性或散發(fā)。近年來，相關(guān)致病基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，包括APCDDl、RPL21、CDSN、U2HR、KRT74、KRT71、LPAR6、HR，CDH3及LIPH等［1］。根據(jù)是否伴發(fā)其他先天性異常，先天性少毛癥又分為僅有毛發(fā)異常的先天性少毛癥和伴發(fā)少毛癥的遺傳性綜合征［2］，先天性少毛癥伴青少年黃斑營養(yǎng)不良（hypotrichosis with juvenile macular dystrophy，HJMD，OMIM：601553）即是后者中的一種。這是一種人類常染色體隱性遺傳病，特點(diǎn)為毛發(fā)稀少，伴隨著嚴(yán)重的漸進(jìn)性視網(wǎng)膜黃斑退行性改變，最終會(huì)導(dǎo)致不同程度的失明［3］。已有研究表明，HJMD由編碼P鈣黏蛋白的CDH3基因突變引起［4］。本研究對2016年3月就診于我院的1例先天性少毛癥患兒的臨床表現(xiàn)及致病基因進(jìn)行研究，并借助新一代測序技術(shù)明確其遺傳學(xué)病因。

資料與方法

一、病歷資料

患兒女，9歲3個(gè)月，出生時(shí)即頭發(fā)少，呈絨毛狀，生長緩慢，現(xiàn)發(fā)量較之前有所增多，仍較稀疏?；純合档?胎第1產(chǎn)，足月自然娩出，無窒息史。體檢：營養(yǎng)中等，發(fā)育良好，骨骼、身高及智力發(fā)育正常。皮膚科檢查：頭發(fā)細(xì)軟呈淡黃色，羊毛狀，稀疏，頭頂發(fā)量稍多，長度4～6 cm，四周發(fā)量稀少，2～3 cm，發(fā)際線上移，前額增寬，見圖1。睫毛及眉毛正常，指、趾甲無明顯異常。眼科檢查無明顯異常，正常視敏度基礎(chǔ)上未見明顯黃斑退行性色素改變。實(shí)驗(yàn)室檢查：血尿糞常規(guī)和肝腎功能、微量元素測定等均無明顯異常。初步診斷：先天性少毛癥?；純河?妹，3歲，毛發(fā)正常?；純焊改阜墙H結(jié)婚，母親主動(dòng)流產(chǎn)1次，患兒父親33歲時(shí)患甲狀腺癌去世。母親懷孕期間無服藥、接觸有害物質(zhì)及病毒感染史。家族中無類似疾病患者及其他先天性和遺傳病史。

二、標(biāo)本采集與DNA提取

通過山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵循知情同意的原則，抽取患兒及其母親、妹妹外周靜脈血各2 ml，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，混勻，使用QIAamp DNA試劑盒提取基因組DNA，并經(jīng)RNA酶處理。使用NanoDrop 8000分光光度儀對DNA純度進(jìn)行質(zhì)控，當(dāng)A260/A280為1.6～1.8時(shí)繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、新一代測序

構(gòu)建基因組文庫（北京信諾佰世醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所），將基因組DNA隨機(jī)打斷成為250～300 bp片段，然后利用T4 DNA聚合酶、T4磷酸化多核苷酸激酶和大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段對純化后的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)；再按照Illumina公司二代測序儀的操作說明在片段兩端加上A堿基，最后在兩端加上接頭（adaptor）；連接產(chǎn)物經(jīng)ligation?mediated PCR（LM?PCR）擴(kuò)增、純化，獲得DNA文庫，對文庫進(jìn)行質(zhì)量檢測。隨后將LM?PCR產(chǎn)物與人類基因芯片在適宜條件下雜交20～24 h，捕獲與少毛癥相關(guān)的基因外顯子及相鄰內(nèi)含子區(qū)域（±50 bp），此時(shí)目標(biāo)片段因與芯片上的探針結(jié)合而被捕獲，未雜交的片段則被洗掉；最后應(yīng)用Illumina Hiseq 2000高通量測序儀（美國Illumina公司，試劑來自美國Kapa Biosystems公司）測序，測序讀長為2×150 bp。

本研究中目標(biāo)基因外顯子捕獲芯片包含APCDD1/CDSN等32個(gè)與少毛癥相關(guān)的候選基因。捕獲探針由美國Agilent公司設(shè)計(jì)，覆蓋上述基因的全部外顯子區(qū)域及相鄰內(nèi)含子區(qū)域，目的基因的測序深度達(dá)10倍占97.59%,20倍占92.97%，30倍以上占86.48%。

四、Sanger測序

從患兒血液樣品中提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增相關(guān)基因外顯子及旁側(cè)內(nèi)含子區(qū)域，然后進(jìn)行Sanger測序，測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)參考序列比對。對患兒母親及妹妹進(jìn)行靶向突變檢測以明確突變來源。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 17.25 μl，10倍緩沖液（含Mg2+）2.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，10 μmol/L 正 向引物 1 μl，10 μmol/L 反向引物 1 μl，DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶1.25 U（0.25 μl），合計(jì)25 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后，72 ℃延伸5 min，冷卻至4℃；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，得到清晰可見、大小符合預(yù)期的條帶后方可進(jìn)行Sanger測序（美國ABI公司3730xl DNA測序儀）。針對p.D353Y突變驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的正向引物序列為5′?TGTAGGGAAAGCAGGCACAG?3′，反向引物序列為5′?GAGGCTCCACTGATGTGCTT ?3′；針對p.I589Ifs突變所設(shè)計(jì)的正向引物序列為5′?GTAG CCGGTAGGTTTCGCCT?3′，反向引物序列為5′?CATGG CCCACAAGATGCTAGG?3′。

五、突變位點(diǎn)致病性預(yù)測

采用SIFT、PolyPhen?2、Mutation Taster生物學(xué)軟件對測序結(jié)果進(jìn)行致病性分析預(yù)測。采用SOMPA軟件預(yù)測突變前后蛋白二級結(jié)構(gòu)變化。通過PDB蛋白數(shù)據(jù)庫，查找P鈣黏蛋白氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)，將突變后序列翻譯成氨基酸序列，應(yīng)用PYMOL軟件對蛋白空間結(jié)構(gòu)建模，分析蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化。

結(jié) 果

一、新一代測序與Sanger測序驗(yàn)證

新一代測序分析發(fā)現(xiàn)，患兒CDH3基因2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，分別是第1 057位鳥嘌呤被胸腺嘧啶所代替（c.1057G＞T）和第1 767位胞嘧啶發(fā)生雜合缺失（c.1767delC）。Sanger測序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，患兒母親存在c.1057G＞T（p.D353Y）雜合突變，患兒妹妹攜帶c.1767delC（p.I589Ifs）雜合突變。c.1767delC（p.I589Ifs）雜合突變屬于移碼突變，測序峰圖見圖2，該突變使590位酪氨酸變成了蘇氨酸，此后的氨基酸序列全部改變，并且終止密碼子提前出現(xiàn)。兩個(gè)突變均為新發(fā)現(xiàn)的突變，未見文獻(xiàn)報(bào)道。

二、突變位點(diǎn)致病性預(yù)測結(jié)果

結(jié)果顯示，2個(gè)突變位點(diǎn)均有致病性。PolyPhen?2預(yù)測顯示，c.1057G ＞ T（p.D353Y）評分為1.00，為可疑致病性突變，見圖3。因該軟件無法對移碼突變進(jìn)行預(yù)測分析，故不能提供c.1767delC（p.I589Ifs）位點(diǎn)的評分圖。進(jìn)一步采用SIFT對c.1057G＞T（p.D353Y）位點(diǎn)預(yù)測，評分為0.00，為致病性突變；另一位點(diǎn)評分為0.20，雖＞0.05，但突變形式為移碼突變，理論上具有很強(qiáng)的致病性。

采用ExPASY系統(tǒng)中的SOMPA軟件預(yù)測突變蛋白二級結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)，兩種突變均使CDH3基因所編碼的各種蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲）發(fā)生不同程度的變化，這些都可能最終影響蛋白功能，見表1。

應(yīng)用PYMOL軟件對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)建模后發(fā)現(xiàn)，與正常的P鈣黏蛋白相比，1057位點(diǎn)突變后的蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，該區(qū)域位于P鈣黏蛋白的第3胞外結(jié)構(gòu)域；1767位點(diǎn)突變后使蛋白肽鏈縮短27%，嚴(yán)重影響P鈣黏蛋白第5胞外結(jié)構(gòu)域，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域都在P鈣黏蛋白與Ca2+的綁定中發(fā)揮重要作用，所以突變可能會(huì)影響蛋白的黏附功能。見圖4、5。

圖2 患兒及其母親、妹妹CDH3基因突變位點(diǎn)Sanger測序驗(yàn)證圖 2A：CDH3基因1057位點(diǎn)測序峰圖，患兒及母親該位點(diǎn)均發(fā)生c.1057G＞T（p.D353Y）雜合突變，其妹妹該位點(diǎn)測序結(jié)果為野生型；2B：CDH3基因1767位點(diǎn)測序峰圖，患兒及妹妹該位點(diǎn)均發(fā)生c.1767delC（p.I589Ifs）雜合突變，其母親該位點(diǎn)測序結(jié)果為野生型

圖3 PolyPhen?2軟件對c.1057G ＞ T（p.D353Y）位點(diǎn)預(yù)測評分圖

表1 SOMPA軟件預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化表（%）

討 論

CDH3基因位于16號染色體22區(qū)1帶1亞帶，長約55 kb，包含16個(gè)外顯子，編碼的蛋白是P鈣黏蛋白［5］。P鈣黏蛋白是經(jīng)典鈣黏蛋白家族成員，參與形成黏著連接的跨膜核心區(qū)域［6］。經(jīng)典的鈣黏蛋白家族主要包含E鈣黏蛋白和P鈣黏蛋白，分別由CDH1和CDH3編碼，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞識別及胚胎期毛囊形成和肢體發(fā)育中都發(fā)揮重要作用［7］。CDH3基因在各種組織器官中廣泛表達(dá)，例如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、頭發(fā)毛囊和胚胎肢芽，故該基因發(fā)生突變會(huì)引起多種癥狀，如黃斑營養(yǎng)不良、少毛癥、缺指畸形等［8］。CDH3基因編碼的P鈣黏蛋白共包括5個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域（EC1?5），一個(gè)跨膜區(qū)以及一個(gè)短的胞內(nèi)區(qū)。Kamran?ul?Hassan Naqvi等［3］指出，P鈣黏蛋白第4胞外結(jié)構(gòu)域（EC4）主要由11號密碼子編碼的一個(gè)DRE氨基酸序列組成，該區(qū)域在P鈣黏蛋白與Ca2+的綁定中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而影響P鈣黏蛋白的空間折疊構(gòu)象，折疊構(gòu)象的變化反過來又會(huì)影響細(xì)胞間的黏附功能［9］。Steinberg和McNutt［10］的研究表明，P鈣黏蛋白的胞內(nèi)區(qū)能夠與多種蛋白相互作用，其中就包括β連環(huán)素，該蛋白在毛發(fā)形成過程中至關(guān)重要。

圖4 CDH3基因所編碼蛋白質(zhì)（P鈣黏蛋白）空間結(jié)構(gòu)圖 4A：CDH3基因野生型所編碼蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，藍(lán)色球狀區(qū)域示第353位天冬氨酸所在位置；4B：紅色結(jié)構(gòu)為第353位天冬氨酸放大示意圖；4C：CDH3基因發(fā)生c.1057G＞T（p.D353Y）突變后，紅色結(jié)構(gòu)示第353位突變成酪氨酸

圖5 另一角度觀察CDH3基因所編碼蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)圖 5A：點(diǎn)狀區(qū)域?yàn)镃DH3基因野生型所編碼590位酪氨酸之后的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)；5B：紅色結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)第590位酪氨酸之后的空間結(jié)構(gòu)放大示意圖；5C：紅色結(jié)構(gòu)表示CDH3基因發(fā)生c.1767delC（p.I589Ifs）突變后，第590位突變成蘇氨酸之后的空間結(jié)構(gòu)放大示意圖

新一代測序技術(shù)（next generation sequencing）又稱大規(guī)模平行測序（MPS）或二代測序，包含多種可以一次性產(chǎn)生大量數(shù)字化基因序列的測序技術(shù)，現(xiàn)已普遍應(yīng)用在遺傳病與腫瘤變異檢測領(lǐng)域。對于遺傳病，主要的技術(shù)方案是靶向區(qū)域測序（targeted panel）、全外顯子測序（whole exome）、全基因組測序（whole genome）和線粒體DNA測序［11］。新一代測序技術(shù)能夠同時(shí)對上百萬甚至數(shù)十億個(gè)DNA分子進(jìn)行測序，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高通量測序的目標(biāo)［12］。主要優(yōu)點(diǎn)有3個(gè)，①能夠在數(shù)百萬個(gè)點(diǎn)上同時(shí)閱讀測序；②有定量功能，能夠反映樣品中DNA豐度；③與Sanger完成的人類基因組計(jì)劃相比，更加高效經(jīng)濟(jì)［13］。

我們采用新一代測序技術(shù)對患兒外周血基因組DNA進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)CDH3基因存在2個(gè)突變，其中c.1057G＞T突變使第353位天冬氨酸被酪氨酸所代替，屬于錯(cuò)義突變，理論上造成蛋白結(jié)構(gòu)改變，通過蛋白二級及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該突變確實(shí)造成肽鏈結(jié)構(gòu)改變，具有致病性。另一位點(diǎn) c.1767delC（p.I589Ifs）突變屬于移碼突變，1 767位堿基缺失的胞嘧啶是編碼第589位氨基酸密碼子最后一位，胞嘧啶缺失雖未直接造成第589位氨基酸改變，但是產(chǎn)生了新的閱讀框架，使第590位酪氨酸變成蘇氨酸，此后的氨基酸全部改變，終止密碼子提前出現(xiàn)，使整個(gè)肽鏈由原來的830個(gè)氨基酸提前終止為606個(gè)氨基酸，長度縮短27%，形成一種非常嚴(yán)重的截短蛋白，嚴(yán)重影響P鈣黏蛋白第5胞外結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域在與Ca2+的綁定中發(fā)揮重要作用［14］。Troyanovsky［15］在文獻(xiàn)中提到，EC4?EC5空間構(gòu)象改變，能夠共同調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附。本研究中的兩個(gè)突變均未在ExAc數(shù)據(jù)庫及千人基因組計(jì)劃中被檢索到，進(jìn)一步提示該突變位點(diǎn)的致病性可能。

通過查詢Pubmed，我們了解到目前CDH3基因突變主要與以下兩種疾病相關(guān)：HJMD及外胚層發(fā)育不良伴缺指/趾和黃斑營養(yǎng)不良（ectodermal dysplasia,ectrodactyly，and macular dystrophy syndrome，EEMS）。HJMD以常染色體隱性方式遺傳，患兒通常在出生后表現(xiàn)為頭發(fā)稀疏、短小，兒童期最為嚴(yán)重，幾年后出現(xiàn)漸進(jìn)性視網(wǎng)膜黃斑變性，最終導(dǎo)致失明［16］。與HJMD相比，EEMS毛發(fā)稀疏累及眉毛和睫毛，牙齒發(fā)育不良，牙距寬，合并缺指/趾、并指/趾和屈曲指/趾畸形［17］。結(jié)合目前患兒的臨床表現(xiàn)，主要是出生時(shí)即頭發(fā)少，呈絨毛狀且生長緩慢，這兩個(gè)位點(diǎn)的突變可能不同程度地打亂了細(xì)胞之間的黏附機(jī)制，進(jìn)而對毛囊的發(fā)育過程造成影響，因此初步懷疑患兒可能為HJMD，但目前患兒并未發(fā)現(xiàn)黃斑變性，是因?yàn)閭€(gè)體差異還是患兒所患為一個(gè)新的病種？這些問題有待進(jìn)一步隨訪觀察。經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)患兒母親存在相同的c.1057G＞T（p.D353Y）雜合突變，患兒妹妹存在相同的c.1767delC（p.I589Ifs）雜合突變，對測序結(jié)果綜合分析，患兒及其妹妹在第1 767位點(diǎn)都發(fā)現(xiàn)同一新的突變，屬于在同一家族中出現(xiàn)，根據(jù)我們所做的大量其他疾病的家系驗(yàn)證所得經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為該突變?yōu)樽园l(fā)突變的概率極低，遺傳自其父親的可能性極大。由于患兒父親已故，現(xiàn)無法考證，后續(xù)我們將進(jìn)行其他親屬的基因驗(yàn)證。

我們采用新一代測序技術(shù)對該患兒少毛癥相關(guān)基因進(jìn)行突變檢測，明確該病遺傳病因，發(fā)現(xiàn)2個(gè)以前未報(bào)道過的突變位點(diǎn)，豐富了該病的基因突變譜，對該疾病的發(fā)病機(jī)制也有了更加深入的了解。目前患兒9歲，只出現(xiàn)頭發(fā)稀少癥狀，后期可能會(huì)出現(xiàn)視力下降，應(yīng)嚴(yán)密觀察并按時(shí)進(jìn)行全面眼科檢查，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)并盡早對癥治療眼部癥狀。

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Mutation analysis of causative genes in a case of congenital hypotrichosis

Zhou Na,Shi Chuankui,Zhang Kaihui,Liu Yi,Gai Zhongtao
Pediatric Research Institute,Qilu Children′s Hospital of Shandong University,Shandong 250022,China（Zhou N,Zhang KH,Liu Y,Gai ZT）;Department of Dermatology,Qilu Children′s Hospital of Shandong University,Shandong 250022,China（Shi CK）

s:Gai Zhongtao,Email:gaizhongtao@sina.com;Shi Chuankui,Email:shichuankui@163.com

ObjectiveTo identify the genetic cause of a case of congenital hypotrichosis by a next?generation sequencing technology.MethodsA 9?year and 3?month?old girl presented with few villous hairs at birth,which grew slowly.Skin examination showed sparse,thin,soft,woolly and light?yellow hairs,small amount of hairs on the top of the head and a less amount of hairs around the head,hairline recession and broadened forehead.No abnormality was found by ophthalmic examination.No similar aberrant phenotype was observed in the patient′s parents or her younger sister.Her parents were non?consanguineous marriage.Peripheral venous blood samples were obtained from the patient,her mother and younger sister.Genomic DNA was extracted and then analyzed by a next?generation sequencing technology.The suspected pathogenic mutations were validated by Sanger sequencing and subjected to bioinformatics analysis.ResultsTwo mutations were identified in the CDH3 gene in the patient,including a c.1057G ＞T（p.D353Y）heterozygous mutation in exon 5 and a c.1767delC（p.I589Ifs）heterozygous mutation in exon 10.They were both novel mutations,and their pathogenicity was predicted by softwares.Sanger sequencing indicated that the c.1057G ＞ T（p.D353Y）heterozygous mutation was inherited from the patient′s mother,and gene transfer analysis revealed that the c.1767delC（p.I589Ifs）heterozygous mutation was inherited from the patient′s father.ConclusionThe c.1057G ＞ T（p.D353Y）and c.1767delC（p.I589Ifs）heterozygous mutations may cause hypotrichosis and juvenile macular dystrophy in the patient,so careful observation and comprehensive ophthalmic examination should be performed on time for early diagnosis and treatment of eye symptoms.

Hypotrichosis;Mutation;DNA mutational analysis;CDH3 gene

蓋中濤，Email：gaizhongtao@sina.com；史傳奎，Email：shichuankui@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.11.010

2017?07?10）

顏艷）