普萘洛爾對(duì)體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制

羅勇奇 曾迎紅 胡夢(mèng)葉 湯建萍

410007長沙，湖南省兒童醫(yī)院皮膚科（羅勇奇、曾迎紅、湯建萍）；湖南省人民醫(yī)院心電圖室（胡夢(mèng)葉）

·論著·

普萘洛爾對(duì)體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制

羅勇奇 曾迎紅 胡夢(mèng)葉 湯建萍

410007長沙，湖南省兒童醫(yī)院皮膚科（羅勇奇、曾迎紅、湯建萍）；湖南省人民醫(yī)院心電圖室（胡夢(mèng)葉）

目的研究普萘洛爾對(duì)體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（HemEC）增殖及凋亡的影響，探討其分子機(jī)制。方法收集7例增生期血管瘤患兒的手術(shù)切除血管瘤組織用于體外培養(yǎng)HemEC，同時(shí)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）作為對(duì)照。采用0、25、50、75、100、125、150 μmol/L普萘洛爾分別處理兩種細(xì)胞24、48、72 h。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。采用含或不含100 μmol/L普萘洛爾的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)HemEC（分別為普萘洛爾干預(yù)組及空白對(duì)照組）18 h，提取兩組細(xì)胞總RNA，采用表達(dá)譜基因芯片技術(shù)檢測(cè)兩組HemEC中差異表達(dá)的基因，并通過實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果25 μmol/L普萘洛爾作用24、48 h可引起HemEC輕微增殖（P＜0.05），而≥100 μmol/L普萘洛爾作用≥24 h可引起HemEC存活率下降，作用≥48 h可引起HUVEC存活率下降。100～150 μmol/L普萘洛爾作用24～72 h，HemEC細(xì)胞存活率比HUVEC低（P＜0.05）。100～150 μmol/L普萘洛爾作用下，HemEC凋亡率隨普萘洛爾作用時(shí)間及濃度逐漸升高（均P＜0.05）。普萘洛爾干預(yù)HemEC后，表達(dá)譜基因芯片技術(shù)篩選出186個(gè)表達(dá)差異倍數(shù)≥1.5的基因，其中表達(dá)明顯上調(diào)的基因128個(gè)，明顯下調(diào)的58個(gè)。實(shí)時(shí)定量PCR顯示，普萘洛爾干預(yù)組前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9 mRNA表達(dá)水平為空白對(duì)照組的（9.88±2.19）倍，脂肪酸結(jié)合蛋白3 mRNA為（21.90±8.18）倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.028、4.427，P＜0.05）。結(jié)論高濃度普萘洛爾對(duì)HemEC及HUVEC的增殖均有抑制作用，且對(duì)HemEC的抑制作用更強(qiáng)。普萘洛爾抑制HemEC的增長可能與抑制HemEC增殖及促進(jìn)其凋亡有關(guān)。

血管瘤；普萘洛爾；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；基因表達(dá)譜；寡核苷酸序列分析

自2008年Léauté?Labrèze等［1］發(fā)現(xiàn)普萘洛爾能有效治療血管瘤后，其已成為血管瘤的一線治療藥物，但治療機(jī)制仍不清楚。我們研究普萘洛爾對(duì)體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（hemangioma endothelial cells，HemEC）增殖及凋亡的影響，同時(shí)采用人表達(dá)譜芯片篩選普萘洛爾干預(yù)體外HemEC前后差異表達(dá)基因，尋找普萘洛爾的作用靶點(diǎn)，探討其治療血管瘤的分子機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

微血管內(nèi)皮細(xì)胞（EGM?2 MV）培養(yǎng)基（瑞士Lonza公司），DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、青鏈霉素（美國Gibco公司）；抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）抗體、熒光二抗（美國Abcam公司），MTT試劑（北京索萊寶科技有限公司），鹽酸普萘洛爾（分析純，美國Sigma公司）；CD31免疫磁珠、MACS磁珠分選器、細(xì)胞凋亡試劑盒（德國美天旎生物技術(shù)有限公司），F(xiàn)ACsort流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）和人皮膚成纖維細(xì)胞由湘雅醫(yī)院細(xì)胞中心惠贈(zèng)。

二、HemEC的原代培養(yǎng)及鑒定

血管瘤標(biāo)本來源于湖南省兒童醫(yī)院外科7例手術(shù)切除的增生期血管瘤組織，患兒年齡≤6個(gè)月，并已征得患兒家長知情同意。收集的血管瘤組織一部分留作病理檢查，一部分用于HemEC原代培養(yǎng)：①消毒血管瘤組織，用含青鏈霉素的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，加入分散酶Ⅱ（2.4 U/ml）溶液5 ml，4℃冰箱消化過夜（12～18 h）；②第2天去除分散酶Ⅱ溶液，PBS洗2遍，移至10 cm培養(yǎng)皿中，去除瘤體周圍表皮及真皮，剪成1 mm3后置入15 ml離心管中，加0.2%Ⅰ型膠原酶10 ml，放至37℃水浴鍋，每隔15 min劇烈振蕩1次，消化2～3 h，直至呈乳糜狀；③用70 μm無菌濾網(wǎng)過濾去除殘余血管瘤組織，170×g離心5 min，棄上清液，用5 ml 0.1%牛血清白蛋白（BSA）反復(fù)重懸細(xì)胞，吹打混勻，離心，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；④每1×107個(gè)細(xì)胞加入60 μl 0.1%BSA溶液重懸，加30 μl Fc受體（FcR）抑制劑混勻，加30 μl CD31磁珠，放入4 ℃冰箱，孵育15 min；然后每1×107個(gè)細(xì)胞加入0.1%BSA溶液1 ml，按試劑說明進(jìn)行磁珠分選，收集到離心管內(nèi)的細(xì)胞懸液為CD31陽性細(xì)胞，即HemEC，然后13 523×g離心5 min，棄上清液；⑤用4 ml含20%胎牛血清的EGM?2培養(yǎng)基（EGM?2/20%FBS）重懸，計(jì)數(shù)；先用1 mg/L纖維黏連蛋白溶液包被25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以5×103個(gè)/cm2密度將細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h，48 h后更換培養(yǎng)液，以后每3天更換1次培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察并拍照；⑥細(xì)胞培養(yǎng)20～25 d達(dá)90%融合，按1∶3傳代。以原代培養(yǎng)的HemEC為實(shí)驗(yàn)組，以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，制作細(xì)胞爬片，采用vWF抗體和hoechst33342核酸染料和免疫熒光染色鑒定。

三、普萘洛爾干預(yù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及藥物配制

取6個(gè)無菌離心管，用EGM?2/0.5%FBS培養(yǎng)基分別配制25、50、75、100、125、150 μmol/L普萘洛爾溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。實(shí)驗(yàn)分為HemEC組和HUVEC組，每組又分為藥物干預(yù)組和空白對(duì)照組。藥物干預(yù)組又分為25、50、75、100、125、150 μmol/L普萘洛爾6組，空白對(duì)照組只加入相同量EGM?2/0.5%FBS培養(yǎng)基（不添加生長因子）。

四、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

消化處于對(duì)數(shù)生長期的HemEC、HUVEC，分別以每孔1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后去上清液，各孔分別加入不同濃度普萘洛爾200 μl，空白對(duì)照組加不含藥物的EGM?2/0.5%FBS培養(yǎng)基200 μl，再次培養(yǎng)24 ～ 72 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加藥物2 h后于顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照。分別在培養(yǎng)24、48、72 h后，加入5 g/L MTT溶液（50 μl/孔）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長490 nm處吸光度（A）值。細(xì)胞存活率=｛1－［（實(shí)驗(yàn)孔A值－調(diào)零孔A值）－（對(duì)照孔A值－調(diào)零孔A值）］/（對(duì)照孔A值－調(diào)零孔A值）｝×100%。

五、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

消化處于對(duì)數(shù)生長期HemEC和HUVEC，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，按2 ml/孔加入6孔板。培養(yǎng)12 h后待細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)基，各孔分別加入含不同濃度普萘洛爾的EGM?2/0.5%FBS培養(yǎng)基2 ml，空白對(duì)照組加不含藥物的相同培養(yǎng)基2 ml，再次培養(yǎng)24～72 h。分別在24、48、72 h后，吸去培養(yǎng)基，PBS溶液洗1次，加入0.5 ml不含乙二胺四乙酸胰酶消化細(xì)胞。當(dāng)鏡下細(xì)胞變圓、部分漂浮時(shí)，加1 ml完全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞懸液至流式管中，170×g離心5 min，棄上清液。加入3 ml PBS重懸洗滌細(xì)胞1次，170×g離心5 min，棄上清液。加入200 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞。加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（AnnexinV?FITC）5 μl，避光室溫孵育15 min。加5 μl碘化丙錠（PI）染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

六、表達(dá)譜基因芯片技術(shù)檢測(cè)普萘洛爾干預(yù)HemEC前后的基因表達(dá)差異

選取3例患者生長良好的第2代HemEC，標(biāo)記為HemEC?1、HemEC?2、HemEC?3，每例患者細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，共6組細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度約為1.0×106/孔，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h。當(dāng)培養(yǎng)板可見細(xì)胞鋪滿80%后，實(shí)驗(yàn)組加入含100 μmol/L普萘洛爾的EGM?2/0.5%FBS培養(yǎng)基2 ml，不加細(xì)胞因子，對(duì)照組加入不含藥物的相同培養(yǎng)基2 ml，培養(yǎng)18 h。棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，每孔加入1 ml Trizol裂解液，用無菌注射器反復(fù)吹打細(xì)胞，直至細(xì)胞全部溶解。13 523×g離心1 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移到無酶離心管中，-80℃冰箱保存、備用。按試劑說明分別提取總RNA并純化，采用Nano Drop儀器檢測(cè)RNA濃度及A260/A280比值。將純化的RNA送上海伯豪生物技術(shù)有限公司采用Agilent G3 Human 8*60K芯片進(jìn)行表達(dá)譜基因芯片檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行GO分析和Pathway分析，選擇差異大且與增殖或凋亡相關(guān)的基因，實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

除原代細(xì)胞培養(yǎng)和表達(dá)譜基因芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn)外，其他實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果用±s表示。采用SPSS19.0軟件，兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，對(duì)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料數(shù)據(jù)采用多因素重復(fù)測(cè)量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、人HemEC培養(yǎng)

7例的血管瘤組織中有3例成功培養(yǎng)出HemEC。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)5 h后開始貼壁，倒置相差顯微鏡下HemEC呈梭形、多角形，而HUVEC相對(duì)偏圓，細(xì)胞體積偏大。培養(yǎng)24 h后，HemEC開始分裂增殖，培養(yǎng)基表面浮有一部分未貼壁細(xì)胞。原代細(xì)胞前期增殖較緩慢，第14天時(shí)鏡下可見培養(yǎng)瓶底部貼壁生長的細(xì)胞密度仍然比較稀疏，之后增殖速度增快，第20天時(shí)鏡下見HemEC漩渦狀增殖，排列較整齊、密集，此時(shí)生長達(dá)90%融合，見圖1。傳代后的HemEC增殖活躍。

熒光顯微鏡下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和陰性對(duì)照組成纖維細(xì)胞胞核均出現(xiàn)藍(lán)色熒光；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)vWF的綠色熒光，以核周為主，而陰性對(duì)照組人成纖維細(xì)胞vWF染色呈陰性，證明此實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞確為HemEC。見圖2。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察從血管瘤組織分離培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（HemEC）形態(tài)（×200） 1A：培養(yǎng)第14天，可見稀疏的梭形或多角形HemEC，約占培養(yǎng)瓶底的30%；1B：培養(yǎng)第20天，可見旋渦狀密集排列的梭形細(xì)胞，細(xì)胞生長超過培養(yǎng)瓶底的90%

二、普萘洛爾干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞增殖活性變化

用0～150 μmol/L普萘洛爾處理HemEC和HUVEC 2 h后，HemEC形態(tài)隨藥物濃度的遞增而變化，可見細(xì)胞皺縮、變圓，脫壁漂浮，高濃度時(shí)甚至細(xì)胞輪廓消失；而HUVEC形態(tài)在低濃度時(shí)變化不明顯，普萘洛爾濃度遞增到100 μmol/L后，細(xì)胞開始出現(xiàn)皺縮、變圓，少許脫壁漂浮。

圖2 vWF抗體免疫熒光染色法鑒定血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（HemEC）（×400） HemEC胞核hoechst33342染色陽性（藍(lán)色熒光），胞質(zhì)vWF染色陽性（綠色熒光）；人成纖維細(xì)胞胞核hoechst33342染色陽性（藍(lán)色熒光），vWF染色陰性（綠色熒光）

對(duì)不同濃度普萘洛爾作用后HemEC及HUVEC的存活率數(shù)據(jù)進(jìn)行Mauchly球性檢驗(yàn)，顯示P=0.134，滿足協(xié)方差矩陣球性檢驗(yàn)，不需要對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正。25 μmol/L普萘洛爾作用24、48 h，可引起HemEC輕度增殖（F=6.06，P＜ 0.05）；≥ 100 μmol/L普萘洛爾作用≥24 h可引起HemEC存活率下降；而普萘洛爾濃度≥100 μmol/L、作用時(shí)間≥48 h才可引起HUVEC存活率下降。100～150 μmol/L普萘洛爾作用24～72 h對(duì)HemEC的抑制作用大于HUVEC，HemEC細(xì)胞存活率更低（100 μmol/L時(shí)，F(xiàn)=7.68；125 μmol/L 時(shí)，F(xiàn)=17.13；150 μmol/L 時(shí)，F(xiàn)=18.23；均P＜ 0.05），見圖3、4。

圖3 不同濃度普萘洛爾干預(yù)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（HemEC）后細(xì)胞存活率曲線 25 μmol/L普萘洛爾可引起HemEC輕微增殖，中高濃度萘洛爾則會(huì)引起HemEC存活率下降

圖4 不同濃度普萘洛爾干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后細(xì)胞存活率曲線

三、普萘洛爾干預(yù)后HemEC凋亡率變化

對(duì)不同濃度普萘洛爾干預(yù)不同時(shí)間后HemEC凋亡率數(shù)據(jù)進(jìn)行Mauchly球性檢驗(yàn)，顯示P=0.059，滿足協(xié)方差矩陣球性檢驗(yàn)。不同普萘洛爾濃度誘導(dǎo)的HemEC凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=664.96，P＜0.05），不同干預(yù)時(shí)間凋亡率差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=572.15，P＜0.05）。不同濃度普萘洛爾與不同干預(yù)時(shí)間存在交互作用，即不同濃度普萘洛爾作用下HemEC凋亡率隨時(shí)間的變化趨勢(shì)不同（F=85.25，P＜0.05）。兩兩多重比較顯示，100～150 μmol/L普萘洛爾作用下，HemEC凋亡率隨時(shí)間及濃度均逐漸升高（均P＜0.05）。見表1。

四、普萘洛爾干預(yù)前后HemEC基因表達(dá)譜變化

普萘洛爾干預(yù)HemEC后進(jìn)行芯片篩選，差異倍數(shù)≥1.5的基因有186條，其中明顯上調(diào)的有128條，明顯下調(diào)的58條。差異倍數(shù)＞2的基因有21條，見表2。對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行GO分析和Pathway分析，并查閱這些基因的相關(guān)功能和研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)差異倍數(shù)＞2的基因涉及下列功能：①細(xì)胞的增殖、凋亡；②細(xì)胞的活化、分化周期；③信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；④類固醇生物合成；⑤脂類生物合成；⑥D(zhuǎn)NA復(fù)制、損傷修復(fù)。其中，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9）、脂肪酸結(jié)合蛋白3（fatty acid binding protein 3，F(xiàn)ABP3）基因表達(dá)顯著上調(diào)，并分別為對(duì)照組的3.22倍與10.14倍，PCSK9、FABP3均與凋亡相關(guān)。以GAPDH為內(nèi)參，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，普萘洛爾干預(yù)后HemEC的PCSK9、FABP3 mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異倍數(shù)分別為9.88±2.19和21.90±8.18，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為7.028、4.427，P＜ 0.05），與芯片檢測(cè)結(jié)果相符。

表1 不同濃度普萘洛爾干預(yù)不同時(shí)間后血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（HemEC）凋亡率 %，±s

表1 不同濃度普萘洛爾干預(yù)不同時(shí)間后血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（HemEC）凋亡率 %，±s

注：n=5

普萘洛爾0 μmol/L 25 μmol/L 50 μmol/L 75 μmol/L 100 μmol/L 125 μmol/L 150 μmol/L 24 h 2.63±0.08 4.68±0.16 9.40±0.29 13.27±1.03 18.93±1.60 22.12±1.88 31.98±2.57 48 h 3.19±0.19 6.75±0.27 10.82±0.28 17.97±3.28 46.77±7.66 54.30±2.21 61.68±2.22 72 h 5.64±0.13 9.34±0.41 11.61±0.49 18.21±1.23 56.87±4.14 63.95±1.50 70.89±3.57

討 論

臨床研究表明，普萘洛爾治療嬰兒血管瘤療效顯著［2?5］，但其作用機(jī)制仍不明確。Chim等［6］體外培養(yǎng)HemEC，用普萘洛爾干預(yù)后其細(xì)胞活力、遷移能力下降，且濃度越高作用越強(qiáng)。Annabi等［7］在體外培養(yǎng)人大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，普萘洛爾干預(yù)后血管生成明顯減少，可能與抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP?9）分泌及內(nèi)皮細(xì)胞生成有關(guān)。HemEC過度增殖是血管瘤最特征性的病理改變，是血管瘤發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為普萘洛爾治療嬰兒血管瘤可能與抑制HemEC增生，促進(jìn)其凋亡有關(guān)。

本研究顯示，普萘洛爾干預(yù)后HemEC和HUVEC細(xì)胞形態(tài)均出現(xiàn)變化，可見細(xì)胞皺縮、變圓，脫壁漂浮。在普萘洛爾低濃度時(shí)，HemEC即出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化，而HUVEC形態(tài)變化不明顯；當(dāng)普萘洛爾濃度達(dá)到100 μmol/L后，HUVEC開始出現(xiàn)明顯形態(tài)改變，說明HemEC對(duì)普萘洛爾的作用比HUVEC敏感。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，≥100 μmol/L普萘洛爾作用≥24 h可引起HemEC存活率下降，這與既往研究相似［8］。Chim等［6］推測(cè)普萘洛爾通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF?1α）途徑降低血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）活性，導(dǎo)致PI3/Akt和p38/MAPK下調(diào)，抑制HemEC的增生。Ji等［9］發(fā)現(xiàn)，β受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素可通過增加HemEC中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)和VEGF受體2的活性，促進(jìn)HemEC增生，從反面印證β受體阻滯劑普萘洛爾有抑制HemEC增生的作用。魏珩等［10］發(fā)現(xiàn)，普萘洛爾抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖可能與抑制MMP?2、MMP?9的表達(dá)有關(guān)。

表2 普萘洛爾干預(yù)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（HemEC）前后部分差異表達(dá)基因（差異倍數(shù)≥2）

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)100～150 μmol/L普萘洛爾作用48 h以上時(shí)，HUVEC存活率也出現(xiàn)下降，表明普萘洛爾也可抑制HUVEC增生，只是需要更高的濃度和作用時(shí)間，這為臨床上采用普萘洛爾治療靜脈畸形提供了理論基礎(chǔ)。此外，25 μmol/L普萘洛爾作用24、48 h只能引起HemEC輕微增殖，提示臨床上采用普萘洛爾治療血管瘤的劑量不能太小。

目前，對(duì)普萘洛爾作用機(jī)制的研究還局限于對(duì)血管形成相關(guān)因子及細(xì)胞凋亡的影響，未能從整體上找出作用的靶點(diǎn)、途徑及分子機(jī)制。人表達(dá)譜基因芯片能一次性大規(guī)模、全自動(dòng)檢測(cè)數(shù)萬基因，已廣泛應(yīng)用于基因檢測(cè)、基因功能等的研究。張莉等［11］采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)血管瘤增生期與消退期之間差異表達(dá)的基因，結(jié)果顯示，在血管瘤增生期一些原癌基因和生長因子表達(dá)上調(diào)，而消退期促凋亡基因和信號(hào)通路上調(diào)，表明血管瘤的消退與凋亡相關(guān)。本研究顯示，普萘洛爾干預(yù)前后HemEC有明顯表達(dá)差異的基因有186個(gè)，PCSK9、FABP3、BBC3、E2F2、TSC22D3、AATK、PLEKHF1、PRUNE2、TRIB3等基因涉及細(xì)胞增殖、凋亡及調(diào)控，DDIT3、ERCC5等基因涉及DNA復(fù)制、損傷修復(fù)，SQSTM1、YWHAE、ErbB3等涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，DHCR24、DHCR7、HSD17B7、LSS等涉及類固醇生物合成，ELOVL6、FADS1等基因涉及脂類生物合成。提示普萘洛爾抑制HemEC增殖、促進(jìn)其凋亡是細(xì)胞代謝、生長調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、類固醇生物合成、脂類生物合成等多個(gè)基因靶位綜合作用的結(jié)果，但其中每個(gè)基因發(fā)揮的具體作用及作用途徑仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。人表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)果為進(jìn)一步研究普萘洛爾治療血管瘤的分子機(jī)制提供了重要依據(jù)。我們將進(jìn)一步探討普萘洛爾治療血管瘤的作用靶點(diǎn)，揭示其作用的分子機(jī)制，為普萘洛爾治療血管瘤提供更有力的理論依據(jù)。

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Effects of propranolol onin vitrocultured hemangioma endothelial cells and their mechanisms

Luo Yongqi,Zeng Yinghong,Hu Mengye,Tang Jianping
Department of Dermatology,Hunan Children′s Hospital,Changsha 410007,China（Luo YQ,Zeng YH,Tang JP）;Department of Electrocardiography,Hunan Provincial People′s Hospital,Changsha 410002,China（Hu MY）

Tang Jianping,Email:jpingtang@126.com

ObjectiveTo evaluate effects of propranolol on the proliferation and apoptosis ofin vitrocultured hemangioma endothelial cells（HemEC）,and to explore their molecular mechanisms.MethodsHemangioma tissues were resected from 7 children with proliferative hemangioma,and used forin vitroculture of HemEC.Meanwhile,cultured human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）served as controls.The 2 kinds of cells were treated with propranolol at different concentrations of 0,25,50,75,100,125 and 150 μmol/L for 24,48 and 72 hours separately.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to evaluate cellular proliferative activity,and flow cytometry to determine the apoptosis rate.Some cultured HemEC were divided into 2 groups to be treated with 100 μmol/L propranolol?containing culture medium（propranolol group）and culture medium alone（blank control group）,respectively,for 18 hours.Total RNA in the 2 groups was extracted separately.Differentially expressed genes in HemEC between the above 2 groups were identified by DNA microarray technology,and verified by real?time quantitative PCR.ResultsThe treatment with 25 μmol/L propranolol for 24 and 48 hours caused a slight proliferation of HemEC（P＜ 0.05）.The survival rate of HemEC was decreased after the treatment with propranolol at the concentration of≥ 100 μmol/L for more than 24 hours,while the proliferation of HUVEC was inhibited by the treatment with propranolol at the concentration of ≥ 100 μmol/L for more than 48 hours.During 24-72 hours of treatment with 100-150 μmol/L propranolol,the survival rates of HemEC were significantly lower than those of HUVEC（P＜ 0.05）.After the treatment with 100-150 μmol/L propranolol,the apoptosis rate of HemEC gradually increased with the increase in treatment duration and concentrations of propranolol（allP＜ 0.05）.Compared with the blank control group,186 differentially expressed genes（＞ 1.5?fold changes）were screened out by DNA microarray technology,including 128 up?regulated genes and 58 down?regulated genes.Real?time quantitative PCR showed that the mRNA expression of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9（PCSK9）and fatty acid binding protein 3（FABP3）in the propranolol group were（9.88 ± 2.19）and（21.90 ± 8.18）times that in the blank control group respectively（t=7.028,4.427 respectively,P＜ 0.05）.ConclusionsPropranolol at high concentrations can inhibit the proliferation of HemEC and HUVEC,and its inhibitory effect on HemEC is stronger than that on HUVEC.The inhibitory effect of propranolol on HemEC may be related to the inhibition of HemEC proliferation and promotion of HemEC apoptosis.

Hemangioma;Propranolol;Cell proliferation;Apoptosis;Gene expression profiling;Oligonucleotide array sequence analysis

Fund programs:Science and Technology Planning Program for Applied Basic Research of Hunan Province of China（2010FJ6001）;Natural Science Foundation of Hunan Province of China（11JJ5054）

湯建萍，Email：jpingtang@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.11.006

湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（2010FJ6001）；湖南省自然科學(xué)基金（11JJ5054）

2017?05?03）

周良佳 顏艷）