超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查水產(chǎn)品中28種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素

鞠玲燕，李兆杰*,王 駿，徐成鋼，崔 嘉

(1.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 威海 264200； 2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266001)

超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查水產(chǎn)品中28種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素

鞠玲燕1，李兆杰1*,王 駿2，徐成鋼1，崔 嘉1

(1.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 威海 264200； 2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266001)

建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查和分析水產(chǎn)品中28種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素的方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，Captiva ND Lipids小柱凈化，用Acquity UPLC@BEN C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)分離，以甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。采用正、負(fù)離子切換同時(shí)測(cè)定了28種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素，大大提高了檢測(cè)通量。以全掃描模式下提取的保留時(shí)間和一級(jí)母離子精確質(zhì)量數(shù)以及同位素豐度比，實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)品中多種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素的快速篩查；以自動(dòng)觸發(fā)采集的二級(jí)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行確證。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物的線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.99；除乙草胺、腐霉利和殺螟硫磷外，其他化合物的檢出限不大于10 μg/kg，回收率為65.7%～98.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.2%～11.3%。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速、可靠，適用于水產(chǎn)品中多種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素的高通量快速定性篩查和定量分析。

超高效液相色譜；靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜；農(nóng)藥；環(huán)境激素；快速篩查

環(huán)境激素是指干擾動(dòng)物和人體正常內(nèi)分泌機(jī)能的外源性化學(xué)物質(zhì)，此類(lèi)物質(zhì)具有環(huán)境毒性與類(lèi)似雌激素的作用，故又稱(chēng)環(huán)境雌激素或環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其在環(huán)境中不易降解，易通過(guò)食物鏈在生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)富集，具有致癌、致畸、致突變等作用[1-2]。歐盟、美國(guó)、日本等國(guó)家和地區(qū)早在20世紀(jì)90年代就啟動(dòng)環(huán)境激素的系統(tǒng)研究，目前已識(shí)別的環(huán)境激素中農(nóng)藥類(lèi)約占一半，農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素是環(huán)境激素中的最大類(lèi)別。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，也是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國(guó)，面臨著嚴(yán)峻的環(huán)境激素類(lèi)農(nóng)藥污染危害。目前，世界各國(guó)均已建立農(nóng)藥優(yōu)先名錄，加強(qiáng)對(duì)環(huán)境激素類(lèi)農(nóng)藥的監(jiān)控[3-4]。

目前，針對(duì)農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[5-7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-14]。而這些方法在檢測(cè)分析中存在以下問(wèn)題：對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的抗干擾能力不足，常出現(xiàn)假陽(yáng)性；無(wú)法同時(shí)在正負(fù)離子模式下檢測(cè)多種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素，故檢測(cè)化合物種類(lèi)有限；方法參數(shù)的優(yōu)化費(fèi)時(shí)費(fèi)力[15]。而高分辨質(zhì)譜(Orbitrap)具有較強(qiáng)的抗干擾能力和高通量，在簡(jiǎn)化前處理過(guò)程的同時(shí)，極大地?cái)U(kuò)展了檢測(cè)化合物的數(shù)量，可以同時(shí)對(duì)多種類(lèi)別農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素進(jìn)行快速篩查檢測(cè)。

本研究選擇歐盟、日本和我國(guó)環(huán)境激素優(yōu)先名錄中28種農(nóng)藥為研究對(duì)象，建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中多種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素的快速篩查和定量分析方法。方法采用Q-Exactive的正負(fù)離子全掃描模式獲得一級(jí)數(shù)據(jù)，通過(guò)提取目標(biāo)化合物的一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)獲得定性和定量結(jié)果，通過(guò)自動(dòng)觸發(fā)獲得的二級(jí)全掃描數(shù)據(jù)進(jìn)一步提高定性的準(zhǔn)確性。該方法快捷、方便、高通量，可用于水產(chǎn)品中多種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素的快速篩查和確證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive(美國(guó)Thermo Fisher公司); CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)(日立公司)；Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：除利谷隆、溴苯腈、土菌靈、涕滅威、甲萘威購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司外，其余標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。甲醇(色譜純，美國(guó)默克公司)；乙酸乙酯(色譜純，德國(guó) CNW 公司)。Captiva ND Lipids小柱(美國(guó)Agilent公司)為3 mL無(wú)滴落小柱，采用標(biāo)準(zhǔn)的SPE柱樣式，具有0.2 μm的過(guò)濾孔徑，填充料為聚偏氟乙烯和聚丙烯，可與甲醇或乙腈使用，雙層過(guò)濾介質(zhì)設(shè)計(jì)確保了流量一致，同時(shí)避免了過(guò)濾器堵塞，能夠有效消除蛋白、顆粒物以及樣品中的離子抑制磷脂。

1.2 色譜質(zhì)譜條件

1.2.1色譜條件色譜柱：Acquity UPLC@BEN C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；流速：0.2 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%甲酸水。梯度洗脫程序：0～2 min，10% A；2～8 min,10%～95%A；8～12 min，95%A；12～12.1 min,95%～10%A;12.1～15 min，10%A，分析時(shí)間：15 min。

1.2.2質(zhì)譜條件噴霧電壓：正離子模式3 kV，負(fù)離子模式2.8 kV；離子源溫度：300 ℃；傳輸金屬毛細(xì)管溫度：320 ℃；鞘氣壓力：30 arb；輔助氣壓力：10 arb；掃描范圍(m/z)：50～500 Da；一級(jí)質(zhì)譜全掃描(Full scan)分辨率：R=70 000；AGC target：3e6；最大注入時(shí)間：100 ms；數(shù)據(jù)依賴(lài)二級(jí)離子全掃描(FullMS/ddMS2)分辨率：R=17 500；(N)CE/stepped nce:20、40、60 eV；AGC target：2e5；最大注入時(shí)間：50 ms；動(dòng)態(tài)排除：10 s。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙酸乙酯，渦旋，超聲提取15 min，4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，將上層乙酸乙酯層轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，剩余殘?jiān)偌尤?0 mL乙酸乙酯，重復(fù)提取1次，合并乙酸乙酯層清液，40 ℃旋轉(zhuǎn)濃縮至干。準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇-水(8∶2)渦旋30 s，溶解殘?jiān)?，過(guò)Captiva ND Lipids小柱，收集液體，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

2.1.1提取溶劑的選擇本研究待測(cè)的農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素種類(lèi)較多，需兼顧各類(lèi)目標(biāo)檢測(cè)物的提取效率。實(shí)驗(yàn)考察了正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈4種提取溶劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯和乙腈提取的回收率均在80%以上，但乙腈提取液易吸附水分，旋蒸慢且不徹底。而乙酸乙酯提取液干凈、雜質(zhì)少，易于旋蒸。因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.1.2凈化方式的選擇水產(chǎn)品中含有較多的脂肪酸和一定的油脂。實(shí)驗(yàn)比較了HLB固相萃取柱、Florisil硅土固相萃取柱和Captiva ND Lipids小柱的凈化效果。發(fā)現(xiàn)Captiva ND Lipids小柱可有效去除脂類(lèi)、蛋白等基質(zhì)干擾，凈化效果最好，回收率在80%以上，且無(wú)需活化洗脫程序，凈化方法簡(jiǎn)便、快捷，因此選擇該柱進(jìn)行樣品凈化。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

考察了Acquity UPLC@BEN C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)超高效色譜柱和普通的C18色譜柱對(duì)待測(cè)物的分析效果。結(jié)果表明，前者能夠?yàn)榇郎y(cè)物提供尖銳對(duì)稱(chēng)的色譜峰形，具有更高的柱效和檢測(cè)靈敏度。同時(shí)，考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水4種流動(dòng)相對(duì)分析結(jié)果的影響。結(jié)果表明，有機(jī)相采用甲醇的分離結(jié)果和信號(hào)強(qiáng)度優(yōu)于乙腈，這可能是由于前者更易于揮發(fā)和離子化；而且當(dāng)流動(dòng)相中加入0.1%甲酸后，可以提高待測(cè)物質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度，故采用甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。由于不同類(lèi)環(huán)境激素性質(zhì)有差別，為實(shí)現(xiàn)有效分離，經(jīng)反復(fù)優(yōu)化，確定了“1.2.1”所述的流動(dòng)相梯度洗脫條件，28種環(huán)境激素可在15 min內(nèi)獲得較好的分離效果和較理想的峰形。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究采用高分辨質(zhì)譜的一級(jí)質(zhì)譜全掃描和數(shù)據(jù)依賴(lài)的二級(jí)質(zhì)譜掃描方式，對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物進(jìn)行定性篩查和確證。考慮到不同目標(biāo)待測(cè)物的性質(zhì)各異，一級(jí)質(zhì)譜全掃描采用正負(fù)離子切換掃描的方式來(lái)提高檢測(cè)通量，通過(guò)全掃描確定目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間(表1)。使用高分辨質(zhì)譜檢測(cè)目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù)對(duì)于同時(shí)準(zhǔn)確定性和定量非常重要，因此必須保證質(zhì)譜數(shù)據(jù)具有良好的質(zhì)量準(zhǔn)確度。表1列出的28種環(huán)境激素的質(zhì)量準(zhǔn)確度誤差均小于5 ppm，可見(jiàn)檢測(cè)物的質(zhì)量準(zhǔn)確度均很好，可以滿(mǎn)足定性需求。

表1 28種環(huán)境激素的精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間及質(zhì)量準(zhǔn)確度誤差Table 1 Accurate masses,retention times and mass accuracy error of the 28 environmental endocrine disrupting pesticides

高分辨質(zhì)譜最大的優(yōu)勢(shì)是通過(guò)高分辨率消除樣品中的基質(zhì)干擾，提高定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一級(jí)全掃描采用分辨率R=70 000，所有待測(cè)物可與基質(zhì)干擾物實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離。圖1為28種環(huán)境激素的提取離子色譜圖。

圖1 28種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 28 environmental endocrine disrupting pesticides

根據(jù)獲得的精確質(zhì)量數(shù)設(shè)定目標(biāo)物列表，僅在一級(jí)質(zhì)譜掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)列表中的母離子，且其強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閥值時(shí)，可自動(dòng)采集二級(jí)質(zhì)譜掃描。碰撞能量設(shè)為40 eV，并在此基礎(chǔ)上加減50%，即有3個(gè)碰撞能量對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行碰撞，最終加和獲得豐富的碎片離子(表2)。因此，分析結(jié)果既有母離子的精確質(zhì)量數(shù)，又有二級(jí)質(zhì)譜全掃描的碎片離子信息，提高了定性的準(zhǔn)確性，對(duì)于同分異構(gòu)體(如甲草胺和乙草胺、撲草凈和特丁凈)，二者保留時(shí)間雖基本一致，但可通過(guò)不同的碎片離子信息進(jìn)行定性篩查。高分辨質(zhì)譜除保留時(shí)間上無(wú)法區(qū)分的同分異構(gòu)體需借助二級(jí)碎片離子定量外，其余化合物均以母離子作為定量離子，且直接采用梯度設(shè)置碰撞能，大大簡(jiǎn)化了質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，節(jié)省了樣品分析前的準(zhǔn)備時(shí)間，更利于樣品的快速篩查和定量分析。

表2 28種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素的碎片離子信息Table 2 Fragment ions of the 28 environmental endocrine disrupting pesticides

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1方法的線(xiàn)性范圍與檢出限用不含待測(cè)物的空白基質(zhì)溶液配制一系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，經(jīng)高分辨質(zhì)譜測(cè)定，以色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液的質(zhì)量濃度(X, μg/kg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。采用向空白樣品中逐級(jí)降低加標(biāo)濃度的方法確定檢出限(LOD)，加標(biāo)樣品按“1.3”方法處理并上機(jī)檢測(cè)，以?xún)x器所能檢出的最低加標(biāo)濃度確定為方法的檢出限。結(jié)果表明，28種環(huán)境激素在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，大部分化合物的檢出限在0.5～10 μg/kg范圍內(nèi)，可滿(mǎn)足檢測(cè)要求(表3)。

表3 28種環(huán)境激素的相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍和檢出限Table 3 Correlation coefficients,linear range and LODs of 28 environmental hormones

(續(xù)表3)

No CompoundCorrelationcoefficient(r2)Linearrange(μg/kg)LODs(μg/kg)No．CompoundCorrelationcoefficient(r2)Linearrange(μg/kg)LOD(μg/kg)5Carbaryl0 999910～10001019Triadimefon0 99915～5005 06Procymidone0 9989100～1000010020Propanil0 999220～1000107Fenitrothion0 999720～20002021Dipterex0 99911～1001 08Metribuzin0 99941 0～1001 022Triadimenol0 999910-1000109Prometryn0 99960 5～1000 523Diazinon0 99901～1001 010Terbutryn0 99971～1000 524Etrdiazole0 99945～5005 011Simazine0 99941～1001 0252，4?D0 999810～10001012Malathion0 99985～5005 026Bromoxynil0 99842～1002 013Methomyl0 998510～10001027Dichlorophenol0 99882～1002 014Aldicarb0 999110～10001028Pentachlorophenol0 99920 5～1000 5

2.4.2回收率及精密度選取不同基質(zhì)(魚(yú)肉、蝦肉)的空白樣品，分別添加3個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”方法進(jìn)行前處理，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表4。測(cè)定的平均回收率為65.7%～98.9%，RSD為6.2%～11.3%。該方法具有較好的回收率和重復(fù)性，可滿(mǎn)足水產(chǎn)品中28種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素日常監(jiān)測(cè)的要求。

表4 魚(yú)肉和蝦肉中28種環(huán)境激素的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Average recovery and the relative standard deviation of 28 environmental hormones in fish and shrimp(n=6)

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本文建立的方法對(duì)20份魚(yú)肉、5份蝦肉、10份蛤肉和10份海帶樣品進(jìn)行測(cè)定，其中1份蛤肉樣品和1份海帶樣品中篩查出撲草凈殘留，含量分別為10.8 μg/kg和38.2 μg/kg。

以蛤肉中檢出撲草凈為例，介紹實(shí)際樣品中化合物的篩查和確證過(guò)程。首先，對(duì)樣品進(jìn)行FullMS/ddMS2檢測(cè)，將檢測(cè)數(shù)據(jù)通過(guò)Trace Finder的定性篩查軟件與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度以及二級(jí)碎片離子進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行快速篩查和確證；同時(shí)，通過(guò)Trace Finder定量軟件建立定量方法，確定目標(biāo)物含量。圖2為撲草凈在標(biāo)準(zhǔn)溶液和蛤肉陽(yáng)性樣品中的提取離子色譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖，可以看出在陽(yáng)性蛤肉樣品中采集到的撲草凈的保留時(shí)間、母離子和二級(jí)碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中采集到的撲草凈的保留時(shí)間和理論精確質(zhì)量數(shù)基本一致，表明篩查結(jié)果準(zhǔn)確可靠?？梢?jiàn)，隨著工業(yè)的發(fā)展，水體中農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素含量不斷增加，水產(chǎn)品中農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素的監(jiān)測(cè)應(yīng)引起重視。

圖2 撲草凈在標(biāo)準(zhǔn)溶液(A,C)和陽(yáng)性蛤肉樣品(B,D)中的色譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 Chromatograms and two-stage full mass scan spectra of prometryn in 10 μg/kg standard(A,C) and in positive clam sample(B,D)

3 結(jié) 論

本研究利用超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜，建立了快速定性篩查和定量分析水產(chǎn)品中28種農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素的方法。高分辨率質(zhì)譜保證了復(fù)雜基質(zhì)樣品中基質(zhì)干擾的消除，顯著提高了目標(biāo)物定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，數(shù)據(jù)依賴(lài)的二級(jí)質(zhì)譜全掃描進(jìn)一步提高了定性的準(zhǔn)確性。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，覆蓋環(huán)境激素種類(lèi)較廣，可實(shí)現(xiàn)正負(fù)離子模式同時(shí)掃描，一次檢測(cè)即可分析28種環(huán)境激素，并能準(zhǔn)確定性定量，適用于水產(chǎn)品中農(nóng)藥類(lèi)環(huán)境激素的快速篩查測(cè)定。

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[15] Liu H,Zhang Y L,Wang S L,Ding T,Xu N S,Gui Q W,Shen W J,Zhao Z Y,Wu B.J.Instrum.Anal.(柳菡，張亞蓮，丁濤，王歲樓，徐牛生，桂茜雯，沈偉健，趙增運(yùn)，吳斌．分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2014，33(5)：489-498.

Rapid Screening of 28 Pesticides Endocrine Disruptors in Aquatic Products by Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Quadrupole/Electrostatic Field Obitrap High-resolution Mass Spectrometry

JU Ling-yan1,LI Zhao-jie1*,WANG Jun2,XU Cheng-gang1,CUI Jia1

(1.Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Weihai 264200,China；2.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao 266001,China)

A rapid method was developed for the screening and quantification of 28 pesticides endocrine disruptors in aquatic products by ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field obitrap high-resolution mass spectrometry.The samples were extracted with ethyl acetate,and purified with a Captiva ND Lipids column.The separation was carried out on an ACQUITY UPLC@BEN C18column(2.1 mm×50 mm,1.7 μm) with methanol-water as mobile phases by gradient elution.The 28 pesticides endocrine disruptors were simultaneously analyzed in switching positive and negative modes.The retention time,accurate mass of parent ion and relative isotope abundance were used for fast screening in full scan mode,while accurate mass of fragment ions were used for comfirmation in two-stage threshold-triggered full mass scan mode.Under the optimal conditions,good linearities(r2>0.99) were obtained in their respective linear ranges.The limits of detections(LODs) for most compounds were not more than 10 μg/kg except for acetochlor,procymidone and fenitrothion.The recoveries were in the range of 65.7%-98.9% and the relative standard deviations(RSDs) were 6.2%-11.3%.The method was simple,sensitive and accurate,and was suitable for the rapid screening and confirmation of multiple pesticides endocrine disruptors in aquatic products.

ultra-performance liquid chromatography; obitrap high-resolution mass spectrometry; pesticides；endocrine disruptors; rapid screening

2017-08-17；

2017-09-20

山東檢驗(yàn)檢疫局科研計(jì)劃項(xiàng)目(SK201602)；國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(2015IK202)

*

李兆杰，博士研究生，高級(jí)工程師，研究方向：食品安全,Tel：0631-3807370,E-mail:yihan82527@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.12.005

O657.7；O657.63

A

1004-4957(2017)12-1445-07