中心硅藻梅尼小環(huán)藻淡水株和海水株亞顯微結構的形態(tài)學差異

李長玲, 陳健冰, 黃翔鵠

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中心硅藻梅尼小環(huán)藻淡水株和海水株亞顯微結構的形態(tài)學差異

李長玲, 陳健冰, 黃翔鵠

(廣東海洋大學水產(chǎn)學院, 廣東 湛江 524088)

本文利用18S rRNA基因對4株經(jīng)形態(tài)學初步鑒定的梅尼小環(huán)藻()進行了分子鑒定。結果顯示, 這4株分離自淡水環(huán)境(2株)和海水環(huán)境(2株)的梅尼小環(huán)藻的18S rRNA基因序列基本一致, 并與已經(jīng)報道的梅尼小環(huán)藻(登錄號為GQ148712和AY496212)聚為一支, 不同方法所構建的系統(tǒng)樹的支持率分別為99%(鄰接法)和98%(最大似然法), 表明這4株來自不同環(huán)境的藻為同一物種——梅尼小環(huán)藻。隨后作者利用掃描電鏡技術在亞顯微水平上對這4株梅尼小環(huán)藻進行了觀察, 結果顯示: 梅尼小環(huán)藻淡水株和海水株具有相當不同的亞顯微結構特征。生活在海水的梅尼小環(huán)藻藻株具有更大的細胞以及更多的中央支持突。此外, 本文還對造成梅尼小環(huán)藻種內(nèi)高水平形態(tài)差異的原因以及18S rRNA基因序列是否可以作為小環(huán)藻屬物種鑒定的分子標記做了分析和討論。

硅藻; 梅尼小環(huán)藻(); 亞顯微結構; 掃描電鏡; 18S rRNA

梅尼小環(huán)藻()隸屬于硅藻門(Bacillariophyta), 中心藻綱(Centricae), 圓篩藻目(Stephanodiscales), 圓篩藻科(Stephanodiscaceae), 小環(huán)藻屬(), 是一種廣鹽性浮游藻類, 在養(yǎng)殖池塘中較為常見。梅尼小環(huán)藻作為初級生產(chǎn)者, 在養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈中占據(jù)著重要的地位, 同時也是水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中水質調(diào)控的有益藻類[1]。此外, 它在漁業(yè)生產(chǎn)中也非常重要, 是魚、蝦、貝類等經(jīng)濟水產(chǎn)動物優(yōu)質的餌料[2]。梅尼小環(huán)藻還被認為是生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和短鏈飽和脂肪酸的優(yōu)良藻株, 在生物能源方面具有一定的開發(fā)潛力[3]。本文利用18S rRNA基因序列對4株經(jīng)形態(tài)學初步鑒定的, 來自淡水和海水的梅尼小環(huán)藻進行了分子鑒定, 并用掃描電鏡技術對這4株梅尼小環(huán)藻進行了亞顯微結構的觀察, 首次在亞顯微水平上對生長在不同環(huán)境下的梅尼小環(huán)藻進行了形態(tài)學差異比較研究, 以期為梅尼小環(huán)藻進一步的開發(fā)研究提供形態(tài)學數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 藻種來源和培養(yǎng)

淡水梅尼小環(huán)藻藻株FACHB-1030、FACHB-1661分離自武漢東湖, 由中國科學院淡水藻種庫提供(Freshwater Algae Culture Collection at the Institute of Hydrobiology, Wuhan, China, FACHB)。海水梅尼小環(huán)藻藻株GDOU1和GDOU2分離自湛江對蝦養(yǎng)殖池塘。

藻種用 250 mL三角瓶中培養(yǎng), 培養(yǎng)光照度為2 000 lx, 光照周期12L︰12D, 培養(yǎng)溫度為22℃。其中, 藻株FACHB-1661、FACHB-1030培養(yǎng)在DM培養(yǎng)基里[4], 藻株GDOU1、GDOU2培養(yǎng)在改良后的f/2海水培養(yǎng)基里[5]。

1.2 DNA提取, PCR擴增和測序

總基因組DNA用植物DNA試劑盒(Qiagen, Germany)進行提取。18S rRNA基因序列的擴增用Taq PCR混合試劑盒進行。反應體系為25 μL: 12.5 μL Taq mix 2×酶; 上下游引物各1.0 μL (引物保存濃度10 μmol/L); DNA模版1.0 μL; 最后加9.5 μL ddH2O定容到25 μL。PCR循環(huán)擴增在iCycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)中進行。PCR反應條件為: 94℃預變性4 min, 94℃變性30 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸2 min共35個循環(huán), 再72℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, EB染色, 凝膠成像系統(tǒng)記錄實驗結果。隨后用UNIQ-10 DNA純化試劑盒, 根據(jù)使用說明的實驗步驟進行膠純化回收(Sangon, China), 并對純化后的PCR擴增產(chǎn)物進行克隆, 克隆成功后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.3 系統(tǒng)學分析

將測序成功獲得的序列上傳到美國國立生物信息中心(the National Center for Biotechnology Information, NCBI, http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上, 應用Blast搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST)對實驗獲得的基因序列進行 Blast相似性比對分析, 確定目標片段是否正確, 同時進行同源性檢測。

根據(jù) Blast 比對結果, 從GenBank中下載包括外群在內(nèi)的其他相關的基因序列用于系統(tǒng)樹構建。用Clustal X 1.83[6]進行比對, 比對后的序列用MEGA 5.0軟件手動切掉兩端不整齊的冗余序列, 然后進行系統(tǒng)發(fā)育分析, 并采用鄰接法(Neighbor Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood, ML)構建系統(tǒng)進化樹, 計算bootstrap值, 重復1 000次[7]。

1.4 電鏡樣品制備及拍攝

取50 mL左右對數(shù)生長期的新鮮小環(huán)藻樣品, 3 000 r/min離心10 min, 濃縮成藻泥。硅藻殼的制備是在離心濃縮后的樣品中加入同等體積97%的濃硫酸, 放60℃水浴加熱10~20 min, 直至原生質被除掉。之后用蒸餾水清洗5次, 將樣品洗至中性。干燥后鍍金, 用中國農(nóng)業(yè)科學院的Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡觀察, 拍照。

2 結果

2.1 基于18S rRNA基因的系統(tǒng)樹構建

利用最大似然法和鄰接法構建的18S rRNA基因序列的系統(tǒng)樹具有相似的拓撲結構, 本文僅顯示了以最大似然法構建系統(tǒng)樹的拓撲結構, 如圖1所示。系統(tǒng)進化樹結果顯示: 本次實驗所采用的4株梅尼小環(huán)藻與已經(jīng)報道過的梅尼小環(huán)藻[8-9](登錄號為GQ148712、AY496212)聚為一支, 其中鄰接法構建的系統(tǒng)樹支持率為99%, 最大似然法構建的系統(tǒng)樹支持率為98%。表明這4株來自不同環(huán)境的藻為同一物種——梅尼小環(huán)藻。

圖1 基于18S rRNA基因序列的ML系統(tǒng)樹

內(nèi)部節(jié)點上顯示重復1 000次計算的自展支持率, 分別由鄰接法和最大似然法產(chǎn)生。分支的長度代表進化距離, 用0.01的標尺顯示。具有加粗字體和灰色背景的序列為本研究獲得的新序列

Bootstrap values are shown at the internal nodes for neighbor joining (NJ: 1 000 replications) and maximum likelihood (ML: 1 000 replications), respectively. Branch lengths correspond to evolutionary distances. A distance of 0.01 is indicated by the scale. The new sequences obtained in our study are bold and shaded in gray

2.2 細胞亞顯微結構觀察

2.2.1 梅尼小環(huán)藻淡水株的亞顯微結構

生活在淡水的梅尼小環(huán)藻, 直徑范圍在5~25 μm。從小環(huán)藻樣品的外觀來看(圖2中的1和3), 殼面的中央?yún)^(qū)或多或少有點起伏, 中央?yún)^(qū)大小約占殼面直徑的0.4~0.6。殼面中央?yún)^(qū)不規(guī)則地分布著小的硅質顆粒(Siliceous granules, SG)。邊緣區(qū)域條紋和非條紋區(qū)間隔分布, 圍繞著中央?yún)^(qū), 每5 μm有5~8個條紋。每個條紋包含四行網(wǎng)紋從中央?yún)^(qū)與邊緣區(qū)之間的過渡區(qū)域開始逐漸擴大到七行延伸到殼套處。在殼面和殼套接合處的非條紋區(qū)存在著刺狀突起(Spine, S)。從內(nèi)部殼面觀來看(圖2中的2和4), 一般情況殼面只有一個中央支持突(Central fultoportula, cFP), 圍著3個圍孔。在邊緣區(qū), 有6~13個殼緣支持突(Marginal fultoportula, mFP)圍繞著2個圍孔, 位于每一個或者每兩個肋脈之間。單一的唇形突(Rimoportula, RP)在向上方向形成一個長莖和唇形開口。

圖2 梅尼小環(huán)藻淡水株的亞顯微結構

外殼面觀. 1和3; 內(nèi)殼面觀. 2和4; 1和2的比例尺為3 μm, 3的比例尺為5 μm, 4的比例尺為4 μm; SP =刺狀突起; SG =硅質顆粒; cFP =中央支持突; mFP =殼緣支持突; RP =唇形突

Exterior of the valves: 1 and 3; Internal views of the valves: 2 and 4. The scale bar: Fig 1 and 2 is 3 μm, Fig 3 is 5 μm, Fig 4 is 4 μm; SP = Spine; SG = Siliceous granules; cFP = central fultoportula; mFP = marginal fultoportula; RP = rimoportula

2.2.2 梅尼小環(huán)藻海水株的亞顯微結構

生活在海水的梅尼小環(huán)藻常以單細胞存在, 很少形成短鏈(如2~3個細胞), 直徑為12~30 μm。在掃描電子顯微鏡下, 從外殼面觀來看(圖3中的5和7), 殼面被分成兩個完全不同的區(qū)域, 中央?yún)^(qū)域幾乎平整, 可見三開口的中央支持突, 中央?yún)^(qū)占殼面半徑的0.3~0.5。殼面邊緣區(qū)具有相等長度的條紋, 4行網(wǎng)隙從殼面的中央?yún)^(qū)擴增為6行延伸到殼套, 每5 μm 有4~6個條紋。在殼面和殼套接合處的非條紋區(qū)可以發(fā)現(xiàn)有刺狀突起。從內(nèi)殼面觀來看(圖3中的6和8), 殼面是平滑的, 每個殼面有3~14個中央支持突和16~23個殼緣支持突, 所有這些支持突都向外開口, 并且每一個支持突都圍繞著3個圍孔, 具有唇形開口的唇形突, 但并不明顯。

圖3 梅尼小環(huán)藻海水株的亞顯微結構

外殼面觀. 1和3圖; 內(nèi)殼面觀. 2和4圖; 3圖比例尺為10 μm, 其他圖的比例尺為5 μm; SP = 刺狀突起; SG =硅質顆粒; cFP =中央支持突; mFP =殼緣支持突

Exterior of the valves: 1 and 3; Internal views of the valves: 2 and 4. Except the scale bar of Fig 3 is 10 μm, others are 5 μm; SP = Spine; SG = Siliceous granules; cFP = central fultoportula; mFP = marginal fultoportula

2.2.3 梅尼小環(huán)藻淡水株與海水株的形態(tài)學比較

成熟的梅尼小環(huán)藻的海水株與淡水株在形態(tài)學上有著明顯的不同, 見表1。其中, 海水株的直徑略大于淡水株。每5 μm的條紋數(shù)目, 海水株有4~6個, 而淡水株有5~8個。海水株邊緣支持突的個數(shù)要遠多于淡水株, 可達16~23個, 一般每一個或兩個非條紋區(qū)就有一個邊緣支持突; 而淡水株的邊緣支持突數(shù)為6~13個, 一般每兩個或三個非條紋區(qū)才有一個邊緣支持突。除此之外, 在邊緣支持突的圍孔數(shù)上兩者也存在著差異, 海水株邊緣支持突的圍孔數(shù)一般為3個; 而淡水株一般為3個, 但也有2個圍孔數(shù)的邊緣支持突被觀察到。海水株在每個殼面中央支持突的個數(shù)也比淡水株多, 一般在2~14個左右, 而淡水株僅有1個, 但兩者中央支持突的圍孔數(shù)相同, 每個中央支持突的圍孔數(shù)都為3個。兩者都存在一個唇形突, 但海水株的唇形突不明顯。此外, 兩者在殼面和殼套接合處的非條紋區(qū)都存在刺狀突起, 在殼面中央?yún)^(qū)也都不規(guī)則地分布著硅質顆粒。

表1 梅尼小環(huán)藻淡水株與海水株的亞顯微結構特征比較

Tab.1 Comparison of the ultrastructures of freshwater and seawater strains of C. meneghiniana

3 討論

硅藻的祖先來自海洋, 但很多時候它們獨立地生活在淡水中, 鹽度被認為是硅藻分布的一個屏障。然而, Alverson[10]的研究結果顯示鹽度屏障也沒有作者先前想象的那么強大, 例如,已經(jīng)被推測作為一個大枝系, 在海洋, 半咸水和淡水都有生存的物種。海水-淡水轉變的方向目前還不清楚, 在歷史事件中, 藻株在海水和淡水之間轉變成功的例子非常少, 而且繁殖后代是不可逆的。在淡水和海水中, 或者在這兩個中間的棲息地都能發(fā)現(xiàn)小環(huán)藻物種, 因此, 小環(huán)藻被稱為“廣鹽性”物種, 以及預測它可能代表為數(shù)不多由海洋棲息地到淡水轉變的分類群的例子[11]。

梅尼小環(huán)藻是“廣鹽性”硅藻物種中最常見的一種[12], 其形態(tài)特征已經(jīng)被很多文獻報道過[13-17], 但也有將隱秘小環(huán)藻()在形態(tài)學觀察下錯誤的推斷為梅尼小環(huán)藻的報道[18]。由此可見, 形態(tài)學特征并不總是小環(huán)藻界定物種和系統(tǒng)發(fā)育關系的可靠指標, 如果沒有分子水平上的研究, 僅僅依據(jù)顯著的形態(tài)學差異來鑒定物種, 那么來自淡水和海水的梅尼小環(huán)藻很有可能會被錯誤的鑒定為不同的物種。利用分子生物技術可以提高作者在硅藻物種的分類和界定研究中發(fā)現(xiàn)和提取細微差異的能力[19-20], 因此, 作者對4株經(jīng)形態(tài)學初步鑒定為梅尼小環(huán)藻的藻株進行了以18SrRNA基因為分子標記的分子鑒定, 用以確定所研究的藻株為梅尼小環(huán)藻無誤, 并在此鑒定的結果上進行形態(tài)學上的比較研究, 這樣則更有利于人們推斷不同環(huán)境下造成同一種藻不同形態(tài)的原因。

作者研究結果顯示, 來自不同環(huán)境下的4株梅尼小環(huán)藻有著幾乎完全一致的18S rRNA基因序列, 但卻在亞顯微結構上存在較大的差異。這一結果與已經(jīng)報道的另外一個硅藻物種的情況相似, 而被認為是同一物種的不同生態(tài)表型[21]。除此之外, 物種適應不同環(huán)境條件的能力與細胞形態(tài)多變的特征有關, 如Borowitzka等[22]指出,中空泡結構的不同可能是其生活在特定條件的適應能力的一個重要因素。因此, 在不同環(huán)境下(淡水和海水)梅尼小環(huán)藻具有不同的形態(tài)結構的主要原因作者更傾向于是物種自身對環(huán)境條件的一種形態(tài)學響應。目前, 作者還無法得知它是如何做出響應的。而生活在海水的梅尼小環(huán)藻藻株具有更大的細胞以及更多的中央支持突, 可能是其生存在高鹽度、不穩(wěn)定環(huán)境的適應能力的一個重要因素。這些研究結果將會幫助作者更加準確地區(qū)分生活在不同環(huán)境下, 形態(tài)不同的同一物種。另一方面, 有研究指出, 18S rRNA基因的DNA序列處于中度保守, 更適合屬水平的系統(tǒng)發(fā)育研究[23]。從本研究的結果來看, 來源于不同區(qū)域的梅尼小環(huán)藻聚為一支, 并與其他小環(huán)藻屬的物種有著明顯的差異, 如圖1所示, 說明18S rRNA基因序列在小環(huán)藻屬物種間存在明顯的遺傳差異, 有潛力作為小環(huán)藻屬物種鑒定的分子標記。但是人們同時也看到, 針對于來自不同環(huán)境或區(qū)域的梅尼小環(huán)藻, 種內(nèi)不同株系之間的18S rRNA基因序列遺傳差異非常小, 因此, 18S rRNA基因序列在種內(nèi)不同株系之間顯得過于保守, 可能不適合作為小環(huán)藻種內(nèi)不同株系物種鑒定的分子標記。

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(本文編輯: 梁德海)

Ultrastructure of the centric diatom: morphological differences between freshwater and seawater strains

LI Chang-ling, CHEN Jian-bing, HUANG Xiang-hu

(Fisheries College of Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

In this paper, four strainswere identified using 18S rRNA gene sequences. The results show that the 18S rRNA gene sequences of these four strains (two come from freshwater and two from seawater) are very similar and that these four strains are closely related to(GQ148712 and AY496212) with high support (99/98 for neighbor joining/maximum likelihood). According to the molecular results, the four strains are of the same species, i.e.,. Then, the ultrastructure of the four strains was studied using scanning electron microscopy (SEM). The results show that the ultrastructure of freshwateris different from that of seawater, which also have larger cells and contain higher amounts of central fultoportula. In addition, this paper analyzed the causes of high-level morphology differences withinspecies and discussed whether the 18S rRNA gene can be used as a molecular marker for the identification ofspecies.

diatom;; ultrastructure; scanning electron microscopy; 18S rRNA

[Marine Fishery Science and Technology and Industry Development Project of Guangdong Province, No.A201508B08]

Dec. 9, 2016

Q179.1

A

1000-3096(2017)08-0116-06

10.11759/hykx20161023002

2016-12-09;

2017-04-01

廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(A201508B08)

李長玲(1964-), 女, 河南焦作人, 教授, 碩士, 主要從事水域生態(tài)學研究, 電話: 0759-2396044, E-mail: ybcl901@126.com; 黃翔鵠, 通信作者, 教授, 博士, 電話: 0759-2396044, E-mail: hxh166@126.com