雨生紅球藻細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換和藻落形成差異研究

程天佑, 徐曉瑩, 張文蕾, 張 維, 陳 林, 袁冠華, 劉天中

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雨生紅球藻細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換和藻落形成差異研究

程天佑1, 2, 徐曉瑩1, 2, 張文蕾1, 張 維1, 陳 林1, 袁冠華1, 2, 劉天中1

(1. 中國科學(xué)院 青島生物能源與過程研究所, 中國科學(xué)院 生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266101; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

基于雨生紅球藻()培養(yǎng)過程中游動(dòng)細(xì)胞和不動(dòng)細(xì)胞的形態(tài)差異與轉(zhuǎn)換, 對(duì)比研究了兩種細(xì)胞類型在離心收集與藻落形成效率上的差異。結(jié)果表明, 雨生紅球藻SCCAP K-0084在BYA培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4~6 d和9~12 d分別以綠色游動(dòng)細(xì)胞與綠色不動(dòng)細(xì)胞為主; 早期游動(dòng)細(xì)胞離心收集需要更高的離心力, 但500~1 000離心5 min可以在不影響細(xì)胞存活率的情況下有效收獲所有類型細(xì)胞; 相比于傳統(tǒng)直接涂布法, 雙層瓊脂平板法可有效提高平板藻落形成效率, 且游動(dòng)細(xì)胞藻落形成效率比不動(dòng)細(xì)胞藻落形成效率更高。TAP培養(yǎng)基由于藻落形成效率較低并不適合于雨生紅球藻平板培養(yǎng)與篩選, 自養(yǎng)型培養(yǎng)基雖然具有較好的藻落形成效率但是藻落形成速度較慢, 相比而言, BYA培養(yǎng)基藻落形成效率較高且生長速度快, 更適合用于雨生紅球藻細(xì)胞的后期平板培養(yǎng)與篩選過程。

雨生紅球藻(); 游動(dòng)細(xì)胞; 不動(dòng)細(xì)胞; 形態(tài)轉(zhuǎn)換; 藻落形成差異

蝦青素具有極強(qiáng)的抗氧化活性和良好的著色能力[1], 在醫(yī)藥、保健、食品以及養(yǎng)殖業(yè)等方面均具有巨大應(yīng)用價(jià)值[2]。雨生紅球藻的蝦青素含量可高達(dá)其干質(zhì)量的4%, 是目前已知的蝦青素含量最高的生物物種[3]。近年來, 隨著雨生紅球藻的技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用, 基于細(xì)胞與基因工程篩選[4-5]、選育與開發(fā)性狀優(yōu)良的雨生紅球藻藻種越來越受到研究者們的關(guān)注。

許多國內(nèi)外學(xué)者層通過電轉(zhuǎn)化[6]、基因槍[7]、土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)整合[8]等方法嘗試建立穩(wěn)定的雨生紅球藻轉(zhuǎn)化與外源基因表達(dá)技術(shù), 但以色列Sammy Boussiba的研究[9]顯示, 迄今為止僅有基因槍法實(shí)現(xiàn)了雨生紅球藻穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化。相反, 普遍用作分子生物學(xué)研究模式物種的萊茵衣藻能夠通過多種途徑與手段實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化與表達(dá)[10]。因此, 開發(fā)更豐富的雨生紅球藻轉(zhuǎn)化手段, 并建立更穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體系, 一直是學(xué)界關(guān)注的問題。

雨生紅球藻在培養(yǎng)過程中存在游動(dòng)細(xì)胞與不動(dòng)細(xì)胞兩種細(xì)胞類型, 這兩種細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理上存在明顯差異[11]。當(dāng)對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)操作時(shí), 這兩種細(xì)胞類型在遺傳轉(zhuǎn)化效率上必定存在明顯差異。因此要實(shí)現(xiàn)雨生紅球藻細(xì)胞高效穩(wěn)定的遺傳操作, 比較理想的條件是首先要獲得單一類型(或至少占絕大多數(shù)比例)的細(xì)胞。要實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn), 必須要了解雨生紅球藻培養(yǎng)過程中的細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換及其影響因素。

本研究以雨生紅球藻SCCAP-K0084為材料, 在含有低濃度醋酸鈉和酵母提取物的BYA培養(yǎng)基中培養(yǎng), 通過觀測(cè)培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長與形態(tài)轉(zhuǎn)換, 確定培養(yǎng)過程中兩種細(xì)胞類型的組成變化特點(diǎn), 并考察了兩種細(xì)胞的離心收集和藻落形成差異。研究結(jié)果證明雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞和不動(dòng)細(xì)胞的藻落形成效率存在明顯差異, 而且不同的培養(yǎng)基組成對(duì)于細(xì)胞的藻落形成效率也存在重要影響。這一研究的報(bào)道, 對(duì)于根據(jù)不同細(xì)胞類型建立更高效與穩(wěn)定的雨生紅球藻分子生物學(xué)操作技術(shù)具有重要支持作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種

雨生紅球藻(K-0084), 購于丹麥哥本哈根大學(xué)藻種保藏庫(SCCAP), 本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基包括: BG11培養(yǎng)基[12], 八倍磷酸二氫鉀8P-BG11培養(yǎng)基, BG11基礎(chǔ)上添加2 g/L的乙酸鈉和2 g/L的酵母提取物的BYA培養(yǎng)基, BBM培養(yǎng)基[13], 三倍硝酸鈉的3N-BBM培養(yǎng)基, TAP培養(yǎng)基[14]; 固體培養(yǎng)基(包括8P-BG11, 3N-BBM, BYA和TAP)則在相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂。

在250 mL錐形瓶中加入150 mL BYA培養(yǎng)基, 接入在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)了10~15 d的雨生紅球藻種子液, 接種密度控制在4×103~6×103個(gè)/mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)兩組平行, 控制培養(yǎng)溫度為(25±1)℃, 持續(xù)光照為(25±1)μmol/(m2×s), 每天隨機(jī)調(diào)換三角瓶位置并定時(shí)搖勻3次, 使得各組光照盡可能一致。每隔24 h定點(diǎn)取樣2 mL, 用于細(xì)胞計(jì)數(shù)以及其他參數(shù)測(cè)定。平板則置于溫度為(25±1)℃, 持續(xù)光照為15~20mmol/(m2×s)的環(huán)境下培養(yǎng)。

1.3 液體培養(yǎng)基細(xì)胞密度計(jì)數(shù)和形態(tài)轉(zhuǎn)換觀察

液體細(xì)胞密度計(jì)數(shù): 培養(yǎng)期間每天定時(shí)觀察取樣, 取樣前充分搖勻藻液, 游動(dòng)細(xì)胞以0.25%戊二醛固定后用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡(Olympus BX51)下觀察計(jì)數(shù), 每個(gè)樣本至少重復(fù)統(tǒng)計(jì)3次, 每個(gè)平行至少統(tǒng)計(jì)200 細(xì)胞。同時(shí), 在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否有鞭毛結(jié)構(gòu)、膠質(zhì)鞘以及細(xì)胞大小形狀等以確定不動(dòng)細(xì)胞比例(不動(dòng)細(xì)胞比例=不動(dòng)細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%), 同時(shí)用0.019%的Triton-X100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理以確定游動(dòng)細(xì)胞比例[15-16](游動(dòng)細(xì)胞計(jì)算公式為= 0.943+0.846, 其中為Triton敏感細(xì)胞比例,為游動(dòng)細(xì)胞比例), 兩個(gè)結(jié)果共同確定培養(yǎng)中游動(dòng)細(xì)胞以及不動(dòng)細(xì)胞比例。

1.4 細(xì)胞活力染色

細(xì)胞活力測(cè)定以酚番紅花紅為標(biāo)準(zhǔn)[17], 酚番紅花紅染色劑被配制成1 mg/mL保存于4℃冰箱中, 并在0.01% 濃度時(shí)檢測(cè)細(xì)胞活力, 此濃度下只有死細(xì)胞才可被染色, 每次統(tǒng)計(jì)不低于200 細(xì)胞, 每個(gè)樣本至少重復(fù)統(tǒng)計(jì)3次。綠色活細(xì)胞數(shù)記為, 紅色死亡細(xì)胞數(shù)記為, 死細(xì)胞比例=/(+)×100%, 活細(xì)胞比例=/(+)×100%。

1.5 離心收集檢查

在50 mL離心管中加入35 mL藻液后進(jìn)行不同離心力和離心時(shí)間的收集(臺(tái)式高速冷凍離心機(jī), Beckman Coulter), 之后觀察上清液是否澄清, 同時(shí)取1 mL進(jìn)行鏡檢, 以確定上清殘留細(xì)胞數(shù), 收集率不小于90% 即認(rèn)為能夠有效離心收集, 記下其最低離心力和時(shí)間。2 mL EP管中加入1.8 mL的藻液后操作與50 mL離心管相同(H 1650-W臺(tái)式離心機(jī), 湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。每一次離心之后重新?lián)u勻藻液, 并取出1 mL進(jìn)行細(xì)胞活力染色測(cè)定, 以確定離心對(duì)藻細(xì)胞的影響。收集率=(初始細(xì)胞密度–殘留細(xì)胞密度)/初始細(xì)胞密度×100%。

1.6 不同細(xì)胞涂布方式藻落形成效率

直接涂平板: 液體細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞密度稀釋至 2×103個(gè)/mL, 取100 μL液體涂平板(TAP培養(yǎng)基), 每個(gè)樣品至少3個(gè)重復(fù), 20 d后進(jìn)行平板藻落計(jì)數(shù), 平板藻落形成效率=/200×100%。

雙層瓊脂法: 以常規(guī)方式倒底層培養(yǎng)基平板, 將加入1% 濃度的低熔點(diǎn)瓊脂糖(low melting-point agarose, Solarbio)的培養(yǎng)基溶液滅菌后用42℃維持, 取1 mL該低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基于2 mL的EP管中, 加入100 μL細(xì)胞液, 混勻后置于平板表面并小心搖晃平板使其均勻分布于平板上。

玉米淀粉法(玉米淀粉, 國藥): 將玉米淀粉用無菌水與無水乙醇依次各洗滌 2 次, 懸于滅菌水配制的75% (/)乙醇中, 并使得玉米淀粉終濃度為 20% (/)。使用的時(shí)候先用加入了0.4% PEG8000 (/)的滅菌液體培養(yǎng)基反復(fù)洗滌3次, 重懸后每1 mL懸液中加入 50 μL細(xì)胞液, 將這1 mL混懸液涂平板。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用excel軟件對(duì)平行樣品進(jìn)行方差分析, 用Sigmaplot作圖, 用SPSS軟件進(jìn)行結(jié)果間的多重分析,<0.05差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 雨生紅球藻培養(yǎng)中生長曲線和細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換

圖1顯示了雨生紅球藻SCCAP K-0084在BYA培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d的生長以及細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換。培養(yǎng)2 d后細(xì)胞開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期, 第3天細(xì)胞密度從初始接種的6×103個(gè)/mL增長到 105個(gè)/mL以上, 到第6天對(duì)數(shù)生長期中止, 細(xì)胞密度達(dá)到6×105個(gè)/mL以上, 在整個(gè)對(duì)數(shù)生長期中, 雨生紅球藻主要是以游動(dòng)細(xì)胞的形式進(jìn)行繁殖, 游動(dòng)細(xì)胞比例基本維持在 80% 以上。從第7天培養(yǎng)開始, 細(xì)胞維持了2~3 d的緩慢生長, 細(xì)胞密度最高達(dá)到8×105個(gè)/mL左右, 并且細(xì)胞開始逐步的向不動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)換, 培養(yǎng)11~12 d后, 培養(yǎng)液中大約 80% 左右的細(xì)胞已完全進(jìn)入綠色的不動(dòng)細(xì)胞期。

圖1 雨生紅球藻在培養(yǎng)中細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換和細(xì)胞密度曲線

圖2中分別顯示了雨生紅球藻SCCAP K-0084的綠色游動(dòng)細(xì)胞和綠色不動(dòng)細(xì)胞階段的形態(tài)。相對(duì)于游動(dòng)細(xì)胞, 不動(dòng)細(xì)胞失去了鞭毛, 且部分細(xì)胞還失去了細(xì)胞外膠質(zhì)鞘的包裹, 不同培養(yǎng)時(shí)期細(xì)胞類型存在明顯差異, 對(duì)數(shù)期細(xì)胞(3~6 d)主要以游動(dòng)細(xì)胞形式存在, 而穩(wěn)定期的細(xì)胞(9~12d)則更多是以不動(dòng)細(xì)胞形態(tài)存在。

2.2 雨生紅球藻細(xì)胞的離心收集

雨生紅球藻培養(yǎng)中細(xì)胞密度一般僅能達(dá)到 105~ 106個(gè)/mL, 然而對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)操作, 通常需要將細(xì)胞濃縮到 107~108個(gè)/mL的細(xì)胞密度, 因此離心收集是必不可少的環(huán)節(jié)。

BYA中培養(yǎng)4、8和12 d后的細(xì)胞分別在不同離心條件下進(jìn)行離心, 結(jié)果如表1所示。培養(yǎng)4 d后的對(duì)數(shù)期細(xì)胞, 以游動(dòng)細(xì)胞為主, 在50 mL和2 mL離心管中離心5 min需要的最低離心力分別為500和400; 培養(yǎng)8 d的細(xì)胞中游動(dòng)細(xì)胞占60%, 其在50 mL和2 mL離心管中離心需要的最低離心力分別為400和300; 而培養(yǎng)12 d后不動(dòng)細(xì)胞占80%以上, 其在50 mL和2 mL離心管中所需的離心力分別降低到了200和100。這一結(jié)果表明, 不動(dòng)細(xì)胞相比于游動(dòng)細(xì)胞, 離心收集需要的離心力更低, 研究還發(fā)現(xiàn)即使在最低離心力下提高離心時(shí)間也不能明顯改善收集效果。實(shí)驗(yàn)中還考察了提高離心力和增加離心時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響, 結(jié)果如圖3 所示。游動(dòng)細(xì)胞與不動(dòng)細(xì)胞在離心力不大于1000時(shí), 藻細(xì)胞存活率為85%~ 92%, 同未離心的對(duì)照樣品沒有明顯差異(>0.05)。因此, 500~1000離心5~10 min完全能夠適用于雨生紅球藻不同類型細(xì)胞的高效收集。

圖2 雨生紅球藻綠色游動(dòng)細(xì)胞與綠色不動(dòng)細(xì)胞的形態(tài)

表1 游動(dòng)細(xì)胞與不動(dòng)細(xì)胞離心最低離心力

圖3 不同離心條件對(duì)游動(dòng)細(xì)胞與不動(dòng)細(xì)胞存活率的影響

A. 300×10 min, B. 500×5 min, C. 500×10 min, D. 700×5 min, E. 1000×5 min

2.3 植板方式對(duì)藻落形成效率的影響

平板的篩選是細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程不可缺少的步驟, 因此平板藻落形成的效率對(duì)于高效與成功的轉(zhuǎn)化過程非常重要。傳統(tǒng)涂布器的涂布方式有可能對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生物理損傷, 從而降低藻落形成效率。本研究對(duì)比了涂布器直接涂布、玉米淀粉法以及雙層瓊脂法3種植板方式下的藻落形成效率。

如表2所示, BYA培養(yǎng)4 d后的雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞通過直接涂布方式在TAP平板上藻落形成效率很低, 僅為10.83%。通過玉米淀粉輔助的方法藻落形成效率可提高到13.83%, 效果仍不顯著(>0.05)。頂生瓊脂法則能夠顯著性的將藻落形成效率提高到21.67%(<0.05)。因此, 頂生瓊脂法是較適合于雨生紅球藻細(xì)胞藻落形成與篩選的植板方式。

表2 不同植板方式對(duì)藻落形成效率的影響

2.4 雨生紅球藻在不同培養(yǎng)基上藻落形成效率的差異

為了進(jìn)一步提高雨生紅球藻的藻落形成效率, 對(duì)比考察了BYA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4、8與12 d的細(xì)胞, 在8P-BG11、TAP、BYA和3N-BBM四種培養(yǎng)基中的藻落形成效率。

如圖4, 在傳統(tǒng)TAP平板上雨生紅球藻藻落形成效率較低, 4 d、8 d和12 d細(xì)胞的藻落形成效率僅有18%、11.33% 和6%。而4 d培養(yǎng)獲得的游動(dòng)細(xì)胞在BYA、8P-BG11和3N-BBM平板上藻落形成效率可分別能達(dá)到52.83%、53.17%和42.67%, 顯著性高于TAP平板的藻落形成效率(<0.05)。這種顯著性的差異同樣在培養(yǎng)8 d與12 d細(xì)胞的藻落形成中出現(xiàn)。結(jié)果還顯示培養(yǎng)4 d后獲得的細(xì)胞比培養(yǎng)8 d與12 d后獲得的細(xì)胞具有更高的藻落形成效率?？紤]到培養(yǎng)4d后獲得的細(xì)胞主要是游動(dòng)細(xì)胞(>80%), 這說明游動(dòng)細(xì)胞比不動(dòng)細(xì)胞有更高的藻落形成效率。另外, 四種平板培養(yǎng)基中, 在TAP和BYA培養(yǎng)基中細(xì)胞生長速率更快, 一般經(jīng)過2周時(shí)間就能夠出現(xiàn)明顯的藻落, 如圖5所示。經(jīng)過25 d平板培養(yǎng)后, BYA和TAP上的克隆已經(jīng)非常明顯。在8P-BG11和3N-BBM平板培養(yǎng)基中才剛剛形成較為明顯的克隆。因此, 對(duì)于雨生紅球藻的平板培養(yǎng)與篩選, 游動(dòng)細(xì)胞藻落形成效率較高, TAP培養(yǎng)基因藻落形成效率低并不適合培養(yǎng)與篩選, 8P-BG11和3N-BBM雖然藻落形成效率較高但生長緩慢, 只有BYA培養(yǎng)基能夠更快更有效的用于雨生紅球藻的平板篩選。

圖4 8P-BG11、TAP、BYA和3N-BBM四種培養(yǎng)基對(duì)BYA培養(yǎng)4、8和12 d細(xì)胞藻落形成效率的影響

Fig. 4 Effects of different phycocolony forming rates of cells cultivated at 4, 8, and 12 days in the mixotrophic medium BYA on four types of solid plates (8P-BG11, TAP, BYA, and 3N-BBM)

圖5 BYA培養(yǎng)4、8和12 d的細(xì)胞在8P-BG11、TAP、BYA和3N-BBM四種固體培養(yǎng)基平板上生長25 d的藻落大小對(duì)比

3 討論

雨生紅球藻不僅可以進(jìn)行光合自養(yǎng)生長, 而且可以基于乙酸(鹽)為底物進(jìn)行異養(yǎng)或兼養(yǎng)生長[18]。以往的研究證明乙酸鈉的添加, 提高了雨生紅球藻的生長速率, 且在乙酸鈉濃度為1.5 g/L時(shí)細(xì)胞密度最高可達(dá)6×105個(gè)/mL[19]。本研究中采用的BYA培養(yǎng)基, 僅通過6 d的培養(yǎng)細(xì)胞密度就可達(dá)到6×105個(gè)/mL以上。而且研究發(fā)現(xiàn)在不同培養(yǎng)時(shí)期培養(yǎng)液中細(xì)胞類型存在巨大差異, 這可能與雨生紅球藻復(fù)雜生活史有關(guān)[11, 20]。本研究中雨生紅球藻BYA培養(yǎng)第3~6 d對(duì)數(shù)生長期時(shí), 主要是以綠色游動(dòng)細(xì)胞為主, 第7 d后, 綠色游動(dòng)細(xì)胞逐漸向不動(dòng)細(xì)胞階段轉(zhuǎn)變, 在培養(yǎng)9~12 d時(shí), 以綠色不動(dòng)細(xì)胞為主, 這可能是由于后期營養(yǎng)鹽濃度降低所導(dǎo)致。BYA中第7~9 d的后期培養(yǎng)中, 細(xì)胞生長緩慢, 這一過程中仍然保持較為緩慢的細(xì)胞個(gè)數(shù)增殖, 龍?jiān)傅萚18]認(rèn)為雨生紅球藻不動(dòng)細(xì)胞雖然呈現(xiàn)不游動(dòng)的靜止?fàn)顟B(tài), 但仍然能以較低的概率進(jìn)行無性的細(xì)胞增殖, 不動(dòng)細(xì)胞可以通過形成孢子囊或出芽等方式釋放游動(dòng)或不動(dòng)的子細(xì)胞。

離心是藻類分子生物學(xué)操作必不可少的環(huán)節(jié), 藤長英等[21]在進(jìn)行雨生紅球藻基因槍轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中以 4 000離心 8 min收集藻細(xì)胞; Gutierrez等[22]以 2700離心 10 min收集細(xì)胞用于葉綠體基因槍轉(zhuǎn)化; 盧水秀等[6]在雨生紅球藻電轉(zhuǎn)化研究中則以 1000離心 5 min收集藻細(xì)胞; Kathiresan等[8]在土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雨生紅球藻轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中以110離心 5 min收集細(xì)胞。這些離心條件的選擇性差異可能源于實(shí)驗(yàn)中雨生紅球藻細(xì)胞類型的不一致。本研究中發(fā)現(xiàn), 雨生紅球藻不動(dòng)細(xì)胞在100~200離心力下即可實(shí)現(xiàn)高效率的收集, 而游動(dòng)細(xì)胞則至少需要400~500的離心力條件。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn), 500~ 1000離心5 min足以滿足不同時(shí)期與不同類型雨生紅球藻細(xì)胞的收集, 其對(duì)細(xì)胞活力沒有明顯影響, 能夠滿足后期分子生物學(xué)研究的需要。

固體平板的藻落形成與培養(yǎng)是細(xì)胞轉(zhuǎn)化和篩選的最后一步。藻落形成效率的高低會(huì)直接影響轉(zhuǎn)化和篩選成功與否。文獻(xiàn)報(bào)道萊茵衣藻中淀粉粒包裹的方法被證明能夠有效的提高細(xì)胞藻落形成與篩選效率[23], 雙層瓊脂平板也被證明能夠有效的提高細(xì)胞的菌落形成效率[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn), 雙層瓊脂法能夠有效的提高雨生紅球藻的藻落形成效率, 但淀粉粒包裹法的效果并不明顯。以往的雨生紅球藻轉(zhuǎn)化研究中大部分并未報(bào)道所采用的細(xì)胞來源中的主要細(xì)胞類型, 僅有盧水秀等[6]和Kathiresan等[8]的報(bào)道中分別提到采用不動(dòng)期的細(xì)胞用于電轉(zhuǎn)化和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化研究, 而且都沒有對(duì)細(xì)胞在平板上的藻落形成效率對(duì)轉(zhuǎn)化過程的影響進(jìn)行過相關(guān)分析。本研究發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期細(xì)胞在雙層瓊脂平板上的藻落形成效率有顯著差異。培養(yǎng)4 d獲得的細(xì)胞大部分維持在游動(dòng)細(xì)胞階段, 比培養(yǎng)8 d和12 d后大部分處于不動(dòng)細(xì)胞階段的細(xì)胞有更高的藻落形成效率。

TAP培養(yǎng)基是一種較常用于萊茵衣藻培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基, 盧水秀等[6]和Sharon-Gojman等[9]分別在雨生紅球藻的電轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化中均采用TAP平板篩選克隆子; Kathiresan等[8]在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中采用TAP進(jìn)行細(xì)胞的菌藻共生培養(yǎng)。然而本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn), 無論雨生紅球藻的游動(dòng)細(xì)胞或不動(dòng)細(xì)胞, 它們?cè)赥AP平板的藻落形成效率都明顯較低, 其細(xì)胞藻落形成效率最高僅為21.67%, 而在8P-BG11,3N-BBM和BYA三種培養(yǎng)基中藻落形成效率最高均超過50%。表3中對(duì)比了四種培養(yǎng)基的主要成分與組成, TAP中的氮磷含量略低, 分別為7.5 mmol/L和1.13 mmol/L。Borowitzka等[26]的研究認(rèn)為, 雨生紅球藻適宜的氮磷濃度分別為4.95~9.89 mmol/L和0.57 mmol/L, TAP中的氮磷含量完全可以滿足雨生紅球藻生長的需要。但所不同的是TAP中的氮源完全是以銨根離子形式提供, Borowitzka等[26]認(rèn)為雨生紅球藻最適宜的氮源形式為硝酸鹽, 因此, 氮源的形式有可能是導(dǎo)致TAP平板藻落形成效率低的主要原因。同時(shí), 研究發(fā)現(xiàn)兩種兼養(yǎng)型培養(yǎng)基TAP和BYA中, 由于乙酸鹽的存在大大促進(jìn)了藻細(xì)胞的生長速度, 其藻落往往僅需培養(yǎng)1~2周即可出現(xiàn), 而純自養(yǎng)型培養(yǎng)基8P-BG11和3N-BBM需要經(jīng)過約4周的培養(yǎng)才能獲得較明顯的藻落。而且BYA培養(yǎng)基中, 酵母提取物作為一種豐富有機(jī)營養(yǎng)源, 滿足了異養(yǎng)生長所需的其他類型營養(yǎng), 在快速獲得藻落的同時(shí)大大提高了平板藻落形成效率, 因此更適合應(yīng)用于雨生紅球藻的轉(zhuǎn)化克隆篩選。

表3 四種培養(yǎng)基(8P-BG11, TAP, BYA and 3N-BBM)中主要營養(yǎng)元素含量對(duì)比

4 結(jié)論

綜上所述, 本研究結(jié)果表明: (1)雨生紅球藻在不同的培養(yǎng)時(shí)期具有不同的細(xì)胞類型; (2)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞比不動(dòng)細(xì)胞離心收集時(shí)需要更高的離心力, 但500~1000離心5 min完全可以適用于兩種類型細(xì)胞的收集; (3)相比于傳統(tǒng)的直接涂布法, 雙層瓊脂平板法能有效地提高雨生紅球藻細(xì)胞平板藻落形成效率; (4)雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞藻落形成效率顯著高于不動(dòng)細(xì)胞, BYA培養(yǎng)基可能更適合用于雨生紅球藻的平板藻落形成以及轉(zhuǎn)化后的篩選。

[1] Kamath B S, Srikanta B M, Dharmesh S M, et al. Ulcer preventive and antioxidative properties of astaxanthin from[J]European Journal of Pharmacology, 2008, 590 (1-3): 387-395.

[2] Domínguez-Bocanegra A R, Ponce-Noyola T, Torres- Mu?o J A. Astaxanthin production byand: a comparative study[J]Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 75(4): 783-791.

[3] Boussiba S. Carotenogenesis in the green alga: cellular physiology and stress response[J]Physiologia Plantarum, 2000, 108(2): 111-117.

[4] 葉濤, 王明茲, 黃建忠, 等. 雨生紅球藻原生質(zhì)體制備與再生育種[J]福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2011, 27(4): 122-126.Ye Tao, Wang Mingzi, Huang Jianzhong, et al. Preparation and regeneration breeding of protoplasts from[J]. Journal of Fujian Normal University (Natural Science Edition), 2011, 27(4): 122-126.

[5] 王娜, 林祥志, 馬瑞娟, 等. IPP異構(gòu)酶基因遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)雨生紅球藻()蝦青素含量的影響[J]海洋與湖沼, 2013, 44(4): 1033-1041. Wang Na, Lin Xiangzhi, Ma Ruijuan, et al. The effects of genetic transformation of isopentenyl diphosphate isomerase gene on the astaxanthin content of[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2013, 44(4): 1033-1041.

[6] 盧水秀, 陳谷和魏東. 電擊條件對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞存活率的影響[J]現(xiàn)代食品科技, 2010, 26(6): 554-557.Lu Shuixiu, Chen Gu, Wei Dong. Effect of electroporation conditions on cell viability of[J]. Mordern Food Science & Technology, 2010, 26(6): 554-557.

[7] Steinbrenner J and Sandmann G. Transformation of the green algawith a phytoene desaturase for accelerated astaxanthin biosynthesis[J]Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(12): 7477-7484.

[8] Kathiresan S, Chandrashekar A, Ravishankar G A, et al.-mediated transformation in the green alga(Chlorophyceae, Volvocales)[J]Journal of Phycology, 2009, 45(3): 642-649.

[9] Sharon-Gojman R., Maimon E, Leu S, et al. Advanced methods for genetic engineering of(Chlorophyceae, Volvocales)[J]Algal Research, 2015, 10: 8-15.

[10] 王潮崗, 胡章立. 萊茵衣藻細(xì)胞核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)研究進(jìn)展[J]仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 18(2): 59-64.Wang Chaogang, Hu Zhangli. The research advance in nuclear transformation system of[J]. Journal of Zhongkai University of Agriculture and Technology, 2005, 18(2): 59-64.

[11] 劉建國, 殷明焱. 雨生紅球藻的細(xì)胞周期初探[J]海洋與湖沼, 2000, 31(2): 145-150. Liu Jianguo, Yin Mingyan. Studies of cell cycle in[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2000, 31(2): 145-150.

[12] Stainier R Y, Kunisawa R, Mandel M, et al. Purification and properties of unicellular(order Chroococcales)[J]. Bacteriol Reviews, 1971, 35(2): 171-205.

[13] 張丹, 朱曉艷, 溫小斌, 等. 微藻培養(yǎng)基平衡pH的研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2014, 38(3): 401-406. Zhang Dan, Zhu Xiaoyan, Wen Xiaobin, et al. Studies on equilibrium pH values of microalgal medium[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2014, 38(3): 401-406.

[14] Melis A, Zhang L, Forestier M, et al. Sustained photobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green algae[J]. Plant Physiology , 2000, 122(1) : 127-135 .

[15] Tjahjono A E, Kakizono T, Hayama Y, et al. Formation and regeneration of protoplast from a unicellular green alga[J]Journal of Fermentation and Bioengineering, 1993, 75(3): 196-200.

[16] 徐曉瑩, 程天佑, 陳林, 等. 兩種培養(yǎng)基間雨生紅球藻細(xì)胞生長分化差異及磷的作用[J]過程工程學(xué)報(bào), 2016, 16(6): 86-94. Xu Xiaoying, Cheng Tianyou, Chen Lin, et al. Effects of phosphorus oncell propagation and differentiation in two medium[J]. The Chinese Journal of Process Engineering, 2016, 16(6): 86-94.

[17] Widholm J M. The Use of fluorescein diacetate and phenosafranine for determining viability of cultured plant cells[J]Stain Technology, 1972, 47(4): 189-194.

[18] 龍?jiān)? 劉建國, 張立濤. 兼養(yǎng)對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞生長的促進(jìn)作用及藻株差異性[J]. 海洋科學(xué), 2014, 38(12): 1-7.Long Yuanru, Liu Jianguo, Zhang Litao. The cell growth enhancement and difference of 4 strains ofunder mixotrophic culture mode[J]. Marine Sciences, 2014, 38(12): 1-7.

[19] 莊惠如, 陳必鏈, 王明茲, 等.雨生紅球藻混合營養(yǎng)與異養(yǎng)培養(yǎng)研究[J]微生物學(xué)通報(bào), 2000, 27(3): 198-201.Zhuang Huiru, Chen Bilian, Wang Mingzi, et al. Mixotrophicand heterotrophic growth of[J]. Microbiology, 2000, 27(3): 198-201.

[20] Elliott A M. Morphology and life history of[J]. Archiv fur Protistenkunde, 1934, 82: 250-272.

[21] Teng C Y, Qin S, Liu J G, et al. Transient expression of lacZ in bombarded unicellular green alga[J]Journal of Applied Phycology, 2002, 14(6): 497-500.

[22] Gutierrez C L, Gimpel J, Escobar C, et al. Chloroplast genetic tool for the green microalgae(Chlorophyceae, Volvocales)[J]Journal of Phycology, 2012, 48(4): 976-983.

[23] Shimogawara K, Fujiwara S, Grossman A, et al. High- efficiency transformation ofby electroporation[J]Genetics, 1998, 148(4): 1821-1828.

[24] 蘇雄, 汪夢(mèng)萍. 用雙層平板和雙溫培養(yǎng)法分離支氣管敗血波氏桿菌[J]華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1994, 13(5): 487-491. Su Xiong, Wang Mengping. Isolation ofwith a double-layered plate at two different temperatures[J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 1994, 13(5): 487-491.

[25] 王世梅, 周立祥. 提高氧化亞鐵硫桿菌和氧化硫硫桿菌平板檢出率的方法: 雙層平板法[J]環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 25(10): 1418-1420.Wang Shimei, Zhou Lixiang. A renovated approach for increasing colony count efficiency ofand: double-layer plates[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2005, 25(10): 1418-1420.

[26] Borowitzka M A, Huisman J M, Osborn A. Culture of the Astaxanthin-Producing Green-alga: effects of nutrients on growth and cell type[J]. Journal of Applied Phycology, 1991, 3(4): 295-304.

(本文編輯: 梁德海)

Effect of morphological shift on phycocolony forming in

CHENG Tian-you1, 2, XU Xiao-ying1, 2, ZHANG Wen-lei1, ZHANG Wei1, CHEN Lin1, YUAN Guan-hua1, 2, LIU Tian-zhong1

(1. Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Difference in cell collection and phycocolony forming between motile and non-motile cells ofwas studied considering the morphological shift under mixotrophic conditions. The results showed that motile and non-motile cells could be enriched separately after 4~6 days and 9~12 days, respectively, through mixotrophic cultivation in BYA. Although a greater centrifugal force was required for motile cell collection, motile and non-motile cells could both be collected by centrifugation at 500~1000for 5 min without obvious negative effects on the cell viability. Furthermore, the plate data indicated that the phycocolony forming rate ofcould be significantly improved using double layer of the apical low melting point agarose in comparison with that using traditional direct coating, and the phycocolony forming rate of motile cells was significantly higher than that of non-motile cells. Besides, the phycocolony forming rate in TAP was lower than that in the other three mediums, indicating that TAP was not suitable for the screening of, and the growth rate of colonies in BG11 and BBM was significantly lower than that in TAP and BYA. Above results indicated that BYA is more suitable for phycocolony formation and the screening ofconsidering the high phycocolony forming rate and rapid growth.

; motile cell; non-motile cell; morphological shift; phycocolony forming

[2016 Sino-Thai Cooperation Project from the National Science Foundation of China (Grant No. 51561145015)]

Dec. 5, 2016

Q945.1

A

1000-3096(2017)08-0001-08

10.11759/hykx 20161109002

2016-12-05;

2017-03-22

國家自然科學(xué)基金中泰合作研究基金資助項(xiàng)目(51561145015)

程天佑(1991-), 男, 湖北咸寧人, 碩士研究生, 研究方向?yàn)槲⒃迳锛夹g(shù), 電話: 0532-80662737, E-mail: chengty@qibebt.ac.cn; 張維,通信作者, 男, 湖北襄陽人, 副研究員, 博士, 主要從事經(jīng)濟(jì)微藻的應(yīng)用基礎(chǔ)與藻類分子遺傳學(xué), 電話: 0532-80662737, E-mail: zhangwei@qibebt.ac.cn