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    相關(guān)炎性因子在脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清和結(jié)腸組織的動(dòng)態(tài)表達(dá)

    2017-12-27 06:30:32何蘭娟朱向東王燕郭婷婷王迪
    關(guān)鍵詞:腎陽(yáng)虛潰瘍性結(jié)腸炎

    何蘭娟,朱向東,王燕,郭婷婷,王迪

    甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000

    相關(guān)炎性因子在脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清和結(jié)腸組織的動(dòng)態(tài)表達(dá)

    何蘭娟,朱向東,王燕,郭婷婷,王迪

    甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000

    目的 觀察脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清及結(jié)腸組織白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-4、干擾素-γ(IFN-γ)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)表達(dá)水平的變化,探討其在脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。方法 采用復(fù)合方法建立脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。75只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型3 d組、模型7 d組、模型14 d組和模型21 d組,ELISA檢測(cè)各組大鼠血清和結(jié)腸組織IL-1β、IL-4、IFN-γ及TGF-β1的含量。結(jié)果 與空白組比較,各模型組大鼠IL-1β、IFN-γ含量明顯升高,IL-4、TGF-β1含量明顯降低(P<0.05,P<0.01),其中模型7 d組最為明顯(P<0.01)。結(jié)論 促炎因子IL-1β、IFN-γ和抑炎因子IL-4、TGF-β1在脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

    潰瘍性結(jié)腸炎;脾腎陽(yáng)虛;白細(xì)胞介素-1β;白細(xì)胞介素-4;干擾素-γ;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;大鼠

    潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種反復(fù)發(fā)作的炎性腸病,其發(fā)病機(jī)制尚不明確。有學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞因子失衡是發(fā)生UC的關(guān)鍵環(huán)節(jié),且目前抑炎和促炎因子的失衡機(jī)制越來(lái)越受到重視[1]。余瑩等[2]研究發(fā)現(xiàn),UC患者大多伴有食欲減退、腰酸背痛、畏寒肢冷等脾腎陽(yáng)虛的癥狀。曹燕飛等[3]通過(guò)文獻(xiàn)檢索對(duì)UC中醫(yī)證候分布進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)脾腎陽(yáng)虛型位居第2,提示脾腎陽(yáng)虛為UC常見(jiàn)證型。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA檢測(cè)促炎因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、干擾素-γ(IFN-γ)和抑炎因子IL-4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)在脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠血清和結(jié)腸組織的動(dòng)態(tài)變化,探討其在脾腎陽(yáng)虛型UC發(fā)病中的作用。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 動(dòng)物

    SPF級(jí)Wistar大鼠75只,體質(zhì)量(180±20)g,雌雄各半,甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物合格證號(hào)SYXK(甘)2001-0001。飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

    1.2 藥物及制備

    番瀉葉,購(gòu)自蘭州惠仁堂藥店,100 ℃蒸餾水浸泡30 min,過(guò)濾,乙醇濃縮為1 g/mL(即100%濃度),置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫粴浠傻乃勺⑸湟?,天津藥業(yè)焦作有限公司,批號(hào)11080411。

    1.3 主要試劑與儀器

    2,4,6-TNBS(批號(hào)2508-19-2),Sigma公司;大鼠IL-1β(批號(hào)12-3012-096)、IFN-γ(批號(hào)12-3000-096)、IL-4(批號(hào)12-3040-096)、TGF-β1(批號(hào)12-3710-096)ELISA檢測(cè)試劑盒,深圳達(dá)科為公司。iMark酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 分組與造模

    實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,待其體質(zhì)量達(dá)到(180±20)g,按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型3 d組、模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組,每組15只。大鼠脾腎陽(yáng)虛型UC模型采用“病-證”結(jié)合方法造模[4-5]。除空白組外,其余4組每日予10 mL/kg 100%濃度番瀉葉灌胃、15 mg/kg氫化可的松注射液腹腔注射,空白組予10 mL/kg蒸餾水灌胃、等體積生理鹽水腹腔注射,連續(xù)21 d。21 d后,禁食24 h,乙醚麻醉,取12 cm聚丙烯管,插入肛門(mén)8 cm達(dá)結(jié)腸部位,快速注入TNBS/乙醇溶液(100 mg/kg),再注入約0.4 mL空氣,捏緊肛門(mén),提取大鼠尾巴保持倒立1 min,防注入液倒流,并使藥液與結(jié)腸充分接觸,待麻醉清醒后正常喂養(yǎng)。

    2.2 標(biāo)本采集及處理

    分別于造模3、7、14、21 d處死相應(yīng)模型組大鼠并取材。將大鼠乙醚麻醉固定,股動(dòng)脈取血,室溫靜置20 min,3000 r/min離心15 min,取上層血清,用于檢測(cè)血清細(xì)胞因子IL-1β、IFN-γ、IL-4、TGF-β1含量。之后將大鼠脫頸處死,剖取病變最嚴(yán)重處結(jié)腸,生理鹽水清洗,加9倍量生理鹽水勻漿,12 000 r/min離心10 min,取上清液待測(cè)。

    2.3 結(jié)腸損傷評(píng)分

    參照文獻(xiàn)[6]肉眼評(píng)分。0分:無(wú)潰瘍、充血;1分:局部充血,無(wú)潰瘍;2分:1處潰瘍不伴充血或腸壁增厚;3分:1處潰瘍伴炎癥;4分:>2處潰瘍伴炎癥;5分:>2處潰瘍和/或炎癥>1 cm;6~8分:潰瘍和/或炎癥>2 cm,病變范圍每增加1 cm則計(jì)分增加1分。

    2.4 指標(biāo)檢測(cè)

    ELISA檢測(cè)大鼠血清和結(jié)腸組織IL-1β、IFN-γ、IL-4、TGFβ-1含量,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    4 結(jié)果

    4.1 一般狀況

    造模后第1日出現(xiàn)懶動(dòng)、扎推,飲食減少及稀便;3 d后反應(yīng)遲鈍,體質(zhì)量開(kāi)始下降,大便量多質(zhì)稀,部分有黏液便和膿血便出現(xiàn);7 d后飲食明顯低于正常,體質(zhì)量明顯下降,皮毛污穢無(wú)光澤,肛周污穢,捕捉時(shí)抵抗力減弱,有黏液便或膿血便出現(xiàn);14 d后活動(dòng)開(kāi)始恢復(fù)正常,但仍有稀便;21 d后大鼠毛色稍晦黯,反應(yīng)較靈活,精神活動(dòng)尚可,飲食逐漸恢復(fù),時(shí)有稀便。

    4.2 各組大鼠結(jié)腸損傷肉眼觀察結(jié)果

    空白組腸道無(wú)增厚粘連,腸黏膜光滑,腸皺襞紋理清晰,未見(jiàn)充血、水腫、糜爛、潰瘍等情況;模型3 d組腸壁明顯充血、水腫、增厚,有潰瘍面形成;模型7 d組腸道粘連嚴(yán)重,腸黏膜壞死、呈黑褐色,部分可見(jiàn)腸脹氣;模型14 d組潰瘍面開(kāi)始愈合,但部分仍有粘連;模型21 d組潰瘍面明顯縮小,部分可見(jiàn)愈合瘢痕;與空白組比較,各模型組結(jié)腸均有明顯損傷(P<0.01);與模型7 d組比較,模型21 d組結(jié)腸損傷明顯恢復(fù)(P<0.01)。評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 各組大鼠結(jié)腸損傷肉眼評(píng)分比較(±s,分)

    表1 各組大鼠結(jié)腸損傷肉眼評(píng)分比較(±s,分)

    注:與空白組比較,**P<0.01;與模型7 d組比較,##P<0.01

    組別 只數(shù) 結(jié)腸損傷評(píng)分空白組 15 0.33±0.49模型3 d組 15 4.07±1.75**模型7 d組 15 5.47±1.19**模型14 d組 15 2.67±1.29**模型21 d組 15 2.27±1.03**##

    4.3 各組大鼠結(jié)腸組織和血清白細(xì)胞介素-1β的動(dòng)態(tài)表達(dá)

    與空白組比較,各模型組大鼠結(jié)腸組織和血清IL-1β明顯升高(P<0.05,P<0.01);與模型7 d組比較,模型21 d組IL-1β明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

    4.4 各組大鼠結(jié)腸組織和血清干擾素-γ的動(dòng)態(tài)表達(dá)

    與空白組比較,各模型組大鼠結(jié)腸組織和血清IFN-γ明顯升高(P<0.05,P<0.01),其中模型7 d組最為明顯(P<0.05,P<0.01);與模型7 d組比較,模型21 d組IFN-γ明顯降低(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表3。

    表2 各組大鼠結(jié)腸組織和血清IL-1β含量比較(±s,pg/mL)

    表2 各組大鼠結(jié)腸組織和血清IL-1β含量比較(±s,pg/mL)

    注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型7 d組比較,#P<0.05

    組別 只數(shù) 結(jié)腸組織 血清空白組 8 11.75±5.68 8.13±4.32模型3 d組 8 19.88±5.48*15.13±3.43**模型7 d組 8 26.47±6.20**19.69±4.46**模型14 d組 8 18.72±8.92*16.04±4.82**模型21 d組 8 19.11±5.09*#12.99±5.96*#

    表3 各組大鼠結(jié)腸組織和血清IFN-γ含量比較(±s,pg/mL)

    表3 各組大鼠結(jié)腸組織和血清IFN-γ含量比較(±s,pg/mL)

    注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型7 d組比較,##P<0.01

    組別 只數(shù) 結(jié)腸組織 血清空白組 8 41.98± 4.71 68.00± 8.61模型3 d組 8 69.66±11.14*77.75± 8.28*模型7 d組 8 75.42±10.16*93.00±14.50**模型14 d組 8 65.78± 8.99*81.56± 4.28**模型21 d組 8 54.48± 8.37*##78.38± 9.36*##

    4.5 各組大鼠結(jié)腸組織和血清白細(xì)胞介素-4的動(dòng)態(tài)表達(dá)

    與空白組比較,各模型組大鼠結(jié)腸組織和血清IL-4明顯降低(P<0.05,P<0.01);與模型7 d組比較,模型21 d組IL-4明顯升高(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 各組大鼠結(jié)腸組織和血清IL-4含量比較(±s,pg/mL)

    表4 各組大鼠結(jié)腸組織和血清IL-4含量比較(±s,pg/mL)

    注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型7 d組比較,#P<0.05,##P<0.01

    組別 只數(shù) 結(jié)腸組織 血清空白組 8 50.67±6.34 72.53±26.01模型3 d組 8 36.37±4.57*21.99± 8.22**模型7 d組 8 27.77±6.70**21.65± 7.14**模型14 d組 8 39.39±7.47*22.77± 6.13**模型21 d組 8 42.34±3.69*##31.15± 7.62**#

    4.6 各組大鼠結(jié)腸組織和血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的動(dòng)態(tài)表達(dá)

    與空白組比較,各模型組大鼠結(jié)腸組織和血清TGF-β1明顯降低(P<0.01);與模型7 d組比較,模型21 d組明顯升高(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表5。

    表5 各組大鼠結(jié)腸組織和血清TGF-β1含量比較(s,pg/mL)

    表5 各組大鼠結(jié)腸組織和血清TGF-β1含量比較(s,pg/mL)

    注:與空白組比較,**P<0.01;與模型7 d組比較,#P<0.05,##P<0.01

    組別 只數(shù) 結(jié)腸組織 血清空白組 8 72.50± 8.32 384.59±33.09模型3 d組 8 56.38±10.31**290.61±15.45**模型7 d組 8 34.75± 9.75**238.26±26.42**模型14 d組 8 52.75± 8.22**257.05±31.36**模型21 d組 8 52.38± 9.41**##320.15±49.18**#

    5 討論

    目前學(xué)者多認(rèn)為UC發(fā)生的主要機(jī)制是腸道黏膜免疫系統(tǒng)功能紊亂[7],而促炎因子和抑炎因子平衡則是腸道黏膜免疫系統(tǒng)平衡的前提。細(xì)胞因子作為細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)分子,與靶細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合,從而在機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]。Asadullah K等[9]研究表明,IL-1β、IFN-γ、IL-4、TGF-β1等因子在UC的炎癥反應(yīng)中起著重要作用。

    IL-1β又名前炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子,它能活化CD4+T細(xì)胞,促進(jìn)B細(xì)胞生長(zhǎng)、活化以及IL-2R表達(dá),引起炎癥介質(zhì)的釋放[10]。它還能通過(guò)自分泌或旁分泌促進(jìn)其下游細(xì)胞因子的表達(dá)和產(chǎn)生,并與其協(xié)同作用,使免疫上調(diào)和促進(jìn)炎癥活性,從而引起一系列的腸道炎癥和腸黏膜損傷。IL-1β還通過(guò)促進(jìn)白細(xì)胞黏附分子的表達(dá),趨化中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞進(jìn)入腸道病變部位,引發(fā)一系列腸組織破壞和腸道炎癥反應(yīng)[11]。殷明霞等[12]研究發(fā)現(xiàn),IL-1β在脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠血清中的水平隨著炎癥的發(fā)展而逐漸升高,姬培震等[13]研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

    IL-4是由Th2細(xì)胞分泌的抑炎因子,有研究表明,其在UC中明顯減少[14]。它能刺激B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的增殖,抑制巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生和移動(dòng),從而抑制IL-1的促炎作用[15]。正常狀態(tài)下,人體腸黏膜分泌的IL-4與IL-1β維持動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)受到病原刺激后,這種平衡被打破,則發(fā)生腸道炎癥。因此,IL-4和IL-1β在抑制腸道炎癥和維持腸道免疫平衡中起關(guān)鍵作用。余瑩等[2]和鄒君君等[16]臨床研究發(fā)現(xiàn),IL-4含量在脾腎陽(yáng)虛型UC患者呈下降趨勢(shì)。

    IFN-γ是一種二聚體糖蛋白,由Th1淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生,可使Th1細(xì)胞擴(kuò)增、活性增強(qiáng),抑制Th2細(xì)胞增生,是IL-4的拮抗因子[14]。它具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性,是強(qiáng)有力的吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞激活物,能加重腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡和腸道炎癥等,在UC發(fā)病過(guò)程中產(chǎn)生了重要的作用[17]。殷明霞等[12]通過(guò)脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠模型分析發(fā)現(xiàn),IFN-γ在模型組中明顯升高;鄒君君等[16]在臨床研究中也發(fā)現(xiàn)IFN-γ在脾腎陽(yáng)虛型UC患者血清中含量升高。

    TGF-β1通過(guò)下調(diào)過(guò)度的免疫反應(yīng)而抑制炎癥的發(fā)生與發(fā)展,且能促進(jìn)上皮的修復(fù)及血管再生。其還能通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞黏附和遷移,抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞凋亡[18]。作為公認(rèn)的抑炎因子,其水平的下降還有利于淋巴細(xì)胞的激活,從而促進(jìn)自身抗體和自身致敏T細(xì)胞的產(chǎn)生,發(fā)生自身免疫反應(yīng)[19]。這些因素均能減輕腸黏膜的炎癥反應(yīng)和損傷,從而促進(jìn)UC的恢復(fù)。王燕等[20]研究發(fā)現(xiàn),在脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠模型TGF-β1含量明顯低于正常組。

    本研究結(jié)果顯示,與空白組比較,各模型組IL-1β、IFN-γ明顯升高,IL-4、TGF-β1明顯降低,其表達(dá)規(guī)律與結(jié)腸的損傷程度一致,表明UC的產(chǎn)生可能是因?yàn)橐盅滓蜃雍痛傺滓蜃悠胶獾钠茐?;且在模? d組炎癥反應(yīng)最明顯,表明此時(shí)炎癥細(xì)胞因子失衡最明顯;而與模型7 d組比較,模型21 d組有所恢復(fù),說(shuō)明炎癥處于恢復(fù)階段,細(xì)胞因子逐漸趨于平衡,這與張歆等[21]的研究結(jié)論相一致,此時(shí)雖然機(jī)體自身處于自我修復(fù)狀態(tài),但防御能力很低,容易復(fù)發(fā),所以在此時(shí)用藥可以降低復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,我們認(rèn)為抑炎和促炎因子的失衡是UC發(fā)病的重要因素,調(diào)節(jié)免疫平衡是治療脾腎陽(yáng)虛型UC的重要思路之一。

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    [16] 鄒君君,朱瑩,張曉江,等.潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎的臨床療效及其對(duì)血清γ干擾素、白細(xì)胞介素-4的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2013,21(6):305-307.

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    [20] 王燕,何蘭娟,朱向東,等.四神丸對(duì)脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清TGFβ1、IL-6及結(jié)腸組織TLR-4mRNA表達(dá)的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào), 2015,43(5):118-122.

    [21] 張歆,柯曉,陳錦團(tuán),等.IL-1β、IL-4在濕熱證潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及意義[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2015,36(5):697-701.

    Dynamic Expression of IL-1β, IL-4, IFN-γ and TGFβ1 in Serum and Colon Tissue in Ratswith Ulcerative Colitis of Spleen-Kidney Yang Deficiency Type


    HE Lan-juan, ZHU Xiang-dong,

    WANG Yan, GUO Ting-ting, WANG Di (Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

    Objective To observe the change rules of expressions of IL-1β, IL-4, IFN-γ and TGF-β1 in serum and colon tissue in rats with ulcerative colitis of spleen-kidney yang deficiency type; To explore the action in the progress of ulcerative colitis of spleen-kidney yang deficiency type. Methods Composite method was used to establish rat models with ulcerative colitis of spleen-kidney yang deficiency type. 75 Wistar rats were randomly divided into blank group, model 3 d group, model 7 d group and model 21 d group. ELISA was used to test the levels of IL-1β, IL-4, IFN-γ and TGF-β1 in serum and colon tissue. Results Compared with the blank group, contents of IL-1β and IFN-γ in model group increased significantly (P<0.05, P<0.01), and the contents of IL-4 and TGF-β1 content decreased (P<0.05, P<0.01),especially in the model 7 d group (P<0.01). Conclusion The pro-inflammatory factor IL-1β, IFN-γ and anti-inflammatory factor IL-4 and TGF-β1 play an important role in rats with ulcerative colitis of spleen-kidney yang deficiency type.

    ulcerative colitis; spleen-kidney yang deficiency; IL-1β; IL-4; IFN-γ; TGF-β1; rats

    10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.015

    R228

    A

    1005-5304(2017)01-0059-04

    2015-11-23)

    2015-12-29;編輯:華強(qiáng))

    國(guó)家自然科學(xué)基金(81360541)

    朱向東,E-mail:zhuxiangdong33@163.com

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