不同有孢漢遜酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)威代爾冰葡萄酒香氣的影響

申靜云，劉沛通，段長青，燕國梁

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100083)

不同有孢漢遜酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)威代爾冰葡萄酒香氣的影響

申靜云，劉沛通，段長青，燕國梁*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100083)

為了研究菌株和接種方式對(duì)冰葡萄酒非揮發(fā)性產(chǎn)物和揮發(fā)性香氣成分的影響，選用2株自篩非釀酒酵母——仙人掌有孢漢遜酵母(Hanseniasporaopuntiae)和葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)，分別與商業(yè)釀酒酵母DV10混合發(fā)酵。結(jié)果表明：H.uvarum與DV10同時(shí)接種混合發(fā)酵可以顯著降低乙酸產(chǎn)量(降低26.90%)；H.opuntiae與DV10同時(shí)接種混合發(fā)酵促進(jìn)了酯類和萜烯類物質(zhì)的合成，總量分別增產(chǎn)88.61%和21.40%，其中乙酸苯乙酯含量提高14.60倍，β-大馬士酮增產(chǎn)8.85%。除此之外，感官品評(píng)結(jié)果顯示H.opuntiae與DV10混合發(fā)酵可顯著增強(qiáng)花果香和黃油味。綜合分析，認(rèn)為H.opuntiae更適合應(yīng)用于冰葡萄酒發(fā)酵，為冰酒混合發(fā)酵的進(jìn)一步研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

冰酒；非釀酒酵母；混合發(fā)酵；香氣；感官評(píng)價(jià)

冰葡萄酒的品質(zhì)主要取決于香氣的成分和濃度[1]，其香氣的主要來源有3個(gè)：葡萄果實(shí)的品種香氣，微生物代謝產(chǎn)生的發(fā)酵香氣以及陳釀香氣，其中發(fā)酵香氣最為重要[2]。發(fā)酵香氣的產(chǎn)生是多種酵母菌共同作用的結(jié)果，酵母菌的種類和數(shù)量直接決定了葡萄酒的香氣和口感[1]。

目前葡萄酒釀造多采用商業(yè)活性干酵母，缺乏具有產(chǎn)地特色的專用酵母，因此很多學(xué)者從產(chǎn)區(qū)葡萄的自然發(fā)酵過程中篩選出優(yōu)良的酵母菌株，用于釀造出具有本土特色的優(yōu)質(zhì)葡萄酒[3]。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，葡萄酒的自然發(fā)酵多是由非釀酒酵母(Non-Saccharomyceswine yeast)觸發(fā)的[4]，非釀酒酵母能夠提高酯類和高級(jí)醇類物質(zhì)的產(chǎn)量，具有高活性的糖苷酶，可增加葡萄酒的花果類香氣[5]，與釀酒酵母混合發(fā)酵能夠改善葡萄酒的感官品質(zhì)[6]。其中，德爾布有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)高滲條件下，低產(chǎn)乙酸和乙酸乙酯，高產(chǎn)甘油和苯乙醇[7]；克魯維酵母(Kluyveromyces)可以降低葡萄酒的酸度[8]；星型假絲酵母(Candidastella)能夠減少乙酸、乙醛等不良?xì)馕段镔|(zhì)的產(chǎn)生，提高酯類物質(zhì)的產(chǎn)量[9]；漢遜酵母屬(Hanseniaspora)可以分泌多種胞外酶(葡萄糖苷酶、木糖苷酶、蛋白酶)[10]，提高乙酸苯乙酯的含量，提升葡萄酒的香氣品質(zhì)。

目前針對(duì)非釀酒酵母的混合發(fā)酵對(duì)普通干型葡萄酒品質(zhì)影響的研究很多，但在冰酒中的研究有限。本文利用前期研究中篩選得到的2株非釀酒酵母：葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)和仙人掌有孢漢遜酵母(Hanseniasporaopuntiae)，分別與商業(yè)釀酒酵母DV10混合發(fā)酵(同時(shí)接種和順序接種)，探究了不同菌株和接種方式對(duì)威代爾冰葡萄酒組成成分的影響和呈香差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

冰葡萄汁：威代爾冰葡萄汁(遼寧省桓仁縣)，還原糖380 g/L，可滴定酸(以酒石酸計(jì))13.0 g/L，pH3.35。

菌株：葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum，HU14)，仙人掌有孢漢遜酵母(H.opuntiae，HO11)，由前期研究中從威代爾冰葡萄汁自然發(fā)酵篩選鑒定得到，保存于本實(shí)驗(yàn)室；釀酒酵母選用商業(yè)釀酒酵母DV10 (法國拉曼公司)。

1.2 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將酵母菌株接種于500 mL的YPD培養(yǎng)基(1.0%酵母浸提物，2.0%蛋白胨，2.0%葡萄糖)中進(jìn)行活化，搖床培養(yǎng)(28 ℃，180 r/min)至對(duì)數(shù)期，低溫(4 ℃)離心收集菌體，經(jīng)無菌水洗滌后接入葡萄汁中。非釀酒酵母和釀酒酵母的接種比例為9∶1[11]，即非釀酒酵母接種量約為107CFU/mL，釀酒酵母接種量約為106CFU/mL。發(fā)酵在500 mL搖瓶中進(jìn)行，每瓶裝有350 mL葡萄汁，共設(shè)立5個(gè)實(shí)驗(yàn)組(見表1)，每組重復(fù)3次，接種后以發(fā)酵栓液封瓶口，16 ℃恒溫靜置發(fā)酵。

發(fā)酵過程中定期取樣，通過測(cè)定樣品含糖量監(jiān)測(cè)發(fā)酵進(jìn)程。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到第35天時(shí)，加入80 mg/L的SO2終止發(fā)酵。隨后樣品低溫(4 ℃)離心后保留上清液(-20 ℃凍藏)，用于香氣化合物和其他代謝產(chǎn)物的測(cè)定。

表1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組Table 1 Fermentation experiment groups

注：圖中DV10表示商業(yè)酵母DV10單獨(dú)發(fā)酵；HO11/DV10(D0)表示HO11與DV10同時(shí)接種混合發(fā)酵；HO11/DV10(D4)表示HO11與DV10先后4天接種混合發(fā)酵；HU14/DV10(D0)表示HU14與DV10同時(shí)接種混合發(fā)酵；HU14/DV10(D4)表示HU14與DV10先后4天接種混合發(fā)酵，下同。

1.3 發(fā)酵主產(chǎn)物分析

發(fā)酵液過濾(PES，0.22 μm)后，采用高效液相色譜HPLC1200(Agilent Technologies, Inc. PaloAlto, CA)進(jìn)行發(fā)酵主產(chǎn)物分析。檢測(cè)參考VERWAAL等的方法[12]，離子交換色譜柱HPX-87H Aminex ion-exchange column (300 mm× 7.8 mm，美國Bio-Rad Laboratories)，流動(dòng)相為5 mmol/L的H2SO4溶液, 等度洗脫，流速0.6 mL/min。

葡萄糖、果糖、乙醇和甘油的測(cè)定使用示差折光檢測(cè)器(RID，refractive index detector，G1362A，美國Agilent公司)，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫45 ℃，分析時(shí)間30 min；有機(jī)酸(乙酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸和琥珀酸)的測(cè)定采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD，photodiode array detector，G1315D，美國Agilent公司)，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫60 ℃，分析時(shí)間30 min。

1.4 香氣化合物的檢測(cè)

利用本實(shí)驗(yàn)室已優(yōu)化的頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)方法測(cè)定[13]。在頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS，Agilent，USA)上進(jìn)行，選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS fiber(Supelco, Bellefonte, PA, USA)萃取。萃取前，萃取頭270 ℃老化1 h。將5 mL發(fā)酵樣品加入到15 mL樣品瓶中，同時(shí)加入1 g NaCl、10 μL內(nèi)標(biāo)(4-甲基-2-戊醇)后迅速用帶有聚四氟乙烯(PTFE)隔墊的樣品瓶蓋擰緊密封，在40 ℃恒溫條件下，180 r/min平衡30 min。樣品瓶中的氣-液相香氣物質(zhì)達(dá)到平衡后，將已活化或熱解析過的聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯(PDMS/CAR/DVB)萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，在40 ℃恒溫下攪拌萃取30 min，使樣品瓶中的香氣物質(zhì)達(dá)到氣-固和氣-液平衡。然后將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口，250 ℃熱解析8 min，不分流進(jìn)樣。

氣質(zhì)部分實(shí)驗(yàn)條件為：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀為 Agilent 6890N /5975B Inert MSD(美國 Agilent Technologies)，配置 PAL-SPME 自動(dòng)進(jìn)樣器(瑞士 CTC Analytics)。所用毛細(xì)管色譜柱為HP-INNOWAX 60 m×0.25 mm×0.25 μm(J &W Scientific, Folsom, CA, USA)。載氣為高純氦氣(純度 99.999%)，流速：1 mL/min。自動(dòng)進(jìn)樣。柱溫箱升溫程序：50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min的速度升溫至220 ℃，保持5 min，總運(yùn)行時(shí)間62.67 min。質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，電離方式為電子轟擊電離源(EI)，離子源能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍為20～350m/z。每個(gè)樣品做3個(gè)獨(dú)立重復(fù)。

香氣物質(zhì)的定性和定量分析：利用質(zhì)譜全離子掃描(Scan)圖譜，對(duì)于已有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)已建立的相同色譜條件下該化合物的保留時(shí)間、保留指數(shù)和質(zhì)譜信息進(jìn)行定性分析。沒有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)，利用文獻(xiàn)報(bào)道中相似色譜條件下該化合物的保留指數(shù)以及NIST 11標(biāo)準(zhǔn)譜庫(NIST Chemistry WebBook. http://webbook.nist.gov/chemistry/)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定性分析；文獻(xiàn)中未報(bào)道相似色譜條件下化合物保留指數(shù)的香氣物質(zhì)，則根據(jù)NIST 11標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定性分析。對(duì)于已有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)，制作其在模擬酒溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量；沒有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)，利用與其化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、官能團(tuán)類似、碳原子數(shù)相近的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行半定量。同時(shí)為了評(píng)價(jià)各香氣化合物對(duì)總香氣的貢獻(xiàn)，通過香氣濃度除以香氣閾值來計(jì)算各香氣化合物的香氣值。

1.5 糖苷酶活性的測(cè)定

根據(jù)CAPECE等人的方法進(jìn)行半定量測(cè)定[10]：以纖維二糖為唯一碳源配制培養(yǎng)基?；罨蟮木杲尤氲綗o碳源YNB液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)6 h(30 ℃，180 r/min)除去活化液中的殘?zhí)恰Ｈ∩鲜鼍和坎加赮NB-cel平板(0.67%YNB, 0.5%纖維二糖, 2%瓊脂)，30 ℃培養(yǎng)24～48 h。通過觀察YNB-cel平板上菌株的生長情況判斷其糖苷酶活性的高低，菌落越大，數(shù)目越多表征其糖苷酶活性越高，反之則越低。

1.6 感官品評(píng)

品評(píng)試驗(yàn)共3輪，用1-5數(shù)字對(duì)酒樣依次標(biāo)記，每輪以不同順序分發(fā)給品評(píng)者(13位經(jīng)專業(yè)品評(píng)培訓(xùn)人員)盲品，對(duì)酒樣進(jìn)行描述性評(píng)價(jià)，并按照強(qiáng)度等級(jí)(1-10級(jí))對(duì)特征香氣進(jìn)行強(qiáng)度打分。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析和作圖

采用SPSS 24.0(IBM公司)進(jìn)行主成分分析(PCA)和單因素方差分析(ANOVA,p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵主產(chǎn)物分析

混合發(fā)酵不僅會(huì)影響發(fā)酵進(jìn)程，還會(huì)進(jìn)一步影響葡萄汁發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的組成和含量。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了各酒樣中發(fā)酵主產(chǎn)物，包括乙醇、甘油和6種重要的有機(jī)酸，結(jié)果如表2所示。

表2 酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵主產(chǎn)物Table 2 Primary fermentation products in wine at the end of alcoholic fermentation

注：表中數(shù)據(jù)(平均值±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差)：利用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)(Independent-Sample T Test)進(jìn)行顯著性方差分析，同一化合物含量后所標(biāo)識(shí)不同的字母表示不同樣本之間存在顯著性差異(p<0.05)。

由表2可知，各樣品的酒精度、草酸、檸檬酸和乳酸的含量并無顯著差異。HO11與商業(yè)DV10混合發(fā)酵時(shí)，蘋果酸和琥珀酸的產(chǎn)量均顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組，其中順序接種時(shí)產(chǎn)量最高。過高含量的乙酸(> 2.10 g/L)會(huì)產(chǎn)生不良?xì)馕叮档捅频钠焚|(zhì)[14]，有研究表明漢遜酵母屬與釀酒酵母混合發(fā)酵能夠減少乙酸的生成[15]，本實(shí)驗(yàn)中混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組的乙酸產(chǎn)量均顯著低于商業(yè)DV10，證明了混合發(fā)酵的合理應(yīng)用確實(shí)可以有效控制葡萄酒中乙酸的含量，其中HO11與商業(yè)DV10同時(shí)接種時(shí)降酸效果最為突出，約降低28.4%，其他依次為HU14/DV10(D4)、HO11/DV10(D4)、HO11/DV10(D0)、DV10。

2.2 香氣化合物

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了酒精發(fā)酵結(jié)束后各樣品的香氣組分，共檢出57 種香氣物質(zhì)，包括醇類物質(zhì)18種，酯類物質(zhì)18種，醛酸類物質(zhì)7種，C13降異戊二烯以及萜烯類化合物10種，其他化合物4種，見表3。

表3 威代爾冰葡萄酒香氣物質(zhì)、定量信息、標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和閾值Table 3 Volatile compounds identified in this work and their aroma parameters

續(xù)表3

香氣物質(zhì)RI(a)ID(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線R2(c)線性范圍閾值/(μg·L-1)香氣描述乳酸乙酯1350Ay=4 65x+1 730 98912 12～200000 12水果香，奶油味水楊酸乙酯1826By=34 44x+21 470 9930 30～4352 21苯乙酸乙酯1785Ay=14 91x+2 230 9960 84～432 00250花香，果香月桂酸乙酯1848Ay=31 63x-68 690 9920 65～2665 001500花果香，奶香丁二酸二乙酯1682Ay=1323 67x+162 930 9965 11～20940 001200葡萄香氣辛酸異戊酯1659By=8 11x+0 020 9900 02～324 00125水果味，奶油味水楊酸甲酯1792Ay=83 05x+3 610 9880 47～121 00己酸異戊酯1458Ay=15 16x-3 590 9990 61～1250 00高級(jí)醇類物質(zhì)異丁醇1100Ay=61345 90x+6448 640 99982 59～338300 0040000生青味異戊醇1215Ay=8612 26x+2378 550 98965 12～267080 0030000指甲油味1?戊醇1256Ay=57 69x-0 270 9990 07～1150 0064000雜醇味，面包香1?己醇1358Ay=781 77x+35 690 9941 23～20210 008000果香，青香1?庚醇1455Ay=0 04x+0 020 9840 17～351 00脂肪味1?辛醇1400Ay=286 21x+0 400 9950 11～1650 0040脂肪味2?辛醇1417Ay=110 69x+0 950 9890 18～304 003?辛醇1392Ay=0 03x+0 010 9810 03～608 002?壬醇1517Ay=48 14x-0 470 9970 06～1000 001?癸醇1765Ay=25 50x-1 220 9980 05～860 00400花果香十二醇1974Ay=113 79x-12 880 9920 15～645 00苯甲醇1892Ay=5010 36x-7 320 9830 71～2930 00烘烤味，果香2?苯乙醇1903Ay=2466 51x-38 290 9964 95～82100 0010000玫瑰味，蜂蜜味1?辛烯?3?醇1456Ay=232 29x-2 820 9870 11～1650 0120蘑菇味，青香(E)?2?辛烯?1?醇1614By=340 90x+0 600 9980 16～668 003?己烯?1?醇1346Ay=600 90x+3 110 9890 22～912 00200青草香(Z)?3?己烯?1?醇1361Ay=5042 20x+49 180 9898 15～2087 50200青草香2，3?丁二醇1542Ay=90927 61x+3457 840 99764 52～264300 00150000奶油味，果香醛酸類物質(zhì)己酸1860Ay=9361 39x-6 390 9950 87～14360 003000脂肪味，奶酪味辛酸2060Ay=2881 32x+157 500 9921 15～4730 00500腐臭味壬酸Ay=406 04x+15 620 9876 50～832 00癸酸2292Ay=10048 34x-12 640 99635 85～4590 0015000脂肪味苯甲醛1534Ay=937 10x-196 880 9964 90～20100 00300苦杏仁等堅(jiān)果味苯乙醛1561Ay=2799 73x-605 960 9842 61～21350 001花香，蜜香壬醛1394Ay=128 13x-12 970 9820 05～227 5015生青味降異戊=烯及萜烯類物質(zhì)β?大馬士酮1802By=2522 59x+19 590 9845 07～162 5 0 05花香，水果味里那醇1530Ay=46 57x-3 590 9920 04～179 0015花香4?萜品醇1600Ay=201 40x-0 640 9900 12～260 00250百合花香，木香反式?玫瑰醚1360Ay=18 05x+0 210 9943 06～196 000 2花香，荔枝味乙偶姻1298Ay=-528 44x+4 250 9898 95～36680 00150000脂肪味，奶油味α?萜品醇1703Ay=13 58x+0 450 9900 03～122 00250紫丁香，蜜桃味橙花醇1805Ay=4869 38x-26 060 98010 40～5352 001000花香，甜木香β?香茅醇1770Ay=7 66x+14 200 9870 46～236 00玫瑰花香萜品油烯1290Ay=11 30x+6 690 9970 05～240 00松木香香葉醇1855Ay=11167 97x+348 480 9871 15～4575 7520檸檬味其他化合物3?甲硫基丙醇1726By=21131 67x+17 540 9958 75～560 001000脂肪味傘花烴1263By=6 44x+3 670 9900 05～210 00苯乙烯1271Ay=33 76x-4 600 9980 25～1022 00萘1756By=240 71x-271 840 9880 03～121 00

注：a)：RI 表示該物質(zhì)在HP-innowax毛細(xì)管柱上的保留指數(shù);b)：化合物的定性方式，A 表示由標(biāo)樣進(jìn)行定性，B 表示由RI和NIST譜庫比對(duì)進(jìn)行定性;c)：標(biāo)線中x和y的回歸系數(shù)。

圖1為混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)酒樣的4大類香氣物質(zhì)(酯類、酸類、萜烯類和高級(jí)醇類)的總含量圖，由數(shù)據(jù)的比較分析可以看出，醇類和酯類仍是香氣的主體成分，二者含量之和占香氣物質(zhì)總量的90%以上。

為進(jìn)一步探究不同混合發(fā)方式對(duì)葡萄酒具體香氣組分的影響，本研究對(duì)提取出的揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行了定性和定量分析，將發(fā)酵樣品中OAV>1的呈香化合物的種類以及含量整理成表4。

高級(jí)醇是葡萄酒中重要的香氣物質(zhì)，其總量低于300 mg/L時(shí)，可以增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性[11]。本研究各樣品的高級(jí)醇總量范圍為140～170 mg/L，由圖1可知，商業(yè)酵母DV10與HU14混合發(fā)酵時(shí)，高級(jí)醇的總含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與HO11混合發(fā)酵時(shí)恰好相反，其中與HU14順序接種條件下高級(jí)醇的產(chǎn)量最高。結(jié)合表4可知，HO11與商業(yè)DV10同時(shí)接種時(shí)異丁醇、2-苯乙醇、1-辛烯-3醇和 (Z)-3-己烯-1-醇的產(chǎn)量均顯著提高，其中2-苯乙醇增產(chǎn)15.32%。

HU14與商業(yè)DV10順序接種時(shí)異丁醇和2,3-丁二醇的產(chǎn)量均顯著高于DV10單獨(dú)發(fā)酵。2-苯乙醇是威代爾冰酒品種香氣的重要組分[16]，利用非釀酒酵母HO11在混合發(fā)酵可顯著提高2-苯乙醇的含量，提升冰酒香氣品質(zhì)。

圖1 各發(fā)酵酒樣中酯類、酸類、萜烯類和高級(jí)醇類物質(zhì)的含量Fig.1 Concentrations of total esters, total acids, total terpenes and total higher alcohols in wines

表4 酒精發(fā)酵結(jié)束酒樣中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量(OAV>1) 單位：μg/LTable 4 Volatile aroma compounds in wines after alcoholic fermentation(OAV>1)

注：表中數(shù)據(jù)(平均值±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差)：利用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)(Independent-Sample T Test)進(jìn)行顯著性方差分析，同一化合物含量后所標(biāo)識(shí)不同的字母表示不同樣本之間存在顯著性差異(p<0.05)。表中加粗物質(zhì)為OAV>1的香氣化合物；N.D表示未檢出。

混合發(fā)酵方式下(除DV10與HU14同時(shí)接種外)，酯類物質(zhì)的總含量均顯著高于商業(yè)DV10單獨(dú)發(fā)酵，非釀酒酵母HO11的產(chǎn)酯能力更強(qiáng)，與DV10混合發(fā)酵(包括同時(shí)接種和順序接種)，酯類總含量是釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵時(shí)產(chǎn)量的2倍，證明漢遜酵母可以增加葡萄酒內(nèi)酯類物質(zhì)的含量[17]。其中，HO11/DV10(D0)混合發(fā)酵總酯類產(chǎn)量最高，其次為HO11/DV10(D4)、HU14/DV10(D4)、DV10單獨(dú)發(fā)酵。同時(shí)由表4可知，DV10單獨(dú)發(fā)酵時(shí)己酸乙酯和辛酸乙酯產(chǎn)量較高，混合發(fā)酵則顯著提高了乙酸乙酯的含量，為冰酒貢獻(xiàn)甜水果氣味和葡萄香氣[11]。HO11/DV10(D0)的乙酸苯乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量顯著升高，其中乙酸苯乙酯OAV值大于4，顯著高于DV10單獨(dú)發(fā)酵。

混合發(fā)酵對(duì)發(fā)酵酒樣中總酸的含量影響并不顯著，當(dāng)商業(yè)DV10與HO11同時(shí)接種混合發(fā)酵時(shí)，總酸含量最高，萜烯類物質(zhì)的含量也較高。萜烯類化合物閾值較低，是冰酒中花果香的重要來源，其含量與菌株以及接種方式有關(guān)[18-19]。由圖1可知，DV10與HO11順序接種時(shí)萜烯類物質(zhì)產(chǎn)量最高，依次為HO11/DV10(D0)、HU14/DV10(D4)、HU14/DV10(D0)，DV10單獨(dú)發(fā)酵時(shí)最低，表明HU14和HO11菌株具有較高的糖苷酶活性，能夠提高萜烯類物質(zhì)的含量。β-大馬士酮、反式-玫瑰醚、香葉醇、4-萜品醇4種物質(zhì)的含量超出其感官閾值，β-大馬士酮是威代爾冰酒中重要的香氣物質(zhì)，有愉悅的甜果香及蜂蜜味[20]。HO11與DV10混合發(fā)酵時(shí)，顯著提高了β-大馬士酮(增產(chǎn)約50%)、4-萜品醇(增產(chǎn)約25%)、反式-玫瑰醚(增產(chǎn)約17%)的含量，順序接種條件下香葉醇的含量也顯著高于其他組。香葉醇具有玫瑰和新鮮香葉的氣味，本實(shí)驗(yàn)中該物質(zhì)在混合發(fā)酵組中含量較高，但在DV10單獨(dú)發(fā)酵下并未檢測(cè)到。

當(dāng)DV10與HU14混合發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)萜烯能力整體遜于HO11。然而，目前針對(duì)H.opuntiae(CVE-HO11)的研究多見于漢遜酵母的分離鑒定[21-23]，對(duì)其發(fā)酵特性的研究和應(yīng)用較少，其在葡萄酒發(fā)酵過程中發(fā)酵性能仍待進(jìn)一步探究。

為證明萜烯類物質(zhì)的含量差異與菌株糖苷酶活性相關(guān)，進(jìn)一步檢測(cè)了各菌株的β-葡萄糖苷酶活性(圖2)，發(fā)現(xiàn)在YNB-cel平板上，HO11的菌落數(shù)明顯多于HU14，表明HO11的糖苷酶活性比HU14高，而釀酒酵母基本沒有生長，證明了釀酒酵母缺少糖苷酶活性[24]。

圖2 糖苷酶活性YNB-cel平板鑒定結(jié)果Fig.2 The identification results of glycosidase activity on YNB-cel plate

2.3 香氣組分的主成分分析

為進(jìn)一步分析不同菌株和接種方式對(duì)冰酒香氣的影響，本研究采用主成分分析法(PCA)，如圖3，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組香氣特點(diǎn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

圖3 酒樣中OAV>1的香氣化合物PCA得分圖(a)及各變量在PC1和PC2上的載荷圖(b)Fig.3 PCA of aroma compounds(OAV>1) in final wines (a. loading plot; b. scatter diagram)

由圖3可知，兩個(gè)主成分(PC1和PC2)的總貢獻(xiàn)率為86.23%，其中PC1的貢獻(xiàn)率為50.49%，PC2的貢獻(xiàn)率為35.74%。從圖3-a可以看出，HU14/DV10(D0)與HU14/DV10(D4)分別位于PC2的正方向和PC2的負(fù)方向上，二相距較遠(yuǎn)，結(jié)合載荷圖3-b可得知二者的香氣物質(zhì)有明顯差異。其中，HU14/DV10(D0)的關(guān)鍵香氣成分為癸酸乙酯(B3)、己酸乙酯(B4)和1-辛烯-3-醇(B11)，而HU14/DV10(D4)主要為辛酸乙酯(B5)、苯乙醛(B15)和香葉醇(B17)；非釀酒酵母HO11混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組位于兩個(gè)象限，HO11/DV10(D0)在PC1和PC2的正方向上，HO11/DV10(D4)位于PC1的正方向和PC2負(fù)方向，遠(yuǎn)離其他實(shí)驗(yàn)組的同時(shí)彼此之間也相距甚遠(yuǎn)。這不僅說明了HO11明顯改變了釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵時(shí)的呈香特征，還說明了HO11采用不同的接種方式應(yīng)用于冰酒的發(fā)酵中，對(duì)香氣產(chǎn)生的影響有顯著性差異。其中HO11與DV10同時(shí)接種發(fā)酵區(qū)別于其他組的關(guān)鍵香氣成分是(Z)-3-己烯-1-醇(B12)、β-大馬士酮(B16)和4-萜品醇(B18)，而順序接種條件下則主要為乙酸己酯(B1)、丁酸乙酯(B2)、乙酸苯乙酯(B6)和反式-玫瑰醚(B19)。

2.4 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

從圖4可以看出，DV10單獨(dú)發(fā)酵酒樣具有愉悅的焦糖香氣，生青味和酒精味明顯，花果香氣味稍淡但整體香氣較為平衡。HO11/DV10(D0)發(fā)酵酒樣花果類香氣最為濃郁，焦糖味和黃油味明顯，這一特點(diǎn)與其β-大馬士酮檢出量最高的結(jié)果相符；HO11/DV10(D4)酒樣中焦糖味和黃油味最為突出，花果類香氣濃郁；采用HU14/DV10(D0)方式的發(fā)酵樣品中焦糖味占主導(dǎo)，其次是生青味和花果香，但整體香氣不足；HU14/DV10(D4)酒樣中酒精味最為明顯，強(qiáng)度與對(duì)照組相近，削弱了單獨(dú)發(fā)酵時(shí)突出的生青味和尖酸味，但花果香、焦糖味等均不突出，香氣平衡性較差。總的來看，混合發(fā)酵過程中HU14菌株雖產(chǎn)香不足但削弱了釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵時(shí)的尖酸味和生青味，而HO11菌株可以顯著增強(qiáng)冰酒中的花果香、黃油味等愉悅的香氣。

圖4 葡萄酒香氣輪廓圖Fig.4 Wine aroma profile

3 結(jié)論

綜上所述，在冰葡萄酒釀造過程中，采用混合發(fā)酵方式能夠顯著降低乙酸的產(chǎn)量，其中HU14菌株降低23.50%，HO11次之(降低21.89%)；提高了酯類和萜烯等物質(zhì)(β-大馬士酮、反式-玫瑰醚、香葉醇等)的含量，其中HO11混合發(fā)酵組萜烯類物質(zhì)的總量與對(duì)照相比增產(chǎn)22.40%，并極大地改變了威代爾冰酒的香氣輪廓，削弱了釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵產(chǎn)生的生青味和尖酸味。感官品鑒結(jié)果進(jìn)一步證明HO11與DV10同時(shí)接種的混合發(fā)酵較好地保留了威代爾冰葡萄酒的特征香氣，并賦予了其濃郁的花果香，增強(qiáng)了香氣的復(fù)雜性和層次感，有效改善了冰酒的感官品質(zhì)。以上結(jié)果表明HO11和釀酒酵母混合發(fā)酵方式可以作為提升冰酒香氣品質(zhì)的有效手段，具有很好的應(yīng)用前景。

[1] 馬玥, 唐柯, 徐巖,等. 固相萃取結(jié)合GC-O/MS分析威代爾冰葡萄酒中的香氣活性化合物[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015，41(4):153-159.

[2] 趙新節(jié), 張家榮, 秦紹智,等. 玫瑰香冰葡萄酒香氣成分分析[J].釀酒科技, 2013(9):107-111.

[3] 張麗珠.川藏高原威代爾冰葡萄中酵母菌的分離、篩選及其耐受性研究[J].中國釀造,2013,32(10):94-97.

[4] 李華, 王華, 袁春龍, 等. 葡萄酒工藝學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2007:68-73;165-178.

[5] 王星晨, 胡凱, 陶永勝. 葡萄汁有孢漢遜酵母和釀酒酵母的混合酒精發(fā)酵動(dòng)力學(xué)[J].食品科學(xué),2016,37(3):103-108.

[6] CHAROENCHAI C, FLEET G H, HENSCHKE P A, et al. Screening of non-Saccharomyceswine yeasts for the presence of extracellular hydrolytic enzymes[J].Australian Journal of Grape and Wine Research,1997,3(1):2-8.

[7] RENAULT P, MIOTSERTIER C, MARULLO P, et al. Genetic characterization and phenotypic variability inTorulasporadelbrueckiispecies: Potential applications in the wine industry[J]. International Journal of Food Microbiology,2009,134(3):201-210.

[8] YAMAOKA C, KURITA O, KUBO T. Improved ethanol tolerance ofSaccharomycescerevisiaein mixed cultures withKluyveromyceslactison high-sugar fermentation.[J].Microbiological Research,2014,169(12):907-914.

[9] RANTSIOU K, DOLCI P.Candidazemplininacan reduce acetic acid produced bySaccharomycescerevisiaein sweet wine fermentations[J].Applied & Environmental Microbiology,2012,78(6):1 987-1 994.

[10] CAPECE A, FIORE C A, ROMANO P. Molecular and technological approaches to evaluate strain biodiversity inHanseniasporauvarumof wine origin[J].Journal of Applied Microbiology,2005,98(1):136-144.

[11] VIANA F, GIL J V, VALLéS S, et al. Increasing the levels of 2-phenylethyl acetate in wine through the use of a mixed culture ofHanseniasporaosmophila, andSaccharomycescerevisiae[J].International Journal of Food Microbiology,2009,135(1):68-74.

[12] VERWAAL R, JIANG Y, WANG J, et al. Heterologous carotenoid production inSaccharomycescerevisiaeinduces the pleiotropic drug resistance stress response[J].Yeast,2010,27(12):983-998.

[13] LAN Y B, XU Q, YANG Z J, et al. Striking changes in volatile profiles at sub-zero temperatures during over-ripening of ‘Beibinghong’ grapes in Northeastern China[J].Food Chemistry,2016,212:172.

[14] HOWARD K L, MIKE J H, RIESEN R. Validation of a solid-phase microextraction method for headspace analysis of wine aroma components[J].American Journal of Enology and Viticulture,2005,56(1):37-45.

[15] JETTI R, YANG E, KURNIANTA A, et al. Quantification of selected aroma-active compounds in strawberries by headspace solid-phase microextraction gas chromatography and correlation with sensory descriptive analysis[J].Journal of Food Science,2007,72(7):S487-S496.

[16] STRAUSS M L, JOLLY N P,LAMBRECHTS M G, et al. Screening for the production of extracellular hydrolytic enzymes by non-Saccharomyceswine yeasts[J].Journal of Applied Microbiology,2001,91(1):182-190.

[17] LAGE P, BARBOSA C, MATEUS B, et al.H.guilliermondiiimpacts growth kinetics and metabolic activity ofS.cerevisiae: the role of initial nitrogen concentration[J].International Journal of Food Microbiology,2014,172:62-69.

[18] MOREIRA N, MENDES F, GUEDES D P P, et al. Heavy sulphur compounds, higher alcohols and esters production profile ofHanseniasporauvarumandHanseniasporaguilliermondiigrown as pure and mixed cultures in grape must[J].International Journal of Food Microbiology,2008,124(3):231-238.

[20] BOWEN A J, REYNOLDS A G. Aroma compounds in Ontario Vidal and Riesling icewines. I. Effects of harvest date[J]. Food Research International,2015,76:540-549

[21] NYCHAS G J, NISIOTOU A A. Yeast populations residing on healthy or botrytis-Infected grapes from a Vineyard in Attica, Greece[J].Applied and Environmental Microbiology,2007,73(8):2 765-2 768

[22] BOVO B, ANDRIGHETTO C, CARLOT M, et al. Yeast population dynamics during pilot-scale storage of grape marcs for the production of Grappa, a traditional Italian alcoholic beverage[J].International Journal of Food Microbiology,2009,129(3):221-228

[23] GAROFALO C, TRISTEZZA M, GRIECO F, et al. From grape berries to wine: population dynamics of cultivable yeasts associated to “Nero di Troia” autochthonous grape cultivar[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2016,32(4):59

[24] PéREZ G, FARIA L. A quick screening method to identify β-glucosidase activity in native wine yeast strains: application of Esculin Glycerol Agar (EGA) medium[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2011,27(1):47-55.

EffectsofmixedfermentationbydifferentHanseniasporagenusyeastsandSaccharomycescerevisiaeonthearomacompoundsinVidalicewine

SHEN Jing-yun, LIU Pei-tong, DUAN Chang-qing, YAN Guo-liang*

(Key Laboratory of Viticulture and Enology, Ministry of Agriculture, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083,China)

Two isolated non-Saccharomyceswine yeasts strains,Hanseniasporaopuntiae(HO11) andHanseniasporauvarum(HU14), were fermented with commercialSaccharomycescerevisiaeDV10 in simultaneous and sequentialinoculation to investigate the effects of different strains and inoculation methods on non-volatile and volatile aroma compounds inVidalice wine. The results showed that mixed fermentation decreased the concentration of acetic acidin final wine compared to the pureS.cerevisiaefermentation, especially in the simultaneous fermentation of HU14/DV10, in which 26.90% decrement of acetic acid was observed. Simultaneous fermentation of HO11/DV10 generated more esters and terpenes,and the concentration of total esters and terpenes were 88.61% and 21.40% higher than that of monoculture ofS.cerevisiae, respectively. Among these compounds, phenyl ethyl acetate (14.6 folds higher than control) and β-damascone (8.85% higher than control) were increased significantly. Sensory evaluation further revealed that mixed fermentation of HO11 andS.cerevisiaeenhanced the floral and butter aroma ofVidalicewine.

ice wine; non-Saccharomyceswine yeasts; mixed fermentation; aroma; sensory evaluation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014700

碩士研究生(燕國梁副教授為通訊作者,E-mail: glyan@cau.edu.cn)。

國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)基金(CARS-30)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(2017SP003)

2017-05-05，改回日期：2017-06-20