側(cè)蒿揮發(fā)油化學(xué)成分及抗氧化、抑菌活性研究

張 彬， 鄧櫻花， 蘇明偉， 張洪權(quán)

(湖北第二師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430205)

側(cè)蒿揮發(fā)油化學(xué)成分及抗氧化、抑菌活性研究

張 彬*， 鄧櫻花， 蘇明偉， 張洪權(quán)

(湖北第二師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430205)

采用同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)提取側(cè)蒿全草揮發(fā)油，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)鑒定其中化學(xué)成分，采用峰面積歸一化法確定各組分的相對(duì)百分含量，并對(duì)揮發(fā)油體外抗氧化活性和抑菌活性進(jìn)行測(cè)試.采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法測(cè)定側(cè)蒿揮發(fā)油體外抗氧化活性，以及其對(duì)5種供試菌的抑菌活性.結(jié)果表明：側(cè)蒿揮發(fā)油共鑒定出37種化學(xué)成分，占總含量的76.93%，其中主要成分為石竹烯及其氧化物、桉樹(shù)腦、樟腦、龍腦、萜品烯-4-醇、大根香葉烯D等.側(cè)蒿揮發(fā)油對(duì)DPPH具有一定的清除能力，但清除效果弱于維生素C(Vc)；側(cè)蒿揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉有較好的抑菌效果，最小抑菌濃度(MIC)分別為0.25 mg/mL、8.0 mg/mL、2.0 mg/mL.

側(cè)蒿； 揮發(fā)油； 氣相色譜-質(zhì)譜； 抗氧化活性； 抑菌活性

蒿屬，菊科一、二年生或多年生草本植物，全球約380種，廣泛分布于北半球的溫帶地區(qū)，在我國(guó)有180余種[1]，全國(guó)均有分布.蒿屬為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，如艾蒿有散寒除濕、溫經(jīng)止血、安胎的功效，常用于功能性子宮出血、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、先兆流產(chǎn)、濕疹等癥；黃花蒿有清熱涼血、退虛熱、解暑、截疾的功效，常用于痢疾、傷暑潮熱等癥；茵陳蒿和濱蒿等則具清熱利濕、利膽退黃、降血壓等功效，臨床上常用于黃疸型肝炎、膽囊炎和小便不利等；而牡蒿全草入藥，具清熱涼血解暑等功效，常用于感冒發(fā)熱、中暑、肺結(jié)核潮熱等[2].蒿屬植物常有濃烈的揮發(fā)性香氣，揮發(fā)油含量較高，其揮發(fā)油多具有抗菌消炎、平喘祛痰、驅(qū)寒止痛、通經(jīng)活絡(luò)、清熱解毒等作用[3]，具有一定的臨床藥用價(jià)值，并在食品、香料及化妝品等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用價(jià)值.

側(cè)蒿(ArtemisiadeversaDiels)，蒿屬白苞蒿組，多年生草本植物，產(chǎn)于陜西南部、甘肅東南部、湖北西部及四川東北部等，生于海拔1 000～2 300 m地區(qū)林下、林緣、山谷、坡地及河邊等[4].目前，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)側(cè)蒿的相關(guān)研究報(bào)道，本文實(shí)驗(yàn)所用側(cè)蒿采自湖北大別山主峰，首次對(duì)側(cè)蒿揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分鑒定及相對(duì)含量分析，并研究其抗氧化能力和抑菌能力，本研究擬為蒿屬植物的深層次開(kāi)發(fā)利用，以及湖北大別山地區(qū)植物的深入研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 側(cè)蒿樣品 全株于2016年8月盛花期采于湖北省大別山主峰，海拔1 700 m坡地，由湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院植物組教授戴月老師鑒定為側(cè)蒿(ArtemisiadeversaDiels)新鮮全株.陰干、粉碎后備用.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 正構(gòu)烷烴C7～C30標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，上海阿拉丁試劑公司；其他所用試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為超純水.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；Agilent7890A氣相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；同時(shí)蒸餾萃取儀(上海玻璃儀器廠)；電子天平(德國(guó)塞多利斯科學(xué)儀器)；高速多功能粉碎機(jī)(南京東邁科技有限公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 側(cè)蒿揮發(fā)油的提取 電子天平稱取200 g側(cè)蒿粉末，置于5 L圓底燒瓶中，加入2.5 L超純水，浸泡8 h.量取150 mL二氯甲烷，加入500 mL圓底燒瓶中，用蒸餾萃取儀萃取8 h.分出二氯甲烷層，加入無(wú)水硫酸鈉，放置冰箱-20℃干燥過(guò)夜.過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮除去二氯甲烷，得側(cè)蒿揮發(fā)油，密封，冰箱-20℃冷藏保存.

1.2.2 側(cè)蒿揮發(fā)油的GC-MS分析 色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，初始溫度60℃，保持3 min，以4℃/min升溫至230℃并保持3 min.分流比30∶1，進(jìn)樣量1 μL.

質(zhì)譜條件：離子源為FID；離子源溫度：30℃；接口溫度：150℃；電子能量：69.922 eV；電子倍增電壓：2 164.7 V；溶劑延遲：3 min；掃描范圍：30～500 amu；載氣：He；定性分析：NIST11.L譜庫(kù)檢索；相對(duì)含量確定：峰面積歸一化法.通過(guò)NIST質(zhì)譜譜庫(kù)數(shù)據(jù)及各組分保留指數(shù)與文獻(xiàn)值對(duì)比，確定成分.

保留指數(shù)(rentention index，RI)的測(cè)定[5]：C7～C30正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品，在上述相同條件下進(jìn)行GC-MS分析，測(cè)定其保留時(shí)間，根據(jù)線性公式計(jì)算出揮發(fā)油各組分的保留指數(shù)RI：RI=100n+100[tR(x)-tR(n)]/[tR(n+1)-tR(n)]，tR(x)為被分析的組分的保留時(shí)間，tR(n)和tR(n+1)分別為有n個(gè)和n+1個(gè)碳原子的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，且tR(n)

1.2.3 側(cè)蒿揮發(fā)油1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)抗氧化活性測(cè)定 DPPH抗氧化活性測(cè)試根據(jù)Wang等[6]的方法，稍作調(diào)整.分別配制0.1 mM DPPH的甲醇溶液、10 mg/mL的VC和10 mg/mL揮發(fā)油的甲醇溶液，96孔板中加樣，甲醇做空白對(duì)照，37℃避光孵化半個(gè)小時(shí)后，用酶標(biāo)儀在517 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度，運(yùn)用如下公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力：

清除率I%=[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100%，

Asample為不同濃度的揮發(fā)油加DPPH后的吸光度，Ablank為不同濃度的揮發(fā)油不加DPPH的吸光度，Acontrol為不加揮發(fā)油的DPPH溶液的吸光度.

1.2.4 側(cè)蒿揮發(fā)油的抑菌活性測(cè)定 菌懸液的配制[7]：供試菌用LB平板放置于37 ℃的培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落，于37 ℃在LB液體培養(yǎng)基中搖培24 h，將菌液濃度稀釋到108cfu/mL備用.

側(cè)蒿揮發(fā)油溶液的配制：以DMSO為溶劑，稀釋法配制8個(gè)質(zhì)量濃度梯度的側(cè)蒿揮發(fā)油溶液，分別為32.0 mg/mL、16.0 mg/mL、8.0 mg/mL、4.0 mg/mL、2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL.

最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定：在超凈工作臺(tái)上，將滅菌的LB培養(yǎng)基倒入9 cm平板中，待培養(yǎng)基凝固后，加入50 μL 懸菌液，均勻涂布.待LB培養(yǎng)基凝固后打孔(孔徑8 mm)，LB培養(yǎng)基封底，孔中加入50 μL揮發(fā)油溶液，移入培養(yǎng)箱，37℃下黑暗中培養(yǎng)24 h，觀察供試菌生長(zhǎng)情況，以無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低濃度為最低抑菌濃度MIC.以DMSO為空白對(duì)照、氨芐青霉素(AMP，最高濃度0.32 mg/mL)作陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)菌種平行測(cè)定三次，最低抑菌濃度取平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 側(cè)蒿揮發(fā)油化學(xué)成分分析

側(cè)蒿揮發(fā)油總離子流圖見(jiàn)圖1.側(cè)蒿揮發(fā)油組成成分及相對(duì)含量見(jiàn)表1.由表1可知，側(cè)蒿揮發(fā)油中共鑒定37種成分，占揮發(fā)油總量的76.93%，其中主要成分為：石竹烯氧化物(13.72%)，桉樹(shù)腦(12.2%)，樟腦(11.17%)，石竹烯(6.55%)，龍腦(3.12%)，萜品烯-4-醇(2.14%)，大根香葉烯D(2.14%)等.

2.2 側(cè)蒿揮發(fā)油DPPH法抗氧化活性

DPPH法中，隨著側(cè)蒿揮發(fā)油濃度的增加，對(duì)DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，其與Vc的DPPH自由基清除能力見(jiàn)圖2和圖3.由圖可知，側(cè)蒿揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力，對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到50%時(shí)，揮發(fā)油濃度為1 mg/mL，Vc的半抑制濃度(IC50)為2.5 μg/mL，側(cè)蒿揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯低于Vc，可見(jiàn)側(cè)蒿揮發(fā)油對(duì)DPPH的抗氧化活性較弱.

2.3 側(cè)蒿揮發(fā)油的抑菌活性

通過(guò)對(duì)5種供試菌的抑菌活性測(cè)試，表明側(cè)蒿揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金色葡萄球菌、黑曲霉有一定的抑菌作用，對(duì)枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌沒(méi)有明顯的抑制作用.抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，側(cè)蒿揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌的抑菌效果較好，最低抑菌濃度(MIC)為0.25 mg/mL，對(duì)黑曲霉、金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用，MIC分別為2.0 mg/mL 和8.0 mg/mL.側(cè)蒿揮發(fā)油與AMP的最低抑菌濃度相比較，可以更直觀的體現(xiàn)側(cè)蒿揮發(fā)油的抑菌作用.

圖1 同時(shí)蒸餾萃取法提取側(cè)蒿揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion current chromatogram of volatile oil from Artemisia deversa Diels by SDE

No．percentagecontent/%CompoundnameFormulaMatchingdegree/%RIRIExpRIRef1034α?蒎烯(α?Pinene)C10H16979349312101莰烯(Camphene)C10H16979469453025β?蒎烯(β?Pinene)C10H169797497441551?辛烯?3?醇(1?Octen?3?ol)C8H16O9098198150562，3?脫氫?1，8?桉樹(shù)腦(2，3?Dehydro?1，8?cineole)C10H16O909909906045α?萜品烯(α?Terpinene)C10H1695101610167031甲基異丙基苯(Cymene)C10H1497102510258122桉樹(shù)腦(Eucalyptol)C10H18O98103010309043γ?萜品烯(γ?Terpinene)C10H11951058105810056順式?氧化芳樟醇(cis?LinaloolOxide)C10H18O2591087108911072芳樟醇(Linalool)C10H18O9711021102121117樟腦(+)?2?BornanoneC10H16O971144114413312龍腦(endo?Borneol)C10H18O971166116614214萜品烯?4?醇(Terpinen?4?ol)C10H18O9311771177

續(xù)表1

注：RIExp為在HP-5MS 色譜柱上測(cè)定出來(lái)的相對(duì)于正構(gòu)烷烴(C7～C30)的保留指數(shù)；RIRef為各化合物保留指數(shù)的文獻(xiàn)值.

圖2 側(cè)蒿揮發(fā)油對(duì) DPPH自由基的清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of volatile oil from Artemisia deversa Diels

圖3 Vc對(duì) DPPH自由基的清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging activity of Vc

表2 側(cè)蒿揮發(fā)油對(duì)5種供試菌的MIC測(cè)定結(jié)果

3 討論

通過(guò)GC-MS技術(shù)對(duì)大別山地區(qū)所產(chǎn)側(cè)蒿的揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定分析，揮發(fā)油中絕大多數(shù)成分為萜烯類化合物及其含氧衍生物(72.39%)，與其他蒿屬植物如青蒿[8]、艾蒿[9]、白蓮蒿[10]等相比，與青蒿揮發(fā)油化學(xué)成分差異較大，僅有石竹烯、石竹烯氧化物、依蘭烯、樟腦、桉樹(shù)腦等5種化合物相同，且含量相差也較大.與白蓮蒿、艾蒿揮發(fā)油化學(xué)成分類似，與白蓮蒿化學(xué)成分相同的有：桉樹(shù)腦、α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、α-松油醇、萜品烯-4-醇、乙酸龍腦酯、樟腦等8種化合物，其中桉樹(shù)腦、樟腦含量均較高.與艾蒿化學(xué)成分相同的有：α-蒎烯、α-松油醇、石竹烯、石竹烯氧化物、桉樹(shù)腦、樟腦、龍腦、大根香葉烯D、芳樟醇、斯巴醇、葉綠醇等11種化合物，其中石竹烯、石竹烯氧化物、桉樹(shù)腦、樟腦、龍腦、大根香葉烯D等主要化學(xué)成分基本相同，含量接近.另外，側(cè)蒿揮發(fā)油中其他成分如γ-萜品烯、β-金合歡烯、蛇麻烯、橙花叔醇等，也常出現(xiàn)在其他蒿屬植物揮發(fā)油中.

側(cè)蒿揮發(fā)油主要成分為石竹烯及其氧化物(20.27%)，桉樹(shù)腦(12.2%)，樟腦(11.17%)，龍腦(3.12%)，萜品烯-4-醇(2.14%)，大根香葉烯D(2.14%).據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，石竹烯及其氧化物、樟腦、龍腦、萜品烯-4-醇、均對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞膜有破壞作用[11-15]，因此這些成分可能與側(cè)蒿揮發(fā)油的抑菌活性有關(guān).側(cè)蒿揮發(fā)油中含有大量的萜烯、萜醇類成分，萜烯、萜醇類成分具有抗氧化功能，可能是其抗氧化活性的內(nèi)在原因.側(cè)蒿揮發(fā)油的研究，表明其具有一定的藥學(xué)研究?jī)r(jià)值和作為食品天然抗氧化劑和抗菌劑的潛能，同時(shí)也為大別山地區(qū)植物生態(tài)的研究提供依據(jù).

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Chemicalcompositionandantioxidant，antibacterialactivityof
volatileoilfromArtemisiadeversaDiels

ZHANG Bin， DENG Yinghua， SU Mingwei， ZHANG Hongquan

(College of Chemistry and Life Science， Hubei University of Education， Hubei Key Laboratory of Purification and Application of Plant Anti-Cancer Active Ingredients， Wuhan 430205， China)

The chemical composition， antimicrobial and antioxidant activities of the volatile oil ofArtemisiadeversaDiels were investigated. The composition of the volatile oil extracted by simultaneous distillation extraction (SDE) method， was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)， and a total of 37 components representing 76.93% in this plant were identified. The main constituents were Caryophyllene oxide (13.72%)， Eucalyptol (12.2%)， 2-Bornanone (11.17%)， Caryophyllene (6.55%)， endo-Borneol (3.12%)， Terpinen-4-ol (2.14%) and Germacrene D (2.14%). The antioxidant activity of the oil was evaluated by 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) method. The result showed that the oil revealed a certain scavenging effect on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical， and the inhibition increased with concentration of the oil increase. The antimicrobial activities of the oil were separately evaluated against five micro-organisms，Bacillussubtilis，Escherichiacoli，Staphylococcusaureus，BacilluscereusandAspergillusniger. The oil possessed inhibitory activity againstEscherichiacoli，StaphylococcusaureusandAspergillusnigerwith MIC of 0.25 mg/mL， 8.0 mg/mL and 2.0 mg/mL．

ArtemisiadeversaDiels; volatile oil; gas chromatography-mass spectrometry; antioxidant activity; antimicrobial activity

2017-07-20.

湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(T201718)；湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(B2016219)； 植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題( HLPAI2014004).

*通訊聯(lián)系人. E-mail: jaina96@163.com.

10.19603/j.cnki.1000-1190.2017.06.009

1000-1190(2017)06-0777-05

R284.2

A