右美托咪定對(duì)糖尿病大鼠肺組織的保護(hù)作用

汪忠玉,曾資平,張 燕,張景輝

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 麻醉科,廣東 深圳518036；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院)

右美托咪定對(duì)糖尿病大鼠肺組織的保護(hù)作用

汪忠玉1*,曾資平1,張 燕1,張景輝2

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 麻醉科,廣東 深圳518036；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院)

目的評(píng)價(jià)右美托咪定對(duì)糖尿病大鼠肺組織的保護(hù)作用。方法40只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組(n=10)：正常組(N組)、不同劑量右美托咪定處理組(DEX1組、DEX2組)、糖尿病組(DM組)。DM組和DEX1組、DEX2組采用腹腔注射鏈脲佐菌素60 mg/kg的方法制備糖尿病模型，N組僅腹腔注射等容量枸櫞酸緩沖液。模型建立8周后，DEX1組和DEX2組每日在腹腔內(nèi)分別注射右美托咪定5 μg/kg、10 μg/kg，N組和DM組每日僅腹腔注射等容量生理鹽水。1周后，各組大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)股動(dòng)脈插管抽取動(dòng)脈血作血?dú)夥治?，隨后處死，取肺組織，測(cè)定濕/干重比(W/D比)、光學(xué)顯微鏡觀察并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分、用ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α、IL-6的含量。結(jié)果與N組比較，DM組、DEX1組和DEX2組的PaO2顯著下降(P<0.05)，肺組織病理評(píng)分、TNF-α、IL-6含量顯著升高(P<0.05)。DEX1組和DEX2組與DM組比較，大鼠動(dòng)脈血PaO2明顯提高(P<0.05)，W/D比值、肺組織病理評(píng)分、TNF-α、IL-6含量顯著下降(P<0.05)。結(jié)論右美托咪定可抑制糖尿病大鼠肺組織炎性反應(yīng)，減輕糖尿病大鼠肺損傷。

糖尿病；右美托咪定；肺損傷；炎癥反應(yīng)

(ChinJLabDiagn,2017,21:2177)

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，常引起全身多器官功能損害，研究表明肺組織也是糖尿病損害的靶器官之一，可出現(xiàn)限制性通氣功能障礙和彌散、阻塞性及混合性通氣功能障礙，出現(xiàn)代謝源性肺功能異常[1]。糖尿病患者術(shù)中使用呼吸機(jī)更可能加重其肺損傷，因此探討其有效的防治措施具有重要的意義。右美托咪定(Dexmedetomidine，Dex)是一種α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，近年研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定對(duì)肺組織有保護(hù)作用[2]，但是否能有效抑制糖尿病肺損傷尚不明確。本研究擬探討右美托咪定對(duì)糖尿病大鼠肺組織的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和糖尿病大鼠模型的制備健康成年雄性SD大鼠40只，體重200-250g，購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10只：(1)正常組(N組)；(2)右美托咪定低劑量組(DEX1組)；(3)右美托咪定高劑量組(DEX2組)；(4)糖尿病組(DM組)。

DEX1組、DEX2組、DM組大鼠按60 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ，溶解于0.1 mol/L pH4.2枸櫞酸緩沖液)腹腔注射建立糖尿病模型，N組僅腹腔注射等容量枸櫞酸緩沖液。72 h后尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖>16.7 mmol/L，尿糖定性≥+++作為糖尿病動(dòng)物模型建立標(biāo)準(zhǔn)，未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)者均淘汰。糖尿病模型建立后每周定期檢測(cè)糖尿病大鼠血糖值，觀察各組大鼠體重變化及24 h飲水量和尿量。

糖尿病大鼠模型建立8周后，DEX1組每日在腹腔內(nèi)注射Dex5 μg/kg，DEX2組每日在腹腔內(nèi)注射Dex10 μg/kg，N組和DM組僅腹腔注射等容量生理鹽水。Dex購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：15051232。1周后，各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行取材。

本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

1.2.1血?dú)夥治?各組大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)股動(dòng)脈插管抽取動(dòng)脈血作血?dú)夥治觯瑴y(cè)定pH值、PaO2和PaCO2。

1.2.2檢測(cè)肺泡灌洗液(BALF)TNF-α、IL-6含量 采用頸動(dòng)脈快速放血處死動(dòng)物后，立即從隆突處離斷左、右肺，行左主支氣管肺泡灌洗。10 ml 5℃生理鹽水反復(fù)肺灌洗3次，將回收得到的灌洗液離心15 min，取上清液，-70℃凍存。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)檢測(cè)BALF中TNF-α、IL-6的含量，試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司，貨號(hào) TNF-α：Cat#：ERC102a， IL-6：Cat#：ERC003，操作過(guò)程嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.3肺組織檢測(cè)(取下肺組織并用液氮保存待測(cè))

1.3.1肺組織濕/干重比：取右肺下葉，稱濕質(zhì)量后置于真空冷凍干燥機(jī)48 h，稱干質(zhì)量，計(jì)算肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D比)。

1.3.2肺組織病理學(xué)評(píng)分：另取右肺組織浸泡于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色后用普通光學(xué)顯微鏡觀察并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。評(píng)分內(nèi)容為間質(zhì)水腫、肺泡水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡內(nèi)充血，分別依其嚴(yán)重程度評(píng)0-4分(0分，無(wú)病變或非常輕微；1分，輕度病變；2分，中度病變；3分，重度病變；4分，極重度病變)，并計(jì)算四項(xiàng)指標(biāo)的總分為肺損傷評(píng)分。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠動(dòng)脈血血?dú)夥治霰容^(表1)

與N組比較，DM組、DEX1組和DEX2組大鼠動(dòng)脈血PaO2顯著下降(P<0.05)，但DEX1組和DEX2組與DM組比較，大鼠動(dòng)脈血PaO2明顯提高(P<0.05)。DEX1組和DEX2組之間比較無(wú)顯著性差異性(P>0.05)，pH值、PaCO2各組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠pH、PaO2、PaCO2結(jié)果比較

注：與N組比較，aP<0.05，與DM組比較，bP<0.05

2.2各組肺組織W/D比值變化和肺組織病理評(píng)分(表2)

DM組W/D比值顯著高于N組(P<0.05)，DEX1組和DEX2組W/D比值顯著低于DM組(P<0.05)。光鏡下顯微鏡下N組肺組織未見(jiàn)明顯異常，DM組可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)滲出物，肺間質(zhì)出現(xiàn)增厚和水腫，DEX1組和DEX2組肺組織少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)增厚減輕，肺泡萎陷明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)較DM組完整，肺受損程度明顯減輕。肺組織病理評(píng)分DM組、DEX1組和DEX2組顯著高于N組(P<0.05)，DEX1組和DEX2組顯著低于DM組(P<0.05)。

2.3肺泡灌洗液TNF-α、IL-6的含量(表2)

DM組、DEX1組和DEX2組大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-6的含量與N組比較顯著上升(P<0.05)，DEX1組和DEX2組與DM組比較TNF-α、IL-6的含量明顯下降(P<0.05)。DEX1組和DEX2組之間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表2 各組大鼠肺組織病理評(píng)分、W/D比、肺泡灌洗液TNF-α、IL-6含量比較

注：與N組比較，aP<0.05，與DM組比較，bP<0.05

3 討論

本研究以大鼠空腹血糖>16.7 mmol/L，尿糖定性≥+++為標(biāo)準(zhǔn)，成功建立了DM動(dòng)物模型。結(jié)果顯示，與N組比較，DM組大鼠肺組織W/D比值顯著增高，光鏡下可見(jiàn)肺間質(zhì)和肺泡水腫，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，提示DM大鼠肺組織病理?yè)p傷明顯，并且DM組PaO2顯著降低，說(shuō)明DM組大鼠肺換氣功能也有明顯損害。而給予右美托咪定后，糖尿病大鼠PaO2升高，肺組織病理評(píng)分和W/D比值降低，表明右美托咪定能抑制糖尿病肺損傷的病理改變，并改善糖尿病大鼠肺氣體交換功能。

目前認(rèn)為，多種因素參與了糖尿病的肺損傷過(guò)程，其中炎癥反應(yīng)也是重要因素之一[3]。研究指出高血糖狀態(tài)下蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)形成糖基化終產(chǎn)物(AGEs)，致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，大量炎性因子釋放，引起肺組織功能及結(jié)構(gòu)的改變[4]。糖尿病患者循環(huán)中多種炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α等升高，而這些炎癥因子己被證實(shí)在介導(dǎo)外周氣道炎癥、慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘發(fā)病中具有重要作用，說(shuō)明糖尿病時(shí)炎癥參與了糖尿病肺的改變。劉光等對(duì)糖尿病大鼠肺組織觀察顯示肺泡水腫，肺間質(zhì)和血管周圍有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性因子IL-4、IL-6表達(dá)增多，提示糖尿病大鼠肺組織炎癥反應(yīng)明顯[5]。Cukurova等研究發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的核因子NF-κB抑制劑可以減輕糖尿病大鼠肺泡基底膜增厚和肺間質(zhì)單核炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，改善肺功能[6]，從另一個(gè)側(cè)面反應(yīng)了炎癥造成了糖尿病肺損傷。

TNF-α、IL-6是非常關(guān)鍵的炎性因子，對(duì)肺有強(qiáng)烈的毒性，其表達(dá)水平反應(yīng)了炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度。本研究觀察到，DM組肺組織TNF-α和IL-6含量顯著升高，肺組織炎性病理改變明顯，這與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。而DEX1組和DEX2組大鼠肺組織TNF-α和IL-6表達(dá)水平顯著下降，提示右美托咪定通過(guò)抑制糖尿病大鼠肺部炎癥反應(yīng)，從而減輕肺部病理性損傷。右美托咪定是一種新型的高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗交感神經(jīng)作用，近年研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定具有抑制炎癥反應(yīng)的作用[7]。Taniguchi等將右美托咪定用于內(nèi)毒素血癥大鼠，發(fā)現(xiàn)可以降低TNF-α、IL-6水平，抑制肺部中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，降低大鼠死亡率[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能改善機(jī)械通氣致肺損傷[9]和內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷[10]，其機(jī)制是降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的表達(dá)，并認(rèn)為α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑抗炎作用可能與巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)。本研究參照文獻(xiàn)[11]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將右美托咪定5 μg/kg和10 μg/kg腹腔注射一周用于糖尿病大鼠，結(jié)果表明，右美托咪定能抑制糖尿病大鼠肺部炎癥反應(yīng)，改善肺部病理?yè)p傷和肺氣體交換功能。但兩個(gè)劑量右美托咪定干預(yù)組之間沒(méi)有顯著性差異，因此右美托咪定對(duì)糖尿病肺保護(hù)作用是否有封頂效應(yīng)以及確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，右美托咪定可抑制糖尿病大鼠肺組織炎性反應(yīng)，減輕糖尿病大鼠肺損傷。

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ProtectiveEffectofDexmedetomidineonLungInjuryInRatsWithStreptozotocin-inducedDiabetes

WANGZhong-yu,ZENGZi-ping,ZHANGYan,etal.

(DepartmentofAnesthesiology，BeijingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036,China)

ObjectiveTo evaluate the protective effect of dexmedetomidine on lung injury in rats with streptozotocin-induced diabetes.MethodsFourty SD rats were randomly divided into 4 groups(n=10)：normal group (group N)，diabetes group (group DM)，dexmedetomidine 1 group(group DEX1) and dexmedetomidine 2 group(group DEX2).DM rats model was induced by intraperitoneal streptozotocin 60 mg/kg and confirmed by blood glucose level>16.7 mmol/L in groups DM,group DEX1and group DEX2.Citric acid buffer solution was intraperitoneal injected in group N.At 8 weeks after establishment of the Diabetic rats model，dexmedetomidine was intraperitoneal injected in daily respectively 5μg/kg,10 μg/kg in DEX1 and DEX2 group.Equal volume of normal saline was intraperitoneal injected in group N and DM.After 1 week，femoral artery intubation is drawn through arterial blood for blood gas analysis.Then the rats were sacrificed,the lungs were removed for determination of W/D lung weight ratio,examination of the pathological changes and grade.Additionally,we examined the concentration of tumour necrosis factor-alpha(TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsCompared with group N,PaO2were significantly decreased in group DM,DEX1 and DEX2,the pathological grade,contents of TNF-α,IL-6 were significantly increased in group DM,DEX1 and DEX2(P<0.05).Compared with group DM,PaO2were significantly decreased,W/D lung weight ratio,the pathological grade,contents of TNF-α,IL-6 were significantly decreased in DEX1and DEX2 group(P<0.05).ConclusionDexmedetomidine can reduce lung injury in diabetic rats through inhibit inflammatory reaction

Diabetes mellitus；Dexmedetomidine；Lung injury；Inflammatory reaction

深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)基金資助項(xiàng)目(JCYJ20150403091443296)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2177-04

R587.1

A

2017-04-28)