激活素-卵泡抑素系統(tǒng)在病理性瘢痕中的表達(dá)

侯 亮,張 揚(yáng),孫軼峰,高 旭,李 紅*

(1．吉林銘醫(yī)整形美容醫(yī)院，吉林 長春130021；2．吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春130022)

激活素-卵泡抑素系統(tǒng)在病理性瘢痕中的表達(dá)

侯 亮1,張 揚(yáng)2,孫軼峰1,高 旭1,李 紅1*

(1．吉林銘醫(yī)整形美容醫(yī)院，吉林 長春130021；2．吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春130022)

目的探討激活素-卵泡抑素系統(tǒng)(activin-FS)在病理性瘢痕組織中的表達(dá)。方法收集2014-06/2017-06吉林銘醫(yī)整型美容醫(yī)院整形外科組織標(biāo)本，分為病理性瘢痕組46例(包括瘢痕疙瘩組25例和增生性瘢痕組21例)、非病理性瘢痕組30例和正常皮膚組27例。采用免疫組化(Immunohistochemistry，IHC)方法分別檢測activin A及FS的蛋白表達(dá)情況；RNA酶保護(hù)試驗(yàn)(RNase protection assay，RPA)分析activin A的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，activin A和FS在正常皮膚和病理性瘢痕的表皮基底層均有表達(dá)，且病理性瘢痕組較正常皮膚組染色程度加深(P<0.05)。RNA酶保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，正常皮膚組和非病理性疤痕組activin-A mRNA表達(dá)水平極低，而病理性瘢痕組表達(dá)則明顯增多。結(jié)論activin-FS系統(tǒng)可能參與病理性瘢痕的發(fā)生發(fā)展。

病理性瘢痕；激活素；卵泡抑素；免疫組織化學(xué)；RNA酶保護(hù)試驗(yàn)

(ChinJLabDiagn,2017,21:2093)

瘢痕是在創(chuàng)傷愈合過程中必然生成的產(chǎn)物，在臨床上包括病理性瘢痕和非病理性瘢痕。機(jī)體多數(shù)組織損傷均可通過瘢痕的產(chǎn)生來修復(fù)，而瘢痕疙瘩(keloid)和增生性瘢痕(hypertrophic scar)則是由于成纖維細(xì)胞過度增殖和膠原過度合成所致的結(jié)締組織增生性疾病，為臨床多見的病理性瘢痕。瘢痕發(fā)生時(shí)，增厚的瘢痕組織不僅嚴(yán)重影響美觀，而且后期較易發(fā)生攣縮導(dǎo)致組織或器官移位變形，甚至關(guān)節(jié)功能障礙。因此病理性瘢痕的預(yù)防和治療一直是整形外科亟待解決的問題之一，但其病因及形成機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為病理性瘢痕與基因表達(dá)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路、膠原代謝以及細(xì)胞增殖等密切相關(guān)[1-3]。有研究表明，激活素A(activin A)及卵泡抑素(follistatin，F(xiàn)S)參與創(chuàng)傷修復(fù)過程，刺激成纖維細(xì)胞的增殖和合成膠原[4,5]。本研究通過免疫組化方法和RNA酶保護(hù)試驗(yàn)，檢測activin A-FS系統(tǒng)在病理性瘢痕中的表達(dá)情況，旨在為探討病理性瘢痕的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本獲取選取2014-06/2017-06吉林銘醫(yī)整形美容醫(yī)院整形外科手術(shù)患者，取自面部、前胸、肩背部、耳垂部及四肢等部位的組織標(biāo)本。所有瘢痕組織標(biāo)本均來自瘢痕修復(fù)手術(shù)切除的瘢痕組織；正常皮膚組織來自植皮術(shù)中供皮區(qū)剩余的皮膚組織；常規(guī)石蠟切片，HE染色經(jīng)兩位病理醫(yī)師鑒別診斷；所有患者均獲得知情同意?；颊呔鶡o皮膚、免疫、傳染等全身性疾病，瘢痕表面無感染和潰瘍，術(shù)前均未行激素及免疫抑制劑治療。病理性瘢痕組分為瘢痕疙瘩25例，年齡18-55歲；增生性瘢痕21例，年齡10-56歲。非病理性瘢痕組30例，年齡9-52歲。正常皮膚組27例，年齡17-54歲。

1.2主要試劑Activin-βA及FS山羊多克隆抗體(R&D Systems)；HRP標(biāo)記的免抗羊和DAB試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)；Trizol(美國Gibco公司)；RPA試劑盒和同位素α-32P-UTP(美國NEN公司)

1.3免疫組化染色常規(guī)制備石蠟切片，連續(xù)切成5 μl薄片，黏附于多聚賴氨酸處理的玻片上，在60℃烘箱中烤1.5 h，依次用二甲苯及梯度濃度乙醇水化，蒸餾水洗滌3次。將玻片置于含0.01 M檸檬酸鈉(pH 6.0)的緩沖液中，加熱處理8 min，PBST洗滌3次；滴加3%H2O2處理30 min,去除內(nèi)源性的過氧化氫酶。PBST洗滌3次，每次5 min。分別滴加activin-βA(1∶200)或FS(1∶400)，4℃孵育過夜，次日PBST洗滌3次，每次5 min；滴加羊抗鼠的二抗，室溫孵育1 h后，PBST洗滌3次，每次5 min。滴加50 μl的DAB顯色液，邊染色邊在顯微鏡下觀察。染色結(jié)束后自來水沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯脫水干燥，并用中性樹脂封片。每批標(biāo)本均設(shè)已知陽性對(duì)照和PBS替代一抗的空白對(duì)照。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整且不重疊的高倍鏡視野(×400)，測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的累積光密度和所有細(xì)胞總面積，采用專業(yè)軟件分析activin-A和FS蛋白的表達(dá)。

1.4RNA酶保護(hù)試驗(yàn)利用Trizol提取各組織總RNA。根據(jù)文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行RPA，重復(fù)獨(dú)立試驗(yàn)2次。應(yīng)用文獻(xiàn)[7]中activin-βA的cDNA模板。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。帶有基因表達(dá)條帶的膠片經(jīng)掃描后，自動(dòng)讀取基因表達(dá)強(qiáng)度的數(shù)值。

1.5結(jié)果分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用 SPSS 12.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1免疫組化檢測結(jié)果

如圖1所示，activin A在正常皮膚(圖1a)和病理性瘢痕(圖1d)的表皮基底層均有表達(dá)；與正常皮膚組相比，病理性瘢痕組染色程度明顯加深。FS亦呈現(xiàn)類似的表達(dá)情況(圖1b和圖1e)。病理性瘢痕組activin A和FS蛋白的平均光密度值分別與正常皮膚組相比，兩者之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

箭頭D和E分別代表真皮層和表皮層

2.2RNA酶保護(hù)分析

內(nèi)源性activin-βAmRNA表達(dá)情況如圖2所示。activin-A mRNA在正常皮膚組和非病理性瘢痕組的表達(dá)均為極低水平，而病理性瘢痕組則顯著增強(qiáng)。

表1 不同組織中激活素A和卵泡抑素蛋白的平均光密度

*與正常皮膚組比較，P<0.05。NS：正常皮膚，Non-PS：非病理性瘢痕，PS：病理性瘢痕。

3 討論

病理性瘢痕是由于全身以及局部因素的影響，引發(fā)異常的損傷修復(fù)過程，是創(chuàng)傷部位過度修復(fù)的結(jié)果。其形成涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子、生長因子及細(xì)胞間的相互作用。近年來研究顯示，轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor β，TGF-β)超家族在病理性瘢痕的發(fā)病過程中起著重要的橋梁作用，其主要參與抑制免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和促進(jìn)細(xì)胞外基`[8,9]。

Lane 1,2：正常皮膚，Lane 3-6：病理性瘢痕，Lane 7,8：非病理性瘢痕

圖2RNA酶保護(hù)試驗(yàn)測定不同組織中activin-βAmRNA表達(dá)情況

激活素A(activin A)是TGF-β超家族球蛋白成員之一，是一種由性腺分泌的大分子糖蛋白，其最早在雌豬卵泡液中被分離出來。activin A有3種不同類型的受體，它可在Ⅲ型受體的輔助下，與Ⅱ型受體結(jié)合，并與磷酸化的ActR I形成三元絡(luò)合物，再使胞漿內(nèi)的Smad 2和Smad 3磷酸化，最后將信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，并在細(xì)胞核中調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)[10]。正常的activin A在維持細(xì)胞增殖、黏附、凋亡及分化過程中發(fā)揮著重要作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，在諸多組織器官炎癥[11]和纖維化[12,13]過程中activin A表達(dá)亦增高。卵泡抑素(follistatin，F(xiàn)S)是activin A 的特異性結(jié)合蛋白，拮抗activin A的生物活性，進(jìn)一步抑制細(xì)胞內(nèi)的Smad2/3的信號(hào)激活[10]。Munz等[14]發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)activin A的轉(zhuǎn)基因鼠真皮層明顯增厚，且傷口愈合加快。而Wankell等在FS轉(zhuǎn)基因鼠中觀察結(jié)果正好相反[15]。

本研究通過免疫組化方法檢測activin A在病理性瘢痕中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在瘢痕疙瘩及增生性瘢痕中的表達(dá)均高于正常皮膚和非病理性瘢痕。RNA酶保護(hù)性測定亦顯示，病理性瘢痕activin-A mRNA表達(dá)水平較正常皮膚和非病理性瘢痕顯著增強(qiáng)。FS亦顯示相似的表達(dá)情況。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)觀察到activin A和FS蛋白均在表皮基底層定位表達(dá)，由此可以設(shè)想，activin-FS系統(tǒng)能夠調(diào)控表皮基底角質(zhì)形成細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)過程，加速其遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而參與創(chuàng)面修復(fù)及瘢痕形成[16]。

綜上所述，activin A和FS在病理性瘢痕病變的發(fā)展中起到重要的作用。因此，通過特異干預(yù)兩者的表達(dá)，必定對(duì)核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響，可能會(huì)成為病理性瘢痕潛在的治療策略。

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Expressionsofactivin-FSsysteminpathologicalscars

HOULiang1,ZHANGYang2,SUNYi-feng1,etal.

(1.JilinMoiiMedicalCosmetologyHospital,Changchun130021,China; 2.SchoolofPharmaceuticalScienceofJilinUniversity,Changchun130022,China)

ObjectiveThe aim of this study is to detect the expressions of activin-A and follistatin (FS) and investigate their relationship in pathogenesis and development of pathological scars.MethodsExperimental samples were obtained from the patients,who underwent burn and plastic surgery at Department of Plastic Surgery,Jilin Moii Medical Cosmetology Hospital,from June 2014 to June 2017,including 25 patients with keloid,and 21 patients with hypertrophic scars.Normal skin and non-pathological scars from additional 27 and 30 cases respectively were served as controls.The expression of activin-A and FS protein in pathological scars,non-pathological scars and normal skin were examined by immunohistochemistry (IHC)(P<0.05).The expression of mRNA in these tissues were performed by RNAase protection assay (RPA).ResultsIHC showed increased localization of both activin-A and FS in the basal layer of epidermis of pathological scars compared with normal tissue.Increased mRNA expression for activin A was observed in pathological scars by performing RPA.ConclusionThese findings emphasize the importance of the activin-FS system in biology and pathogenesis of pathological scars.

pathological scars；activin;follistatin;immunohistochemistry;RNAase protection assay

吉林省衛(wèi)生計(jì)生青年科技骨干培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2017Q032)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2093-04

R619+.6

A

2017-08-14)