NMOSD患者外周血濾泡輔助性T細(xì)胞及其亞群的表達(dá)研究

楊彬彬 吳茜 孫林 郁迪 劉磊 喬志新 王佳偉

NMOSD患者外周血濾泡輔助性T細(xì)胞及其亞群的表達(dá)研究

楊彬彬 吳茜 孫林 郁迪 劉磊 喬志新 王佳偉

目的通過(guò)研究視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(NMOSD)患者外周血中濾泡輔助性T(Tfh)細(xì)胞的表達(dá)，探討Tfh細(xì)胞與NMOSD發(fā)病的關(guān)系。方法采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)53例NMOSD急性發(fā)作期患者(NMOSD組)和20名健康對(duì)照(對(duì)照組)的外周血中不同表型的Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例及其三個(gè)亞群Tfh1、Tfh2、Tfh17占CD4+CXCR5+T細(xì)胞的比例。結(jié)果NMOSD組CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞、CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例均高于健康對(duì)照組〔分別(22.80±6.78)%vs.(18.94±3.84)%，t=3.042，P=0.003；(9.54±3.29)%vs. (4.21±1.31)%，t=9.914，P=0.000〕。在CD4+CXCR5+T細(xì)胞中，NMOSD患者組Tfh17細(xì)胞所占比例高于對(duì)照組〔(30.70±4.56)%vs.(27.33±2.89)%，t=3.071，P=0.003〕， Tfh1細(xì)胞比例低于對(duì)照組〔(26.41±4.42)%vs. (30.26±3.66)%，t=-3.474，P=0.001〕，Tfh2細(xì)胞比例與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.127)；(Tfh2細(xì)胞比例+Tfh17細(xì)胞比例)/Tfh1細(xì)胞比例的比值高于對(duì)照組(2.41±0.65vs.1.88±0.39，t=4.264，P=0.000)。結(jié)論NMOSD急性發(fā)作期患者外周血中Tfh 細(xì)胞比例增高，同時(shí)存在著Tfh細(xì)胞的三個(gè)亞群的比例失調(diào)，尤其是Tfh17細(xì)胞比例顯著增高，推測(cè)Tfh 細(xì)胞與NMOSD的發(fā)病存在一定關(guān)系。

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾?。粸V泡輔助性T細(xì)胞；CXC趨化因子受體5；程序性死亡受體1

視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)和NMO譜系疾病(NMO spectrum disorders，NMOSD)是一類以視神經(jīng)炎和(或)急性橫貫性脊髓炎為典型臨床表現(xiàn)的自身免疫性炎性脫髓鞘疾病。2004年，Lennon等[1]在NMO患者血清中發(fā)現(xiàn)了一種特異性抗體，并于隨后證實(shí)該抗體的靶抗原為位于星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，AS)足突上的水通道蛋白-4(aquaporin-4，AQP-4)[2]，提示NMOSD是一種以體液免疫反應(yīng)為主的自身免疫反應(yīng)性疾病，但對(duì)于自身抗體產(chǎn)生機(jī)制仍了解較少。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cell，Tfh) 定位于淋巴濾泡，主要功能是輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體參與體液免疫反應(yīng)。Tfh細(xì)胞屬于CD4+T淋巴細(xì)胞，表達(dá)CXC趨化因子受體5(CXC chemokine receptor 5，CXCR5)，可誘導(dǎo)共刺激因子(inducible costimulator，ICOS)、程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)等表面分子[3]。由于人類的淋巴組織標(biāo)本不能輕易獲得，所以大部分關(guān)于Tfh細(xì)胞的研究采用外周血標(biāo)本[4-10]。研究表明人類外周血中存在Tfh細(xì)胞，并根據(jù)其表面趨化因子受體CCR6和CXCR3的表達(dá)情況，被分為Tfh1(CXCR3+CCR6-)、Th2(CXCR3-CCR6-)和Thf17(CXCR3-CCR6+)三個(gè)亞群[4]。本文通過(guò)檢測(cè)NMOSD患者急性發(fā)病期外周血中Tfh細(xì)胞及其各亞群細(xì)胞的比例，分析其在NMOSD患者發(fā)病過(guò)程中的變化，初步探討其與NMOSD發(fā)病的關(guān)系，期望有助于從新的視角認(rèn)識(shí)NMOSD的發(fā)病機(jī)制，為治療方面提供新的方向和思路。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象選擇2016-05—2017-04期間在北京同仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的NMOSD患者53例，其中男5例、女48例，年齡19～64歲，平均(39.83±15.13)歲，診斷均符合2015年Wingerchuk修訂的NMOSD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，入選患者均處于急性發(fā)作期，且近1個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊治療及其他免疫抑制劑?；颊咧蠥QP-4抗體陽(yáng)性50例、陰性3例?；颊呓?個(gè)月內(nèi)均無(wú)感染性疾病及妊娠，無(wú)家族性遺傳病史。同時(shí)選擇同期同仁醫(yī)院健康體檢者20名為對(duì)照組，男5名、女15名，年齡22～75歲，平均(34.20±13.83)歲，均無(wú)自身免疫性疾病史，近1個(gè)月內(nèi)無(wú)感染性疾病史。兩組在年齡、性別構(gòu)成上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)北京同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要試劑和儀器FITC-Anti-Human CD4、PE-Anti-Human PD-1及其同型對(duì)照抗體、PE-Anti-Human CCR6及其同型對(duì)照抗體、PerCP-Cy5.5-Anti-Human CXCR3及其同型對(duì)照抗體、Alexa Fluor 647 anti-human CXCR5及其同型對(duì)照抗體、溶血素及流式細(xì)胞儀FACS Calibur購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.3方法采集患者及健康人外周血2 mL，EDTA抗凝，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其外周血的Tfh細(xì)胞及其各亞群，并進(jìn)行分析。具體步驟：(1)Tfh細(xì)胞及其同型對(duì)照管：兩管各加入5 μL FITC-Anti-Human CD4，Tfh細(xì)胞管中加入5 μL Alexa Fluor 647 Anti-humanCXCR5、10 μL PE-Anti-Human PD-1，同型對(duì)照管中加入相同體積的同型對(duì)照抗體；(2)Tfh細(xì)胞亞群及其同型對(duì)照管：兩管各加入5 μL FITC-Anti-Human CD4和Alexa Fluor 647 Anti-human CXCR5，Tfh細(xì)胞亞群管中再加入5 μL PerCP-Cy5.5-Anti-Human CXCR3和PE-Anti-Human CCR6，同型對(duì)照管中加入相同體積的同型對(duì)照抗體；(3)各管均加入100 μL 外周血，混勻，室溫避光孵育15 min；各管均加入1 mL溶血素，振蕩混勻靜置10 min，使紅細(xì)胞裂解；以1500 r/min離心5 min；棄上清PBS洗滌1次后，加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)；(4)數(shù)據(jù)經(jīng)CellQuest軟件獲取和分析：①分析外周血不同表型的Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例：先在由前向角散射光(forward scatter， FSC)和側(cè)向散射光(side scatter， SSC)兩個(gè)參數(shù)組成的散點(diǎn)圖上圈出淋巴細(xì)胞，再在由CD4和SSC兩個(gè)參數(shù)組成的散點(diǎn)圖上圈出CD4+T細(xì)胞，以CD4+T細(xì)胞設(shè)門，分析CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞、CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例；②分析外周血中Tfh細(xì)胞各亞群占CD4+CXCR5+T細(xì)胞比例：先在由FSC和SSC兩個(gè)參數(shù)組成的散點(diǎn)圖上圈出淋巴細(xì)胞，再在由CD4和CXCR5組成的散點(diǎn)圖上圈出CD4+CXCR5+T細(xì)胞，以CD4+CXCR5+T細(xì)胞設(shè)門，分析Tfh1(CXCR3+CCR6-)、Tfh2(CXCR3-CCR6-)以及Tfh17(CXCR3-CCR6+)細(xì)胞占CD4+CXCR5+T細(xì)胞比例。③計(jì)算(Tfh2細(xì)胞比例+Tfh17細(xì)胞比例)/Tfh1細(xì)胞比例的比值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)均呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；NMOSD患者組與健康對(duì)照組計(jì)量資料比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；兩組男女比例比較采用X2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同表型的外周血Tfh細(xì)胞在NMOSD組和健康對(duì)照組中的表達(dá)以CD4+T細(xì)胞設(shè)門，NMOSD組CD4+CXCR5+細(xì)胞及CXCR5+PD-1+細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例均高于健康對(duì)照組(均P<0.05；表1、圖1)。

表1 兩組不同表型外周血Tfh細(xì)胞表達(dá)比較(±s，%)

2.2外周血Tfh細(xì)胞的不同亞群在NMOSD組和健康對(duì)照組中的表達(dá)NMOSD組Tfh1細(xì)胞比例低于健康對(duì)照組(P<0.05)，Tfh17細(xì)胞比例及(Tfh2細(xì)胞比例+Tfh17細(xì)胞比例)/Tfh1細(xì)胞比例的比值高于健康對(duì)照組(均P<0.05)，Tfh2細(xì)胞比例也高于健康對(duì)照組，但兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖2、表2)。

FSC:前向角散射光；SSC：側(cè)向散射光 圖 1 兩組不同表型外周血Tfh細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析圖

FSC：前向角散射光；SSC：側(cè)向散射光 圖 2 兩組外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析圖

組別例數(shù)Tfh1比例(%)Tfh2比例(%)Tfh17比例(%)比值aNMOSD53 2641±4423022±5493070±456241±065健康對(duì)照組203026±3662817±3712733±289188±039t值-3474154330714264P值0001012700030000

注：a(Tfh2細(xì)胞比例+Tfh17細(xì)胞比例)/Tfh1細(xì)胞比例的比值

3 討論

目前認(rèn)為NMOSD主要致病機(jī)制為自身反應(yīng)性抗AQP4抗體(AQP4-IgG)與AS突觸表面AQP4蛋白結(jié)合后，激活補(bǔ)體，導(dǎo)致血-腦屏障破壞、AS細(xì)胞損傷及繼發(fā)脫髓鞘病變[12]，致病性自身抗體AQP4-IgG的異常產(chǎn)生在NMOSD的病理發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要。該抗體是由漿細(xì)胞產(chǎn)生的，此過(guò)程依賴于T細(xì)胞的幫助。Tfh作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的T淋巴細(xì)胞亞群，在生發(fā)中心(germinal centre，GC)形成，直接輔助于B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，是體液免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中的重要因素，Tfh異常增多或相關(guān)效應(yīng)分子異常表達(dá)可以導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[3]。CXCR5是識(shí)別Tfh細(xì)胞最常用的標(biāo)志分子，CXCR5可以輔助Tfh細(xì)胞從淋巴組織中的T細(xì)胞區(qū)域遷移出來(lái)并進(jìn)入B細(xì)胞濾泡[3]，這種移動(dòng)對(duì)于CD4+T細(xì)胞定位于鄰近的原始B細(xì)胞并輔助其產(chǎn)生抗體至關(guān)重要。PD-1調(diào)節(jié)生發(fā)中心B細(xì)胞的存活和選擇，是漿細(xì)胞形成的必要因素[13]。因此常用CD4+CXCR5+T細(xì)胞和CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞來(lái)定義Tfh細(xì)胞。傳統(tǒng)意義上的Tfh細(xì)胞位于次級(jí)淋巴組織的GC中，隨著對(duì)Tfh細(xì)胞的認(rèn)識(shí)，在人外周血中也檢測(cè)到表型為CD4+CXCR5+，并與GC-Tfh功能相似的Tfh細(xì)胞[14]，包括Tfh1、Tfh2、Tfh17三個(gè)亞群。研究顯示，Tfh2和Tfhl7可有效誘導(dǎo)幼稚B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，而Tfh1則無(wú)此功能[4]。近年來(lái)的研究表明Tfh細(xì)胞可能參與神經(jīng)免疫疾病的發(fā)病機(jī)制[15-16]，但僅有少量有關(guān)Tfh細(xì)胞及其相關(guān)分子在NMOSD患者中表達(dá)情況的研究報(bào)道，且其結(jié)論尚存在著分歧[5-6]，這提示仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)驗(yàn)證Tfh細(xì)胞在NMOSD發(fā)病中的變化。

本研究通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞和CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在NMOSD患者外周血中兩種不同表型的Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例均明顯高于對(duì)照組。之前Li等[5]研究指出NMOSD患者外周血中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞比例較健康對(duì)照和多發(fā)硬化患者明顯增高，這與本研究結(jié)果一致；FAN等[6]研究顯示NMOSD患者ICOS+外周血記憶Tfh細(xì)胞比例較健康對(duì)照明顯增高，而PD-1+外周血記憶Tfh細(xì)胞比例與健康對(duì)照比較無(wú)明顯差異，這與本研究結(jié)果不一致。分析這兩項(xiàng)研究結(jié)果不同的原因可能是選取的樣本量都比較小，并且樣本之間存在異質(zhì)性，在后續(xù)的研究中我們會(huì)繼續(xù)增加樣本量進(jìn)一步深入研究。由于Tfh細(xì)胞可以輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，NMOSD患者外周血Tfh細(xì)胞比例明顯升高，對(duì)B細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)強(qiáng)的輔助信號(hào)，這有可能是NMOSD患者B細(xì)胞的過(guò)度活化及自身抗體的大量產(chǎn)生而造成體液免疫紊亂的直接原因之一。

有研究報(bào)道外周血Tfh細(xì)胞中Tfh1、Tfh2、Tfh17三個(gè)亞群在某些自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中出現(xiàn)比例失調(diào)[7-10]。然而這三個(gè)亞群在NMOSD患者中是否會(huì)出現(xiàn)比例失調(diào)尚不清楚。既往研究發(fā)現(xiàn)，外周血Tfh細(xì)胞這三個(gè)亞群中只有Tfh2和Tfh17 細(xì)胞具有傳統(tǒng)Tfh細(xì)胞的功能并可以誘導(dǎo)初始B細(xì)胞分化成熟并產(chǎn)生抗體[4]。本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照比較，NMOSD患者Tfh17細(xì)胞亞群占Tfh細(xì)胞的比例增高；Tfh2細(xì)胞亞群也呈增高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Tfh1細(xì)胞亞群比例明顯低于健康對(duì)照組，而且(Tfh2細(xì)胞比例+Tfh17細(xì)胞比例) /Tfh1細(xì)胞比例的比值顯著高于健康對(duì)照組。以上結(jié)果提示在NMOSD疾病活動(dòng)期也存在著這三個(gè)亞群的比例失調(diào)。另外，有研究報(bào)道在外周循環(huán)Tfh細(xì)胞中，Tfh17細(xì)胞的比率在免疫缺陷的情況下會(huì)明顯下降，提示其在輔助B細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要作用[17]，并且多篇報(bào)道指出Tfh17可能參與一些自身免疫性疾病的發(fā)病[7，9-10]。本研究觀察到NMOSD患者中Tfh17顯著升高，推測(cè)Tfh17與NMOSD發(fā)病有一定關(guān)系，可能通過(guò)有效地誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體引起NMOSD的發(fā)病。此外，不容忽視的是Tfh2細(xì)胞亞群也呈增高的趨勢(shì)，一項(xiàng)對(duì)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中Tfh細(xì)胞三個(gè)亞群的研究發(fā)現(xiàn)患者組Tfh2和Tfh17比例較健康對(duì)照均增高，但只有Tfh2比例與疾病活動(dòng)度、IgG表達(dá)水平呈正相關(guān)，推測(cè)Tfh2在發(fā)病中起著關(guān)鍵作用[8]，對(duì)此有待于后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，NMOSD患者外周血Tfh17細(xì)胞比例高于健康對(duì)照，而且NMOSD疾病活動(dòng)期存在著Tfh細(xì)胞三個(gè)亞群的比例失調(diào)，推測(cè)Tfh 細(xì)胞與NMOSD的發(fā)病存在一定關(guān)系。上述發(fā)現(xiàn)對(duì)于從新的視角探索NMOSD的發(fā)病機(jī)制和治療方法可能具有一定的積極意義。

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ConstitutivelyalteredfrequenciesofcirculatingfollicularhelperTcellandtheirsubsetsinneuromyelitisopticaspectrumdisorders

YANGBinbin，WUQian，SUNLin，YUDi，LIULei，QIAOZhixin，WANGJiawei*.

*MedicalResearchCenter，TongrenHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100730，China;DepartmentofNeurology，TongrenHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100730，China

WANG Jiawei， Email：wangjwcq@163. com

ObjectiveThe study was aimed at exploring the relationship between Tfh cells and the pathogenesis of neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD)by studying the expression of Tfh in the peripheral blood of NMOSD patients.MethodsBy the means of flow cytometry， the percentages of different phenotypes of Tfh cells and three distinct Tfh cell subsets( Tfh1， Tfh2 and Tfh17 )in the peripheral blood of 53 NMOSD patients with acute episodes(NMOSD group)and 20 sex and age-matched healthy controls(control group)were examined.ResultsThe percentages of CD4+CXCR5+Tfh cells and CD4+CXCR5+PD-1+Tfh cells among CD4+T cells was significantly increased in the peripheral blood of the NMOSD group compared with control group，[(22.80±6.78)%vs.(18.94±3.84)%，P=0.003；(9.54±3.29)%vs.(4.21±1.31)%，P=0.000；respectively]. Among CD4+CXCR5+T cells， the percentage of Tfh17 cell subset〔(30.70±4.56)%〕in the NMOSD group was significantly higher than that in the control group[(27.33±2.89)%](P=0.003)，while the percentage of Tfh1 cell subset[(26.41±4.42)%]in the NMOSD group was lower than that in the control group〔(30.26±3.66)%〕(P=0.001). In addition，the percentage of Tfh2 cell subset in the NMOSD group showed no significant statistical difference by compared with the control group (P=0.127). Moreover， the ratio of (%Tfh2 + %Tfh17)/%Tfh1 in the NMOSD group was found to be significantly higher that than in the control group(2.41±0.65vs.1.88±0.39，P=0.000).ConclusionsIn acute episodes， the percentage of Tfh cells increased significantly in the peripheral blood of the NMOSD patients. At the same time， the balance of three Tfh cell subsets (Tfh1， Tfh2 and Tfh17) was altered in NMOSD patients， especially the percentage of Tfh17 cell subset was significantly increased. These data indicats that certain relationship exists between Tfh cells and the pathogenesis of NMOSD.

neuromyelitis optica spectrum disorders; T follicular help cell(Tfh); CXC chemokine receptor 5; programmed death 1

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.06.002

100730 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院：中心實(shí)驗(yàn)室(楊彬彬、郁迪、喬志新、王佳偉)，神經(jīng)內(nèi)科(吳茜、孫林、劉磊、王佳偉)

王佳偉，Email：wangjwcq@163. com

R744.5+2

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1006-2963(2017)06-0385-05

2017-05-09)

鄒晨雙)