低溫臭氧處理對草莓灰霉菌和枯萎菌的抑制活性及其品質(zhì)的影響

王振華+蔡萬倫+尚吟竹

摘要：以臭氧作為熏蒸劑，在4 ℃低溫條件下設(shè)置不同劑量（10、20、40 mg/L）處理2 h，對草莓上灰霉病菌（Botrytis cinerea）、枯萎病菌（Fusarium oxysporum）進(jìn)行室內(nèi)抑制效果測定。在同樣溫度下，以25 mg/L的臭氧劑量熏蒸2 h，對儲藏不同時間（0、4、8、16 d）的草莓進(jìn)行品質(zhì)（硬度、可溶性固形物含量、維生素C及總酸度）測定。結(jié)果表明，隨著處理濃度的提高，臭氧處理后的草莓爛果率分別為9.23%、3.33%、1.28%（枯萎?。┖?0.92%、4.17%、0.83%（灰霉?。?，均極顯著低于相應(yīng)的對照處理（35.99%、32.82%）。4種草莓的硬度隨儲藏時間延長變化不顯著，臭氧處理與對照間差異也不顯著；臭氧熏蒸后4種草莓的可溶性固形物含量、維生素C含量、總酸度在儲藏16 d后均極顯著高于對應(yīng)品種的對照；爛果率極顯著低于對照。

關(guān)鍵詞：臭氧；熏蒸活性；灰霉病菌（Botrytis cinerea）；枯萎病菌（Fusarium oxysporum）；品質(zhì)

中圖分類號：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）22-4309-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.22.025

Abstract： At 4 ℃， the two-hours fumigant was conducted at the dose of 10，20，40 mg/L for assessing the impact of ozone on Fusarium oxysporum and Botrytis cinerea from strawberry field， and the quality of strawberry （hardness，soluble solids content（SSC），VC content and titratable acid（TA）） was figured out at the 0，4，8，16-days storage after the two-hours fumigant by the 25 mg/L of ozone. Results showed that the decay rates of strawberry on the ozone treatment were 9.23%，3.33%，1.28%（Fusarium oxysporum，on the order of dose），and 10.92%，4.17%，0.83%（Fusarium oxysporum），and these were significant lower than those on the control（35.99% and 32.82%，respectively）. After the two-hours fumigant，the hardness of strawberry had no significant difference between ozone treatments and the control by the storage time going. However，the VC，SSC，TA of the strawberry on the treatment were higher than those on the control，but the decay rate on the ozone treatment was significantly lower.

Key words： ozone； fumigant toxicity； Botrytis cinerea； Fusarium oxysporum； quality

草莓枯萎病與灰霉病是草莓生產(chǎn)中的常見病害。其中灰霉病屬于低溫高濕型病害，病原菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），其生長溫度在2～30 ℃，當(dāng)溫度為20～25 ℃、濕度持續(xù)保持90%以上時高發(fā)[1]。能侵染葉、花、果、莖，侵染果實時能導(dǎo)致10%～50%的減產(chǎn)[2]。由于是氣傳病害，很難將其徹底在種植區(qū)域內(nèi)根治。草莓枯萎病的病原是尖孢鐮刀菌草莓專化型（Fusarium oxysporum Schlecht. f. sp. fragariae Winks et Williams），草莓枯萎病菌主要侵害根部，在苗期癥狀不明顯，主要表現(xiàn)在開花期至收獲期。目前已成為草莓種植區(qū)主要土傳病害之一。發(fā)病率在10%～35%。染病草莓輕者結(jié)果少，品質(zhì)差，重者枯死絕收[3，4]。由于兩種病害在防治上均屬于難以根治的類型，導(dǎo)致防治往往陷入長期使用大量化學(xué)農(nóng)藥的惡性循環(huán)和殺菌劑抗性增長[5，6]。因此，近年來，研究者多從植物源或者生物源去尋找替代物進(jìn)行防治[7-9]。

臭氧是一種具有極高氧化性的化學(xué)物質(zhì)，很早就被人類用來進(jìn)行食品保鮮，消毒殺菌處理[10，11]。臭氧近年來也被研究者引入草莓保鮮冷藏領(lǐng)域，并且獲得了成功[12，13]。但是，尚少見以檢疫處理為目的，在綜合考慮各種草莓有害生物（病害）基礎(chǔ)上，開展相應(yīng)的臭氧熏蒸研究。本研究以臭氧和低溫為兩種處理因子，探討其對常見草莓病害枯萎病與灰霉病的熏蒸活性，以期在草莓進(jìn)出口貿(mào)易中建立一種高效的替代溴甲烷熏蒸的檢疫處理技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

通風(fēng)廚，武漢新天第實驗設(shè)備有限公司；控溫冷柜（-2～10 ℃）、GSP醫(yī)藥專用柜，浙江華美冰箱有限公司；臭氧發(fā)生器（SOZ-30C型），SPRING；手持式臭氧檢測儀（0～5 000 mg/L，PN-5000-EX），深圳市鵬雷科技有限公司；1 L氣體采集袋（Tedlar？誖（泰德拉）PVF氣體采樣袋），大連海得科技有限公司；1 L自制氣體熏蒸瓶：網(wǎng)購1 L帶橡膠塞廣口玻璃瓶，在橡膠塞上圓心處鉆出一個直徑8 mm的孔，插入一根直徑8 mm長10 cm的玻璃管即為出氣孔或進(jìn)氣孔；5 L自制氣體熏蒸箱：網(wǎng)購5 L塑料整理箱，在蓋上通過鉆孔安裝上2個進(jìn)氣閥門（取自上述氣體采樣袋上的閥門），一個用于散氣，另一個用于充氣；直徑4 mm或8 mm的硅膠管，二通閥、三通閥若干；溫濕度計、計時器、200 mL注射器各一個；UV752型紫外-可見分光光度計，上海奧譜勒儀器有限公司；PAL-1數(shù)顯手持糖度儀，ATAGO（愛宕）中國分公司。FT02型果實硬度計，邢臺潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司；PE整理箱，5 L容積，購自當(dāng)?shù)厥袌觥?

試劑（NaOH、Cu（NO3）2、HCl、草酸）均為分析純，購自國藥集團。

1.2 供試材料

由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所提供草莓灰霉病菌、枯萎病菌的菌懸液，濃度為106 CFU/mL。使用時，用無菌水稀釋10倍使用。

供試鮮果品種為法蘭地、紅顏、晶玉、晶瑤，從湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所草莓基地采摘8成熟大小一致的完好鮮果（長約4 cm，果徑3 cm），利用冷藏盒盡量保證不受損，運回實驗室。采摘24 h內(nèi)進(jìn)行各項研究。

1.3 方法

1.3.1 低溫臭氧熏蒸處理對草莓枯萎病菌、灰霉病菌的抑制活性 參照喬彩云[11]的方法，制備1.2 mg/L的臭氧水，將采摘回的鮮果浸泡于臭氧水進(jìn)行表面消毒5 min，然后平鋪于帶有吸水紙的白瓷盤上（白磁盤38 cm×25 cm，約50個），整體置于超凈工作臺晾干60 min，以備熏蒸使用。

分別用裝有20 mL的106 CFU/mL灰霉病菌或枯萎病菌菌懸液微型噴霧器對白瓷盤中的草莓果噴霧，使20 mL菌懸液均勻分布于各個草莓果上。室溫晾干30 min。然后每5個置于一個1 L自制的熏蒸瓶中。充入適量體積的標(biāo)準(zhǔn)臭氧氣體，分別獲得10、20、40 mg/L臭氧熏蒸濃度。然后置于2 ℃冰柜中熏蒸2 h。熏蒸結(jié)束后，拿出熏蒸瓶散氣5 min，敞口繼續(xù)置于冰柜中冷藏保存，10 d后檢查爛果數(shù)目，果實上存在1個爛（霉）斑，且直徑超過0.1 cm即為爛果。以噴過菌懸液未做熏蒸處理的草莓果作為空白對照。每一批次每個濃度重復(fù)6個熏蒸瓶，重復(fù)試驗3個批次。

1.3.2 低溫臭氧熏蒸對草莓品質(zhì)的影響 以后續(xù)品質(zhì)參數(shù)測定所需鮮果數(shù)為計算依據(jù)，確定熏蒸處理的每個品種所需總果數(shù)（每種約10×3×4，其中10個為一個熏蒸重復(fù)，重復(fù)3次，4個抽樣時間）。

在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，以5 L整理箱為熏蒸容器，確定獲得25 mg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)臭氧通氣時間。然后進(jìn)行正式2 h熏蒸試驗。即將4個品種草莓果每種10個共40個為一組置于整理箱中，充入25 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)臭氧氣體，置于4 ℃冰柜中熏蒸2 h，散氣10 min，后繼續(xù)放入冰柜中冷藏即為一個重復(fù)，重復(fù)12組，冷藏0、4、8、16 d，分別隨機取3個熏蒸箱的果實進(jìn)行品質(zhì)鑒定。冷藏結(jié)束時，統(tǒng)計最終時刻各個處理的爛果率。

用FT02型果實硬度計測量，取草莓切開，測量其赤道部位的硬度，每次取10個果實進(jìn)行測定。測完的果實研磨出果漿，用于下面各個參數(shù)的測定?？扇苄怨绦挝镉肞AL-1手持糖度計測定；參照劉艷芳等[14]的方法，利用紫外分光光度計進(jìn)行維生素C含量測定；可滴定酸含量測定參照陳屏昭等[15]的方法。果實TA以檸檬酸計，迅速稱取10.0 g果漿轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用無菌水定容至刻度，搖勻，靜置30 min后過濾，用標(biāo)定的0.1 mol/L的NaOH進(jìn)行滴定，滴定至溶液初顯粉紅色并在0.5 min內(nèi)不褪色為終點（pH約8.2）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

合并每個批次同一個處理的6個熏蒸瓶爛果數(shù)，爛果率即為總爛果數(shù)/總處理果數(shù)（5×6=30）×100%，共3個批次試驗，即每個處理最后得到3次爛果率的重復(fù)數(shù)據(jù)。利用SPSS 14軟件，對不同濃度臭氧熏蒸處理的爛果率及品質(zhì)參數(shù)分別進(jìn)行單因素方差分析，利用Turkey法在0.05水平上檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，不同處理間的爛果率差異極顯著（枯萎病菌：F3，12=1 531.10，P<0.000 1；灰霉病菌：F3，12=86.27，P<0.000 1）。病原菌導(dǎo)致的爛果率隨著臭氧處理濃度的提高迅速降低，當(dāng)臭氧濃度達(dá)到40 mg/L時，2種病原菌導(dǎo)致的爛果率在1.5%以下，對應(yīng)的不處理對照在30%左右。

25 mg/L臭氧處理后，不同儲藏時間下4種（法蘭地、紅顏、晶玉、晶瑤）草莓果的硬度變化動態(tài)見圖1。由圖1可以看出，臭氧熏蒸與對照處理的4種草莓果隨著儲藏時間的延長，果實硬度均呈下降趨勢，從儲藏4 d后，果實硬度又開始上升。但臭氧熏蒸后16 d，4個品種草莓果的硬度均與對應(yīng)品種的對照處理差異不顯著。

25 mg/L臭氧處理后，不同儲藏時間下4種（法蘭地、紅顏、晶玉、晶瑤）草莓果的可溶性固形物含量變化動態(tài)見圖2。由圖2可以看出，臭氧熏蒸與對照處理的4種草莓果隨著儲藏時間的延長，果實可溶性固形物含量總體呈下降趨勢。但臭氧熏蒸后16 d，4種草莓果的可溶性固形物含量均極顯著高于對應(yīng)品種的對照處理（依次為：F1，4=7.73，29.57，17.56， 14.12；P=0.05，0.01，0.01，0.02），表明臭氧能顯著延緩果實可溶性固形物下降的趨勢。

25 mg/L臭氧處理后，不同儲藏時間下4種（法蘭地、紅顏、晶玉、晶瑤）草莓果的維生素C含量變化動態(tài)見圖3。由圖3可以看出，臭氧熏蒸與對照處理的4種草莓果隨著儲藏時間的延長，果實維生素C含量總體呈下降趨勢，8 d前維生素C含量變動極小，8 d后開始迅速下降。但臭氧熏蒸后16 d，4種草莓果的維生素C含量均極顯著高于對應(yīng)品種的對照處理（依次為：F1，4=55.65，102.33，267.17，50.95； P=0.00，0.00，0.00，0.00），表明臭氧能顯著延緩草莓果中維生素C含量下降的趨勢。

25 mg/L臭氧處理后，不同儲藏時間下4種（法蘭地、紅顏、晶玉、晶瑤）草莓果中可滴定酸含量變化見圖4。從圖4可以看出，臭氧熏蒸與對照處理的4個品種草莓果隨著儲藏時間的延長，可滴定酸含量整體呈下降趨勢。但臭氧熏蒸后16 d，4種草莓果中可滴定酸含量均極顯著高于對應(yīng)品種的對照處理（依次為F1，4=17.78，8.34，42.25，0.78；P=0.01，0.04，

0.00，0.43），表明臭氧能顯著延緩草莓果中可滴定酸含量下降的趨勢。

經(jīng)臭氧處理后，儲藏16 d的草莓果，不僅品質(zhì)參數(shù)下降得到極大延緩，而且還顯著降低了草莓果的爛果率（F1，4=687.02，2 054.96，648.11，1 468.21；P<0.000 1）。由表2可以看出，4種草莓果經(jīng)4 ℃下25 mg/L臭氧處理后，儲藏16 d的最高爛果率不超過2.1%，極顯著低于對應(yīng)的對照組50%以上的爛果率，表明臭氧處理能極大延緩草莓品質(zhì)劣變的趨勢。

3 討論

臭氧殺滅微生物的機理是作用于細(xì)胞膜，致細(xì)胞膜的通透性增加，胞內(nèi)物質(zhì)外流而使細(xì)胞失去活性，破壞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的遺傳物質(zhì)使其失去功能。因此，從接觸臭氧分子直接程度而言，較高等生物（如昆蟲）比微生物更加耐受臭氧[10]。近些年的臭氧保鮮研究表明，臭氧在21 mg/m3時就能很好抑制爛果的發(fā)生[13]。本研究的最高處理濃度40 mg/L相當(dāng)于90 mg/m3，其對草莓常見病原抑制效果達(dá)到96%以上。結(jié)合草莓上害蟲熏蒸活性研究來看，要達(dá)到檢疫處理的效果，使用臭氧工作濃度將遠(yuǎn)高于本研究所使用的臭氧濃度，故未來考慮建立草莓進(jìn)境檢疫熏蒸技術(shù)規(guī)程時，應(yīng)優(yōu)先考慮殺滅昆蟲而不是病原微生物。

草莓采收后的經(jīng)濟價值直接與其儲藏品質(zhì)相關(guān)，其硬度、可溶性固形物、維生素C、可滴定酸含量是衡量果實品質(zhì)最直接參數(shù)。一般而言，鮮草莓的貨架期在7 d左右，隨著儲藏時間的延長，各項品質(zhì)參數(shù)會迅速下降[12，13]。本研究結(jié)果表明，4 ℃低溫儲藏，即使不做任何處理，前期（8 d以前）各項品質(zhì)參數(shù)變動都非常小（圖1-圖4），8 d后各項品質(zhì)參數(shù)下降幅度將迅速提高，而經(jīng)高濃度（25 mg/L）臭氧處理后，則極顯著降低了品質(zhì)劣變的速率，使儲藏超出正常草莓貨架期2倍時，還能保證爛果率不高于2.1%，表明臭氧結(jié)合低溫聯(lián)合處理非常適合處理草莓，能有效延長草莓果的儲藏時間，提高效益。

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