基于HPLC法的桑源DNJ測定方法研究

劉青茹，劉 婧，諶 珍，周春江，王佳穎，王 彬

（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016）

基于HPLC法的桑源DNJ測定方法研究

劉青茹，劉 婧，諶 珍，周春江，王佳穎，*王 彬

（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016）

建立了基于HPLC的桑源DNJ定量分析方法，在樣品前處理時(shí)選擇料液比2∶20（g∶mL），提取時(shí)間25 min，提取次數(shù)2次作為最優(yōu)前處理?xiàng)l件。該方法在DNJ質(zhì)量濃度0.3～50.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7；LOD和LQD分別為0.3，1.0 μg/mL；重現(xiàn)性試驗(yàn)的RSD小于5.0%，表明該檢測方法的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較好，適于桑源DNJ的實(shí)際檢測。

高效液相色譜；1-脫氧野尻霉素；桑葉

0 引言

桑葉（Mulberry Leaf）是?？浦参锷５娜~，我國桑樹種植廣泛，有較豐富的桑葉資源。桑葉傳統(tǒng)用途主要是養(yǎng)蠶和入藥，衛(wèi)生部早在1993年就將桑葉列為“藥食兩用”植物。桑葉營養(yǎng)保健功能非常全面，有關(guān)功能化學(xué)研究表明其含有黃酮類、生物堿、桑葉多糖等多種活性物質(zhì)，其中，1-脫氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin，DNJ） 作為特色活性因子，具有降血糖生理活性，在糖尿病、肥胖、病毒感染等方面也顯示出明顯的藥理作用[1-3]，近年來，關(guān)于DNJ方面的研究和開發(fā)越來越多，建立操作簡單、準(zhǔn)確性好的檢測方法顯得非常必要。目前已有報(bào)道采用柱前衍生化-高效液相色譜法測定桑葉中的DNJ[4-5]，該法采用鹽酸提取DNJ，并用芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）作為衍生劑，檢測速度快、靈敏度較高、重現(xiàn)性好，但樣品前處理中DNJ提取效率還有待提升，為此，針對(duì)桑葉基質(zhì)特性，優(yōu)化樣品前處理方法，試驗(yàn)以FMOC-Cl為衍生劑構(gòu)建DNJ定量分析方法，為桑葉中DNJ的監(jiān)測和控制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所選綠茶樣品取自我國山東煙臺(tái)茶區(qū)，于4℃下貯存。

1.2 試劑與設(shè)備

DNJ標(biāo)準(zhǔn)品（≥95%）、芴甲氧羰酰氯（FMOCCl，≥98%）、甘氨酸（≥99%），均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鉀、硼酸、氯化鈉、醋酸等，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；試驗(yàn)用水均為超純水，由美國Millipore公司的Milli-Q水純化系統(tǒng)制備。

高效液相色譜儀（配有Waters 1525泵、Waters 717plus自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters2475熒光檢測器）、Waters SunfireTM反相C18色譜柱 （250 mm×3 mm，5 μm），美國Waters公司產(chǎn)品；DFT-100型手提式高速萬能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；3K15型高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；DHG-9070A型烘箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋等均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器或設(shè)備。

1.3 DNJ定量分析方法的建立

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.5 g干燥的桑葉粉末于10 mL離心管中，加入5 mL0.05 moL/L的鹽酸溶液，渦旋混合30 s，于30℃條件下超聲提取25 min，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心15 min，取上清液，殘?jiān)偌尤? mL 0.05 mol/L的鹽酸溶液，同前重復(fù)提取1次，合并2次提取液，置25 mL容量瓶中加蒸餾水定容，備用。

（1） 衍生、上樣。取上述提取液20 μL于1.5 mL離心管中，加20 μL硼酸鹽緩沖液（pH值8.5），再加入30 μL 5 mmol/L FMOC-Cl的乙腈溶液，混勻后于20℃條件下水浴反應(yīng)20 min，之后加入20 μL 0.1 mol/L的甘氨酸，讓剩余的衍生化試劑反應(yīng)5 min以終止反應(yīng)，最后加入910 μL 0.1%（V/V） 的醋酸水溶液，混勻后用0.45 μL的一次性針頭過濾器過濾后，取10 μL進(jìn)樣分析。

（2） 色譜條件：高效液相色譜儀（配有Waters 2475熒光檢測器），Waters SunfireTM反相C18色譜柱（250 mm×3 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.1%醋酸，流動(dòng)相B為乙腈，體積比45∶55（V/V）；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25℃，熒光檢測波長λ激為254 nm、λ發(fā)為322 nm。

1.3.3 定量分析

準(zhǔn)確稱取0.02 g DNJ標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，蒸餾水定容，得0.2 mg/mL DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液為儲(chǔ)備液，以此為基礎(chǔ)分別配制質(zhì)量濃度為0.2，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/mL的DNJ系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱中保存。

以標(biāo)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)樣峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求曲線線性回歸方程，由此計(jì)算樣品中DNJ的含量。

1.4 前處理方法研究

以樣品中DNJ提取率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)考查料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)這3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響，料液比分別設(shè)為1∶20，2∶20，3∶20，4∶20，5∶20（g∶mL），提取時(shí)間分別設(shè)為 5，15，25，35，45 min，提取次數(shù)分別設(shè)為1，2，3次。

1.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

對(duì)同一樣品按照優(yōu)化后的前處理、衍生方法平行制備6份，在上述色譜條件下測定其DNJ含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)，取其平均值進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用x±s表示。

因此在教學(xué)的過程中應(yīng)該對(duì)職業(yè)環(huán)境進(jìn)行適當(dāng)?shù)哪M，采用情境教學(xué)的方式對(duì)教學(xué)的內(nèi)容進(jìn)行講解以及操作。例如：在進(jìn)行“前廳”這段內(nèi)容的教學(xué)過程中，教師可以首先將相關(guān)的知識(shí)向?qū)W生講述，再布置任務(wù)，對(duì)教學(xué)的情境進(jìn)行模擬，可以采用小組學(xué)習(xí)的形式，對(duì)客房推銷、預(yù)定接受、入住辦理等的任務(wù)進(jìn)行模擬完成。在模擬實(shí)踐的過程中，可以將教室模擬成星級(jí)酒店，將教室的講臺(tái)作為酒店的前臺(tái)，讓學(xué)生在實(shí)踐教學(xué)之中進(jìn)行相應(yīng)角色的扮演。并且要在實(shí)踐教學(xué)的過程中對(duì)現(xiàn)實(shí)中的各種情境加以模擬，使學(xué)生在進(jìn)行實(shí)踐的過程中對(duì)酒店工作的環(huán)境實(shí)現(xiàn)真實(shí)的感受，這樣就可以使其對(duì)因?yàn)榧寄軐?shí)現(xiàn)良好的把握，做到學(xué)以致用。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

（1） 采用0.05 moL/L的鹽酸溶液提取桑葉中的DNJ，在提取時(shí)間45 min，提取次數(shù)2次條件下，考查了料液比對(duì)DNJ提取率的影響。

料液比對(duì)桑葉DNJ提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)桑葉DNJ提取率的影響

由圖1可知，料液比2∶20（g∶mL） 時(shí)DNJ提取率達(dá)0.11%，繼續(xù)增大料液比后提取率變化趨緩，且樣品分散難度增大，標(biāo)準(zhǔn)偏差增大，故以料液比2∶20 （g∶mL） 最好。

（2） 在料液比2∶20（g∶mL），提取次數(shù)2次條件下，考查提取時(shí)間對(duì)DNJ提取率的影響。

提取時(shí)間對(duì)桑葉DNJ提取率的影響見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)桑葉DNJ提取率的影響

由圖2可知，在5～25 min，DNJ提取率隨時(shí)間延長而升高，25 min時(shí)達(dá)到最大值，隨著時(shí)間繼續(xù)延長，提取率反而出現(xiàn)下降，可能因?yàn)镈NJ的自由羥基長時(shí)間與空氣中的氧氣接觸發(fā)生了氧化降解[4]。

（3） 在料液比2∶20（g∶mL），提取時(shí)間25 min條件下，考查提取次數(shù)對(duì)DNJ提取率的影響規(guī)律。

提取次數(shù)對(duì)桑葉DNJ提取率的影響見圖3。

圖3 提取次數(shù)對(duì)桑葉DNJ提取率的影響

由圖3可知，隨提取次數(shù)的增加，DNJ提取率增加，且標(biāo)準(zhǔn)偏差顯著降低，提取2次和3次相比DNJ提取率差異不顯著。為此，選取料液比2∶20（g∶mL），提取時(shí)間25 min，提取次數(shù)2次作為最優(yōu)前處理?xiàng)l件。

2.2 柱前衍生高效液相色譜法測定桑源DNJ

HPLC方法檢測DNJ的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表1，DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

表1 HPLC方法檢測DNJ的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

圖4 DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線

DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=21 252 X+11 330，R2=0.999 7，線性范圍為0.3～50.0 μg/mL，線性關(guān)系良好。

標(biāo)樣中DNJ液相色譜見圖5，桑葉樣品中DNJ液相色譜見圖6。

圖5 標(biāo)樣中DNJ液相色譜

圖6 桑葉樣品中DNJ液相色譜

由圖5～圖6可知，標(biāo)樣和樣品中DNJ的保留時(shí)間均在3.7～3.9 min，保留時(shí)間較一致。根據(jù)DNJ低含量樣品色譜圖，依據(jù)信噪比S/N=3推算出該方法的LOD值約為0.3 μg/mL，依據(jù)信噪比S/N=10推算出該方法的LOQ值約為1.0 μg/mL。

2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

同批桑葉中取6份樣品做平行處理，測定其DNJ含量。

重現(xiàn)性試驗(yàn)見表2。

表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)/ng·g-1

由圖2可知，DNJ含量平均值為0.605 ng/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） =2.41%（n=6），表明該方法重現(xiàn)性較好。

3 結(jié)論與討論

建立了基于HPLC的桑源DNJ定量分析方法，在樣品前處理時(shí)選擇0.50 g樣品用5 mL 0.05 moL/L的鹽酸溶液超聲（功率80%）提取25 min，重復(fù)2次作為最優(yōu)前處理?xiàng)l件。該方法在DNJ 0.3～50.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 87；LOD和LQD分別為0.3，1.0 μg/mL；重現(xiàn)性試驗(yàn)的RSD小于5.0%，表明該檢測方法的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較好，適于桑源DNJ的實(shí)際檢測。

[1]楊海霞.桑葉中DNJ分離純化及含量測定的研究 [D].杭州：浙江大學(xué)，2003.

[2]殷浩.桑樹和家蠶對(duì)DNJ的富集規(guī)律及桑籽降血糖作用研究 [D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[3]王鵬，梁明，張秀麗，等.桑樹DNJ提取、純化和檢測的研究進(jìn)展 [J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2011，30（12）：5-9.

[4]歐陽臻，陳鈞.不同季節(jié)桑葉中1-脫氧野尻霉素（DNJ）含量的測定 [J].食品科學(xué)，2004，25（10）：211-214.

[5]蔣運(yùn)鋼，賈俊強(qiáng)，桂仲爭.響應(yīng)面分析法優(yōu)化家蠶1-脫氧野尻霉素的稀酸浸提工藝 [J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（4）：703-710.

Study on the Determination of DNJ in Mulberry Leaf by HPLC Method

LIU Qingru，LIU Jing，SHEN Zhen，ZHOU Chunjiang，WANG Jiaying，*Wang Bin（Hangzhou Tea Research Institute，CHINA COOP，Hangzhou，Zhejiang 310016，China）

In this study，the quantitative analysis method of 1-Deoxynojirimycin （DNJ） in mulberry leaf was constructed based on HPLC method.The results showed that the optimum ratio of material to liquid was 2∶20 （g∶mL），the extraction time was 25 min，and the extraction time was two times during sample preparation.The calibration curves of DNJ showed a good linearity in the range of 0.3～50.0 μg/mL，with the correlation coefficient was 0.999 7.LOD and LQD were 0.3 μg/mL and 1.0 μg/mL respectively.RSD value of repeatability was less than 5.0%.It showed that this method had good accuracy，stability and repeatability.It was suitable for actual detection of DNJ in mulberry leaf.

HPLC；1-Deoxynojirimycin；mulberry leaf

S888

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.037

1671-9646（2017） 11b-0037-03

2017-09-07

杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20152231E11）。

劉青茹（1991— ），女，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)椴栀Y源多元化利用。*

王 彬（1980— ），男，博士，副研究員，研究方向?yàn)椴栀Y源多元化利用。