好食脈孢菌發(fā)酵醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的工藝研究

王倩男，辛嘉英，鄭洛昀，陳書明，李家柔

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150076；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西晉中 030800）

好食脈孢菌發(fā)酵醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的工藝研究

王倩男1，*辛嘉英1，鄭洛昀1，陳書明2，李家柔1

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150076；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西晉中 030800）

以原本廢棄的醋糟為主要原料，通過好食脈孢菌發(fā)酵醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素，從而提高醋糟的營養(yǎng)價值，使其成為可食用的飼料，繼而達(dá)到廢物利用的效果。先確定醋糟的主要營養(yǎng)成分，再以類胡蘿卜素含量為測定指標(biāo)，考查了不同發(fā)酵條件對好食脈孢菌發(fā)酵醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響，分別篩選出培養(yǎng)基中最佳氮源及最佳氮源的添加量、確定最佳的水分添加量、培養(yǎng)基最佳pH值、培養(yǎng)基最優(yōu)初裝量及接種量。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，經(jīng)正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)條件，確定最佳反應(yīng)條件為氮源豆渣添加量12%，水添加量9 mL/12 g，培養(yǎng)基pH值6，培養(yǎng)基初裝量12 g/250 mL，接種量4 mL，在此條件下類胡蘿卜素含量可達(dá)117.68 μg/g。

好食脈孢菌；醋糟；類胡蘿卜素

醋糟利用方式主要是作為飼料和培養(yǎng)基原料[1]，如作為飼料，醋糟主要用于制備動物的日糧而被直接應(yīng)用，這樣還可替代一部分其他飼料，降低了成本[2]。醋糟中粗纖維含量較高，在生產(chǎn)加工后可回收利用，如果飼喂動物，適口性會較差，且其營養(yǎng)物質(zhì)利用率太低，醋糟中纖維素結(jié)構(gòu)緊密，微生物難以降解，所以醋糟的再利用對降低環(huán)境污染也有著重要意義[3-4]。

通過用好食脈孢菌發(fā)酵醋糟，好食脈孢菌酶系廣泛，主要由纖維素酶、糖化酶和蛋白酶等組成[5]，其可以充分利用醋糟中的營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是其中大量的碳源，產(chǎn)生類胡蘿卜素，人們通常了解到的類胡蘿卜素主要包括胡蘿卜素、β-類胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、類胡蘿卜素和酵母紅素，它們都是VA的前體[4-5]，人類和動物可以利用這些衍生物轉(zhuǎn)化成為視黃醛再轉(zhuǎn)化為視黃醇。胡蘿卜素主要作為VA、天然食品和飼料著色劑，在醫(yī)藥、化工、食品等行業(yè)的使用越來越廣泛[6-8]。希望能進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，這樣既能減輕環(huán)境污染，又可提供優(yōu)質(zhì)飼料，還能變廢為寶。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

MgSO4（分析純），國藥集團(tuán)上海試劑公司提供；HCl（36%），天津市天力化學(xué)試劑有限公司提供；NH4Cl（分析純），濟(jì)寧百川化工有限公司提供；蛋白胨（分析純），上海一研生物科技有限公司提供；丙酮（分析純），天津市永大化學(xué)試劑有限公司提供；乙醚（分析純），深圳市旭升化工有限公司提供；硫酸（分析純），深圳市旭升化工有限公司提供。

1.2 主要儀器

UV-2550型紫外-可見分光光度計，杭州匯爾有限公司產(chǎn)品；HDL型潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器公司產(chǎn)品；HZQ-D型恒溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品；TGL-16G型高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械公司產(chǎn)品；電子顯微鏡，上海光學(xué)儀器一廠產(chǎn)品；BS210S型電子天平，德國Sartorius儀器公司產(chǎn)品；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海-恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 好食脈孢菌培養(yǎng)基的制備

準(zhǔn)確稱取新鮮的馬鈴薯200 g，切碎后沸水中煮5～8 min，待其冷卻后，用80目單層紗布過濾，取上清液，向上清液中添加葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，加蒸餾水定容到1 000 mL，pH值自然，裝于三角瓶中，于121℃下濕熱滅菌30 min后擺斜面。于30℃條件下培養(yǎng)96 h，備用。

1.3.2 好食脈孢菌種子液的制備

稱取3 g麩皮加入100 mL蒸餾水中，浸泡過夜然后用4層紗布過濾，取上清液。稱取1.5 g蛋白胨，pH值自然，分裝至250 mL錐形瓶，裝量為50 mL/250 mL，121℃濕熱滅菌30 min。同時滅菌裝量為30 mL/250 mL錐形瓶的帶有20個玻璃珠的蒸餾水。

在無菌條件下向斜面培養(yǎng)基中倒入冷卻后的無菌水至沒過斜面，輕晃洗下斜面表面的孢子，倒回有20個玻璃珠的錐形瓶中，于搖床振蕩2 h，此時制備出的液體稱為脈孢霉孢子懸液。

1.3.3 醋糟營養(yǎng)成分的測定方法

用范氏（Van Soest）法分別測定中性洗滌纖維（DNF）、酸性洗滌纖維（ADF）、計算半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的含量。半纖維素=中性洗滌纖維-酸性洗滌纖維，纖維素=酸性洗滌纖維-酸性洗滌木質(zhì)素，木質(zhì)素=酸性洗滌木質(zhì)素-灰分。

粗脂肪含量測定采用索氏提取法；灰分的測定采用GB 5009.4—2010；粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法。

1.3.4類胡蘿卜素的提取——丙酮提取法

將發(fā)酵好的物質(zhì)烘干粉碎取1 g加入20 mL鹽酸（3 mol/L），放入搖床振蕩45 min，然后放入沸水浴中加熱5 min。將經(jīng)上述處理后的菌體，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min，取上清液，清水離心2次，去上清液，吸取15 mL丙酮加至沉淀中，于30℃振蕩提取20 min，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min，取上清液。適當(dāng)稀釋后用WFZ UV-2000紫外可見分光光度計測定其475 nm吸光度。類胡蘿卜素的計算公式如下：

式中：Aλmax——色素最大吸收波長處的吸光度；

D——測定試樣的稀釋倍數(shù)“1”；

V——提取色素用有機溶劑體積，mL；

W——發(fā)酵液體積，mL；

0.16——類胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)，L/（mg·cm）。

在上式中W指發(fā)酵液體積，mL，則計算結(jié)果單位是μg/mL，即mg/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 醋糟中營養(yǎng)成分的測定

醋糟中營養(yǎng)成分含量見表1。

表1 醋糟中營養(yǎng)成分含量/%

由表1可知，醋糟中的粗蛋白含量約13.13%，粗脂肪13.76%，粗纖維29.75%，灰分7.09%。根據(jù)研究分析表明醋糟中還有鈣0.42%，磷0.19%等礦物質(zhì)元素[9]。通過對醋糟營養(yǎng)成分的測定，對醋糟得到進(jìn)一步了解，也為醋糟能夠變廢為寶奠定了堅實而有力的基礎(chǔ)。

2.2 好食脈孢菌色素全波長掃描圖譜

好食脈孢菌類胡蘿卜素丙酮提取液全波長掃描見圖1。

圖1是按料液比1∶25加入丙酮類胡蘿卜素在紫外分光光度計中的掃描圖，色素提取液在415.5，460.6，482.5 nm處有最大吸收峰，與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致[10]。

圖1 好食脈孢菌類胡蘿卜素丙酮提取液全波長掃描

2.3 影響好食脈孢菌發(fā)酵醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的因素

2.3.1 氮源的選擇與優(yōu)化

在以最佳酶水解后醋糟產(chǎn)的還原糖為碳源，分別加入豆渣、豆粕、蛋白胨和NH4Cl，添加量均為1 g/L，接菌量1 mL/瓶，于28℃條件下培養(yǎng)48 h，在475 nm處測定類胡蘿卜素含量，以選出最佳氮源測定。

不同氮源對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響見圖2。

圖2 不同氮源對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

由圖2可知，培養(yǎng)后，得到豆渣在475 nm處的吸光度最大，類胡蘿卜素素含量為62 μg/g，由此選豆渣為最佳氮源?；谝陨辖Y(jié)果，篩選出最適氮源的添加量。

豆渣添加量對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響見圖3。

圖3 豆渣添加量對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

隨著豆渣添加量的增長，類胡蘿卜素的含量及色素產(chǎn)量呈現(xiàn)明顯上升趨勢，當(dāng)添加量為8%時，上升開始減緩，當(dāng)添加量到10%～12%時，上升更加遲緩，所以判斷添加量為12%時類胡蘿卜素含量最高。隨著豆渣的添加量增加，氮源不斷滿足菌種生長所需的營養(yǎng)，當(dāng)豆渣添加到一定含量時，營養(yǎng)充足，菌種數(shù)達(dá)飽和，醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素含量也不再升高。所以12%為豆渣最適添加量。

2.3.2 水添加量對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

微生物繁殖過程中，水添加量對其生長繁殖起到至關(guān)重要作用。所以分別向含12%豆渣的12 g/mL的固體培養(yǎng)基中，接種1 mL種子液，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時間120 h。培養(yǎng)基中加入3，6，9，12，15 mL的蒸餾水，后在475 nm處測定類胡蘿卜素含量，以未接菌的醋糟培養(yǎng)基為對照。

12 g/250 mL培養(yǎng)基中水添加量對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響見圖4。

圖4 12 g/250 mL培養(yǎng)基中水添加量對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

微生物正常代謝物質(zhì)需要水作為載體，吸收營養(yǎng)、排泄廢物，所以水對好食脈孢菌的生長繁殖至關(guān)重要。隨著水添加量的增加，類胡蘿卜素量在緩慢增長，可能是因為水分含量不夠，不能使好食脈孢菌細(xì)胞進(jìn)行正常的生長繁殖活動所致。當(dāng)水添加量為9 mL/12 g時，類胡蘿卜素量達(dá)到最佳，之后緩慢下降，分析其原因可能是含水量過大，導(dǎo)致培養(yǎng)基中氧氣變少，減緩好食脈孢菌正常生長繁殖代謝。

2.3.3 初始pH值對產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

好食脈孢菌，有其適宜的生長pH值，因此pH值也是影響其產(chǎn)類胡蘿卜素的關(guān)鍵。為上述培養(yǎng)基（添加12%豆渣、9 mL蒸餾水）的基礎(chǔ)上，接菌量1 mL/瓶，發(fā)酵溫度28℃，培養(yǎng)時間120 h。分別選擇初始pH值為3，4，5，6，7進(jìn)行試驗。在475 nm處測定類胡蘿卜素含量，以未接菌的醋糟培養(yǎng)基為對照。

培養(yǎng)基初始pH值對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響見圖5。

圖5 培養(yǎng)基初始pH值對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

由圖5可知，pH值為3～5時由于高酸性環(huán)境下，好食脈孢菌對培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)吸收和利用率會很低，好食脈孢菌正常代謝和繁殖受到影響，從而色素產(chǎn)量低。當(dāng)pH值為6時，類胡蘿卜素積累量最多；pH值為7時，色素量又有小幅下降，可能是因為好食脈孢菌在中性偏酸性環(huán)境生長較為適宜，同時偏酸還可以抑制雜菌類生長，對色素的大規(guī)模生產(chǎn)也極其有利。因此，得到初始pH值6為最佳。2.3.4 培養(yǎng)基裝量對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

在上述培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上配制60 g于1 000 mL燒杯中，用玻璃棒攪拌均勻，分別以4，8，12，16，20 g/250 mL培養(yǎng)基裝量進(jìn)行試驗，含水量按照上述適當(dāng)比例添加，初始pH值為6，接菌量1 mL/瓶，發(fā)酵溫度28℃，培養(yǎng)時間120 h。在475 nm處測定類胡蘿卜素含量，以未接菌的醋糟培養(yǎng)基為對照。

250 mL培養(yǎng)瓶中基裝量對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響見圖6。

圖6 250 mL培養(yǎng)瓶中基裝量對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

由圖6可知，當(dāng)培養(yǎng)基裝量在12 g/250 mL時，色素量達(dá)到最大，當(dāng)裝量過少時，營養(yǎng)成分相對較少，不能滿足好食脈孢菌的是正常生長繁殖。當(dāng)裝量過大，容氧量相對減少，從而抑制好食脈孢菌正常代謝，所以選擇基裝量為12 g/250 mL為發(fā)酵的最優(yōu)固態(tài)培養(yǎng)基裝量。

2.3.5 接種量對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

考慮到菌種生長和繁殖初期，接種量也影響著色素含量，所以分別選擇1，2，3，4，5 mL接種量，裝量12 g，其他條件同上，發(fā)酵溫度28℃，培養(yǎng)時間120 h。在475 nm處測定類胡蘿卜素含量，以未接菌的醋糟培養(yǎng)基為對照。

接種量對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響見圖7。

圖7 接種量對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

由圖7可知，隨著培養(yǎng)基接種量的加大，好食脈孢菌的細(xì)胞生物量及色素產(chǎn)量均呈上升趨勢，但當(dāng)接種量從4 mL增加到5 mL時，好食脈孢菌的繁殖速度減慢，分析其原因，可能是因接種量過大導(dǎo)致發(fā)酵培養(yǎng)液的黏度增大，從而使得培養(yǎng)基中的溶解氧不足而導(dǎo)致好食脈孢菌繁殖速度減慢。另外過大的接種量也會對實際生產(chǎn)中種子液制備造成負(fù)擔(dān)，所以選擇4 mL為最適接種量。

2.4 好食脈孢菌發(fā)酵醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素試驗條件的優(yōu)化試驗

2.4.1 正交試驗水平的設(shè)定

在單因素的基礎(chǔ)上，采用正交試驗方法對影響產(chǎn)類胡蘿卜素的因素進(jìn)行分析及優(yōu)化。

正交因素與水平設(shè)計見表2。

表2 正交因素與水平設(shè)計

2.4.2 正交試驗方案及結(jié)果

采用水添加量（A）、初始pH值（B）、基裝量（C）、接種量（D） 4個因素，每個因素設(shè)定3個水平，以類胡蘿卜素含量（Y）為指標(biāo)，設(shè)計試驗。

好食脈孢菌產(chǎn)類胡蘿卜素的正交試驗方案及結(jié)果見表3。

表3 好食脈孢菌產(chǎn)類胡蘿卜素的正交試驗方案及結(jié)果

由表3可知，從表中可以看出好食脈孢菌發(fā)酵醋糟的最佳制作工藝為 B2＞C2＞A1＞D2，即初始 pH 值為6，水添加量9 mL，基裝量12 g，接種量4 mL。進(jìn)行醋糟發(fā)酵，可行穩(wěn)定。

3 結(jié)論

研究不同氮源對醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素效果的影響，篩選了最適氮源，考查了影響產(chǎn)類胡蘿卜素的因素，在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過正交試驗分析，得到好食脈孢菌發(fā)酵醋糟的最佳制作工藝為最佳組合初始pH值6，水添加量9 mL/12 g，基裝量12 g/250 mL，接種量4 mL。最優(yōu)條件下色素含量可達(dá)117.68 μg/g。其中，初始pH值是影響類胡蘿卜素含量最重要的因素，利用好食脈孢菌固體發(fā)酵醋糟簡單易行，類胡蘿卜素含量得到了很大的提高，如果將這一技術(shù)進(jìn)一步完善，并且應(yīng)用到飼料深加工中，前景十分可觀。

[1]楊慶文，彭曉光，楊林娥，等.醋糟的開發(fā)與利用 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（2）：44-46.

[2]宋增廷，董曉芳，佟建明，等.醋糟的營養(yǎng)價值及其在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用 [J].中國畜牧雜志，2011（9）：32-35.

[3]鄭洛昀，辛嘉英，王艷，等.醋糟發(fā)酵紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的研究 [J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2016（16）：1-5.

[4]Z Aksu A Eren.Carotenoids production by the yeast Rhodotorula mucilaginosa：use ofagricultural wastes as a carbon source[J].Process Biochem，2005（4）：2 985-2 991.

[5]胡建中.柑橘中類胡蘿卜素的提取、分離、鑒定及其穩(wěn)定性研究 [D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[6]李曉銀.柿子皮中類胡蘿卜素化合物的分離鑒定及穩(wěn)定性研究 [D].西安：西北工業(yè)大學(xué)，2006.

[7]Greg A Johnson， Robert C Burghardt， Fuller W Bazer.Osteopontin：a leading candidate adhesion molecule for implantation in pigs and sheep[J].Journal of Animal Science and Biotechnology，2015 （2）：177-190.

[8]唐剛，陳育如，劉友芬.間型脈孢菌產(chǎn)類胡蘿卜素研究 [J].南京師范大學(xué)學(xué)報（工程技術(shù)版），2009（1）：73-77.

[9]楊致玲，李建英，張栓林.微生物發(fā)酵可提高醋糟營養(yǎng)價值 [J].中國飼料，1999（6）：24-27.

[10]何文娟，王志，李雯，等.界面聚合制備含丙烯氧基團(tuán)的復(fù)合膜用于CO2分離 [J].化工學(xué)報，2014（11）：4 420-4 429.

The Study on the Production of Carotenoids from Vinegar Residue by Neurospora sitophila

WANG Qiannan1，*XIN Jiaying1，ZHENG Luoyun1，CHEN Shuming2，LI Jiarou1
（1.Key Laboratory for Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China；2.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Jinzhong，Shanxi 030801，China）

The abandoned vinegar residue were used as the main raw material to produce carotenoid by the Neurospora sitophila fermentation，in order to improve the nutritional value of vinegar residue and make them into edible feed and achieve the utilization of waste products.Firstly，the main nutritional components of soybean residue were determined.By using carotenoid content as target，the effects of various factors on the carotenoid content were investigated.The optimal nitrogen source and the optimal amount of nitrogen source were selected.The optimal amount of water，the pH of the medium，the initial liquid volume and the inoculation amount of the medium were obtained.On the basis of single factor，the culture conditions were optimized by the orthogonal test and the optimal reaction conditions were determined：the best source of nitrogen was bean dregs，the amount of it was 12%，the moisture amount 9 mL/12 g，the pH of the medium 6，the initial liquid volume 12 g/250 mL，the inoculation amount of the medium was 4 mL.The carotenoid content can reach 117.68 μg/g.

Neurospora sitophila；vinegar residue；carotenoid

O643.32

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.033

1671-9646（2017） 11b-0024-04

2017-09-05

山西省重點研發(fā)計劃（指南）項目（201603D221027-3）；山西省人才專項（優(yōu)秀人才科技創(chuàng)新）項目（201705D211029）；哈爾濱商業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊項目（CX2016-9）。

王倩男（1993— ），女，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通訊作者：辛嘉英（1966— ），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為生物催化與生物轉(zhuǎn)化。