SCN3A 基因突變型表達(dá)載體的構(gòu)建及在 HEK 293 細(xì)胞中的表達(dá)

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(1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖南 衡陽 421002;2.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3.廣州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

SCN3A基因突變型表達(dá)載體的構(gòu)建及在HEK 293細(xì)胞中的表達(dá)

陳勇軍1，邱國(guó)真2，湯斌3，劉稀金1，李欣1，何妍妍1

(1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖南 衡陽 421002;2.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3.廣州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所)

目的體外構(gòu)建含有SCN3A基因mRNA片段的質(zhì)粒pCMV6-XL4-SCN3A的突變體N302S(c.905A>G)，為進(jìn)一步的功能研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法設(shè)計(jì)帶突變位點(diǎn)的引物，以野生型質(zhì)粒為模板進(jìn)行定點(diǎn)誘變，構(gòu)建突變質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)增純化后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，24 h后用RT-PCR方法驗(yàn)證目的基因的表達(dá)。結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序證實(shí)突變成功。突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞系24 h后，RT-PCR可以檢測(cè)到目的基因的表達(dá)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了SCN3A 基因突變型真核表達(dá)載體pCMV6-XL4-SCN3A-N302S，并在基因水平上驗(yàn)證了能在HEK293 細(xì)胞中表達(dá)。

SCN3A； 質(zhì)粒； 表達(dá)； RT-PCR

癲癇是以腦部神經(jīng)元異常高度放電所致的突發(fā)和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的綜合征，電壓依賴性鈉離子通道作為神經(jīng)系統(tǒng)興奮活動(dòng)的基礎(chǔ)[1]，與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)。在哺乳動(dòng)物中，已經(jīng)證實(shí)有功能表達(dá)的鈉通道亞型有9型[2-3]，亞型SCN1A早已明確為熱性驚厥相關(guān)性癲癇的主要致病基因[4-5]，而SCN3A與癲癇的相關(guān)性在近年才逐漸引起人們的關(guān)注[6-8]。本文作者對(duì)熱性驚厥相關(guān)性癲癇的病人進(jìn)行SCN3A基因篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)一例新發(fā)突變c.905A>G/p.N302S，該突變位于鈉離子通道的孔區(qū)，而正常人對(duì)照中沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的突變，與人和哺乳動(dòng)物各型鈉離子通道進(jìn)行同源比對(duì)后發(fā)現(xiàn)高度保留，提示可能為致病性突變。為了進(jìn)一步闡述基因突變后對(duì)蛋白功能的影響，如對(duì)鈉離子通道電生理功能的影響，以探討基因突變的致病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建SCN3A基因的突變表達(dá)載體，并在 HEK293 細(xì)胞上驗(yàn)證表達(dá)，為深入的功能研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞和主要試劑含有正常人SCN3A基因mRNA全長(zhǎng)片段的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒(pCMV6-XL4-SCN3A)由北京敖銳東源生物科技有限公司(OriGene Technologies，Inc)合成。電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌菌株(STBL2)購(gòu)自于Invitrogen公司。HEK293細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene公司)，EcoR I和Xhol I內(nèi)切酶、DNA marker、膠回收試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，質(zhì)粒提取試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑(德國(guó)QIAGEN公司)，DMEM、優(yōu)等胎牛血清(賽默飛世爾化學(xué)制品有限公司)，PCR擴(kuò)增試劑盒(廣州東盛生物制品有限公司)，RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑(Fermentas公司)，引物合成(上海生工生物工程有限公司)、millipore透析膜(美國(guó)密理博公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pCMV6-XL4-SCN3A野生質(zhì)粒鑒定 將pCMV6-XL4-SCN3A全長(zhǎng)序列輸入軟件Primer Genesis中(方法：進(jìn)入http://primergenesis.com，點(diǎn)擊DNA Tools，輸入堿基序列，點(diǎn)Restriction Map顯示出所有酶切位點(diǎn)，選擇合適內(nèi)切酶，能將該序列切為長(zhǎng)短不同的兩個(gè)以上的便于辨認(rèn)的片段)，選擇EcoR I，Xho I 酶切位點(diǎn)，其中EcoR I有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，能將該質(zhì)粒切為長(zhǎng)短不同的三個(gè)片段，依次為：2 514 bp、3 637 bp、7 526 bp。配置雙酶切體系：取質(zhì)粒約150 ng，EcoRI 0.5 μL，XhoI 0.5 μL,10×buffer 1 μL，加ddH2O 到10 μL。37 ℃孵育45 min，使用1%瓊脂糖凝膠電泳。選取酶切正確的質(zhì)粒純化后送華大基因公司測(cè)序，參照文獻(xiàn)[9]所列引物測(cè)通SCN3A基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，無堿基改變的質(zhì)粒作為定點(diǎn)誘導(dǎo)突變的模板。

1.2.2 pCMV6-XL4-SCN3A-N302S突變質(zhì)粒構(gòu)建 采用Quick change XL site-directed mutagenesis kit定點(diǎn)誘變?cè)噭┖校凑f明書要求設(shè)計(jì)引物及進(jìn)行擴(kuò)增，正反向引物為反向互補(bǔ)，所用引物如下。

SCN3A-N302S-F：5′-GGCACAATGGATTCAAGTGGGACATTTGTTAATG -3′，SCN3A-N302S-R：5′-CATTAACAAATGTCCCACTTGAATCCATTGTGCC -3′。

(1)突變質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系為50 μL，按次序加入ddH2O 37 μL，10× Reaction buffer 5 μL，dNTP mix (10 mM)1 μL，正、反向引物(125 ng/μL) 各1 μL， PfuTurbo DNAPolymerase (2.5 U/μL) 1 μL，pCMV6-XL4-SCN3A 質(zhì)粒(約20 ng) 1 μL，Quik Solution 3 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min，然后95 ℃變性50 s，60 ℃退火50 s，68 ℃延伸14 min，18個(gè)循環(huán)，最后68 ℃保溫40 min。(2)模板質(zhì)粒的去除：在上述PCR產(chǎn)物中加入1 μL Dpn I于37 ℃水浴中處理1 h，以除掉母質(zhì)粒。該步驟的原理是：Dpn I內(nèi)切酶作用于來自大腸桿菌的甲基化的質(zhì)粒DNA，而PCR擴(kuò)增的新質(zhì)粒DNA沒有甲基化，不會(huì)被Dpn I內(nèi)切酶所消化。(3)突變質(zhì)粒pCMV6-XL4-SCN3A-N302S的克?。簩⑸鲜雒盖刑幚淼腜CR產(chǎn)物透析后，再電擊轉(zhuǎn)化STBL2感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB平板上(含100 μg/mL氨芐青霉素)，30 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h，挑取單克隆入LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素)中，于30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)36～48 h至液體混濁，提取質(zhì)粒。

透析過程：取預(yù)冷的20% PEG8000透析液2 mL加入小培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿平放冰上，夾取millipore透析膜一張平放浮于透析液面上，光面朝上，PCR產(chǎn)物小心滴在膜上，透析1 h。

電轉(zhuǎn)化過程：吸取透析剩余液體約5 μL，加入40 μL大腸桿菌STBL2電擊感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰浴3 min?；旌弦何?.1 cm電擊杯中，注意避免產(chǎn)生氣泡，EcoⅠ模式按壓pusle鍵一次，電擊參數(shù)為1.75 kV、5.00 ms。電擊杯內(nèi)快速加入500 μL SOC混勻吸出，加入1.5 mLEP管內(nèi)，然后經(jīng)37 ℃ 200 rpm振搖1 h復(fù)蘇后涂板。

(4)pCMV6-XL4-SCN3A-N302S質(zhì)粒的鑒定和擴(kuò)增：按QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，Ecol I和Xhol I雙酶切初步鑒定，電泳條帶符合預(yù)期的質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序。測(cè)序符合c.905A>G而其它位點(diǎn)堿基無變化的質(zhì)粒為突變成功，留取菌液150 μL加入150 mL LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大搖，30 ℃條件下持續(xù)振蕩培養(yǎng)24 h，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切正確者測(cè)濃度后放入-20 ℃保存，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.3 質(zhì)粒異源表達(dá)的鑒定

(1)細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：以含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，6孔板內(nèi)接種，待細(xì)胞融合近80%時(shí),按照每孔2.0 μg pCMV6-XL4-SCN3A野生型或突變型質(zhì)粒及15 μL PolyFect Transfection Reagent的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染。步驟為：按上述比例混合的質(zhì)粒加入不含抗生素和血清的DMEM 100 μL中，再加入轉(zhuǎn)染試劑15 μL 輕輕混勻，室溫靜置8 min；吸走培養(yǎng)板內(nèi)舊液，更換新的含血清和抗生素的培養(yǎng)液，輕輕吸取轉(zhuǎn)染復(fù)合物從各個(gè)方向均勻滴入板內(nèi)，小心放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行RNA提取。(2)基因水平的表達(dá)：參照Thermo Scientific GeneJET RNA Purification Kit說明書步驟提取RNA，測(cè)濃度后取2 μL電泳觀察RNA條帶，條帶清楚者進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄參照RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物放置-20 ℃保存。以上述步驟得到的cDNA產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)目的基因片段和內(nèi)參基因片段引物(表1)，擴(kuò)增相應(yīng)的片段(目的基因和內(nèi)參基因片段采用獨(dú)立的PCR體系擴(kuò)增，但加入cDNA量相同)，PCR產(chǎn)物各取4 μL用2%凝膠電泳，條帶符合預(yù)期大小的送華大基因進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證序列是否正確。

表1目的基因和內(nèi)參基因片段引物

引物SCN3A基因內(nèi)參GAPDH基因正向5'CGGAAGTCAGAAAGAGAAGG3'5'CTGGTAAAGTGGATATTGTTG3'反向5'CAAATAGTGATGGCAAGATC3'5'GAAATCCCATCACCATCTTC3'

2 結(jié) 果

2.1突變質(zhì)粒的成功構(gòu)建

2.1.1 原始質(zhì)粒與突變質(zhì)粒的酶切鑒定 pCMV6-XL4-SCN3A質(zhì)粒大小為13.7 kb(圖1A)。EcoR I和Xho I雙酶將質(zhì)粒切為三個(gè)片段 ：2.6 kb、3.6 kb和7.5 kb(圖1B)。突變質(zhì)粒pCMV6-XL4-SCN3A-N302S大小不變，上述雙酶切位點(diǎn)沒有破壞，仍能將質(zhì)粒切為相應(yīng)大小三個(gè)片段的可能為突變成功的質(zhì)粒，進(jìn)一步驗(yàn)證需要測(cè)序證實(shí)。

圖1 pCMV6-XL4-SCN3A質(zhì)粒模式圖 A：及酶切圖；B：Marker(DL 500～12000)

2.1.2 原始質(zhì)粒與突變質(zhì)粒的測(cè)序圖 原始質(zhì)粒編碼區(qū)全長(zhǎng)測(cè)序證實(shí)未出現(xiàn)突變。突變質(zhì)粒目標(biāo)位點(diǎn)(c.905A>G)突變成功，其它編碼區(qū)全長(zhǎng)證實(shí)未出現(xiàn)意外突變。質(zhì)粒突變前后測(cè)序峰圖對(duì)照如下(圖2)。

2.2基因表達(dá)水平的鑒定提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示完整的三條RNA電泳帶(5S、18S、28S)。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的260 nm/280 nm吸光度值比為1.8～2.0，濃度為1～2 μg/μL。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA產(chǎn)物。以野生型和突變型質(zhì)粒的cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，電泳圖譜均在約270 bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期271 bp大小相符，提示質(zhì)粒在基因水平上成功表達(dá)，片段送測(cè)序證實(shí)為目的片段序列。各條帶右側(cè)為約160 bp的條帶，是內(nèi)參GAPDH片段，與預(yù)期158 bp大小相符(圖3)。由此表明野生型和突變型質(zhì)粒在基因水平上都得到了表達(dá)。

3 討 論

SCN3A基因與癲癇相關(guān)的報(bào)道至今仍然較少，而其致癲癇的機(jī)制仍然是探索性的[10]，但是目前報(bào)道與癲癇相關(guān)的5例SCN3A基因突變都進(jìn)行了電生理功能研究[6-7]。本文作者在1例癲癇病人中新發(fā)現(xiàn)了SCN3A-N302S突變，采用定點(diǎn)誘導(dǎo)突變的方法成功構(gòu)建了含有突變點(diǎn)的質(zhì)粒pCMV6-XL4-SCN3A-N302S，隨后將野生型及突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，在基因水平上得到了驗(yàn)證，提示了SCN3A基因體外表達(dá)的細(xì)胞模型成功構(gòu)建。質(zhì)粒定點(diǎn)誘變的基礎(chǔ)為PCR技術(shù)，為了保證外源性DNA能夠擴(kuò)增、繁殖，形成大量拷貝，必須與載體連接進(jìn)入受體細(xì)胞后形成一個(gè)復(fù)制子，即形成能夠在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。載體是基因克隆中的一個(gè)重要組成部分，缺乏載體的幫助，外源DNA很難進(jìn)入到受體細(xì)胞內(nèi)，即使能夠進(jìn)入往往也不能復(fù)制和表達(dá)，因?yàn)檫@些外源性DNA一般不帶有復(fù)制控制系統(tǒng)。本文用到的質(zhì)粒載體，全長(zhǎng)4 707 bp，帶有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子等。其中SV40啟動(dòng)子可以使基因在多種哺乳細(xì)胞中表達(dá)，使外源基因穩(wěn)定表達(dá)成為可能，并且對(duì)外源基因的插入片斷的長(zhǎng)度沒有太多限制。pCMV6-XL4載體內(nèi)插入了長(zhǎng)度為8 994 bp的SCN3AmRNA全長(zhǎng)，獲得的質(zhì)粒大小在10 Kb以上，擴(kuò)增的難度加大、堿基錯(cuò)配率提高、成功率下降，Stratagene試劑盒使用了高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，高度保證了擴(kuò)增的忠實(shí)性，使得一步法構(gòu)建質(zhì)粒操作過程變?yōu)榭赡堋榱藴p少堿基的錯(cuò)配率，反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)和常規(guī)相比明顯減少，但是延伸的時(shí)間明顯延長(zhǎng)(延伸14 min，18個(gè)循環(huán))。電轉(zhuǎn)化是利用高壓電擊細(xì)胞，使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜瞬間被擊穿，形成能通過外源物質(zhì)的跨膜通道，外源DNA 分子通過該通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[11]。對(duì)于大分子質(zhì)粒，PCR產(chǎn)物經(jīng)透析后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化極大地提高了轉(zhuǎn)化效率，為基因成功克隆提供了保障。

圖2 測(cè)序峰圖對(duì)照 A： 野生型； B：突變型c.905A>G

圖3 HEK293細(xì)胞SCN3AmRNA條帶及基因表達(dá) A：RNA電泳條帶； B:野生型和突變型基因目的片段及各自對(duì)應(yīng)的內(nèi)參片段

綜上所述，應(yīng)用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)，成功的將含有野生型的SCN3A基因的質(zhì)粒pCMV6-XL4-SCN3A誘變?yōu)橥蛔冃偷膒CMV6-XL4-SCN3A-N302S，為進(jìn)一步的基因突變功能研究，如膜片鉗電生理功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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ConstructionofSCN3AgenemutantexpressionvectoranditsexpressioninHEK293cells

CHEN Yongjun,QIU Guozhen,TANG Bin,et al

(DepartmentofNeurology,NanhuaHospitalAffiliatedtoUniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo construct the mutant N302S (c.905A>G) of plasmid pCMV6-XL4-SCN3A containing the SCN3A gene mRNA fragment in vitro,and provide experimental basis for further functional studies.MethodsThe primers with mutation sites were designed and the mutant plasmids were constructed by site-directed mutagenesis using wild-type plasmids as templates.The recombinant plasmid was transiently transfected into HEK293 cells,and the expression of the target gene was verified by RT-PCR after 24 hours.ResultsRecombinant plasmid digestion and sequencing confirmed that the mutation was successful.The expression of the target gene was detected by RT-PCR after transfection of recombinant SCN3A eukaryotic expression plasmid into HEK293 cell line.ConclusionThe SCN3A gene mutant eukaryotic expression vector pCMV6-XL4-SCN3A-N302S was successfully constructed and expressed in HEK293 cells at the gene level.

SCN3A; plasmid; expression; RT-PCR

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.006

2016-10-11；

2016-12-30

湖南省教育廳立項(xiàng)課題資助(15C1206)及衡陽市科技局課題資助(2015KJ59).

R349

A

蔣湘蓮)