RIPK1/RIPK3依賴的細(xì)胞程序性壞死在清除兼性胞內(nèi)菌感染中的作用

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(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所/特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001)

·小專論·

RIPK1/RIPK3依賴的細(xì)胞程序性壞死在清除兼性胞內(nèi)菌感染中的作用

羅茜，張曉紅，趙飛駿*

(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所/特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001)

程序性壞死是一種與炎癥相關(guān)的細(xì)胞死亡模式，與依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶調(diào)控的凋亡不同，這種細(xì)胞死亡模式受受體互作蛋白激酶(RIPK)1和3調(diào)控。在兼性胞內(nèi)菌感染過(guò)程中，宿主會(huì)運(yùn)用多種策略使隱藏在細(xì)胞內(nèi)的兼性胞內(nèi)菌重新暴露于抗菌機(jī)制面前。許多研究報(bào)道表明宿主細(xì)胞的程序性壞死是其中一種重要的策略，有助于兼性胞內(nèi)菌感染的清除。在本文中，我們將探討在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的由RIPK1/RIPK3途徑介導(dǎo)的程序性壞死機(jī)制，以及其在清除兼性胞內(nèi)菌感染中的意義。

RIPK1/RIPK3； 細(xì)菌感染； 程序性壞死

細(xì)胞死亡被分為程序性死亡和非程序性死亡。常見(jiàn)的細(xì)胞程序性死亡比如凋亡[1]，主要由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)介導(dǎo)；非程序性死亡主要指壞死(Necrosis)[2]。壞死一直以來(lái)被認(rèn)為是機(jī)體應(yīng)對(duì)外來(lái)刺激時(shí)發(fā)生的一種有積極意義的非程序性細(xì)胞死亡形式。最近一些研究表明，壞死不僅僅局限于非程序性死亡，它在細(xì)胞水平上也表現(xiàn)出一種受信號(hào)通路調(diào)節(jié)的程序性死亡的特點(diǎn)。這種可調(diào)節(jié)的壞死可以出現(xiàn)在病原體與宿主之間相互作用的過(guò)程中，它能幫助宿主抵抗病原體的損害。目前，大致把這種可調(diào)節(jié)的壞死分為鐵死亡(Ferroptosis)[3]、 線粒體通透性轉(zhuǎn)換(Mitochondria permeability transition，MPT)[4]介導(dǎo)的壞死、焦亡(Pyroptosis)[5]和程序性壞死(Necroptosis)[6]。

1 RIPK1/RIPK3依賴的細(xì)胞程序性壞死

受體互作蛋白激酶1(Receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1)由3個(gè)功能明確的結(jié)構(gòu)域組成：N端激酶結(jié)構(gòu)域，中間結(jié)構(gòu)域，C端死亡結(jié)構(gòu)域。RIPK1激酶功能結(jié)構(gòu)域?qū)Τ绦蛐詨乃篮苤匾?。中間結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)RHIM(RIP-homotypic interaction motif)結(jié)構(gòu)，能幫助RIPK1與其它包含RHIM的蛋白相互作用，比如DNA依賴的干擾素調(diào)節(jié)活化因子(DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors，DAI)，β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β,TRIF)，受體互作蛋白激酶3(Receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)。RIPK3與RIPK1具有高度同源性，具有一樣的激酶功能結(jié)構(gòu)域和RHIM結(jié)構(gòu)。RHIM結(jié)構(gòu)之間的相互作用在細(xì)胞程序性壞死過(guò)程中具有重要意義。而RIPK1 C端的死亡結(jié)構(gòu)域能調(diào)節(jié)其與死亡受體(TNFR1，F(xiàn)as)之間的反應(yīng)[7]。RIPK1包含的這些功能明確的結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡信號(hào)通路發(fā)揮強(qiáng)有力的作用。而目前研究認(rèn)為程序性壞死指的就是由RIPK1/RIPK3依賴的細(xì)胞死亡。

目前關(guān)于程序性壞死的研究大多數(shù)都是建立在腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)誘導(dǎo)基礎(chǔ)上。TNF是一種能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死的細(xì)胞因子?，F(xiàn)有研究表明，TNF相關(guān)信號(hào)通路既能介導(dǎo)細(xì)胞凋亡也能介導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死(圖1)。細(xì)胞凋亡是一種依賴于caspase的程序性死亡；而程序性壞死則是主要通過(guò)RIPK1/RIPK3誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。當(dāng)TNF與宿主細(xì)胞表面的TNFR1結(jié)合時(shí)，能在其受體通路下游募集形成一種低聚物—復(fù)合體Ⅰ。復(fù)合體Ⅰ主要由RIPK1和一些輔助因子(比如TRADD、LUBAC、cIAPs和TRAF2/5)組成，輔助因子中的cIAPs和TRAF2/5能使RIPK1多聚泛素化，進(jìn)而活化NF-κB相關(guān)信號(hào)通路，而NF-κB信號(hào)相關(guān)通路又能提高細(xì)胞的存活率。當(dāng)復(fù)合體Ⅰ被破壞的時(shí)，RIPK1能重新與RIPK3和caspase-8結(jié)合，形成復(fù)合體Ⅱa，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)caspase-8活化程度不高或者RIPK3和MLKL (Mixed lineage kinase domain-like protein)的表達(dá)水平比較高時(shí)，復(fù)合體Ⅱ中的RIPK1和RIPK3就能互相磷酸化，使其本身被激活。活化的RIPK3又能使MLKL磷酸化，這三者組成復(fù)合體Ⅱb促進(jìn)程序性壞死的發(fā)生。活化的MLKL能作用于細(xì)胞膜上的離子通道，通過(guò)對(duì)離子通道的調(diào)控進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜破碎，最終使細(xì)胞死亡[8]。最新的研究表明，除TNFR1能介導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死外，Ⅰ型干擾素(Type I interferon，IFN-Ⅰ)受體也能介導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死(圖1)，機(jī)制與TNFR1類似[9]。

圖1 TNFR1和IFN-ⅠR介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死

2 宿主細(xì)胞發(fā)生RIPK1/RIPK3依賴的細(xì)胞程序性壞死在清除兼性胞內(nèi)菌感染中的作用

宿主細(xì)胞死亡，將影響細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌的感染和增殖。宿主細(xì)胞調(diào)控的由RIPK1/RIPK3信號(hào)通路介導(dǎo)的程序性壞死在細(xì)菌感染過(guò)程中占據(jù)了重要位置。目前發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis)、沙門菌(Salmonella)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Liseria monocytogenes)和鼠疫耶爾森菌(Yersinia)等多種兼性胞內(nèi)菌感染與RIPK1/RIPK3信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死相關(guān)。

2.1結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌是一種兼性胞內(nèi)菌，是人類常見(jiàn)的呼吸道傳染性的疾病肺結(jié)核的病原菌。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，平均每年有150萬(wàn)人死于這種細(xì)菌殺手。肺結(jié)核的發(fā)生是一種非常復(fù)雜的過(guò)程，具體的機(jī)制還不明確，但有一點(diǎn)可以肯定的是巨噬細(xì)胞在控制肺結(jié)核感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。研究人員最近利用海魚分枝桿菌感染斑馬魚幼仔建立了與結(jié)核分枝桿菌侵入人體相似的動(dòng)物模型，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在被分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞中當(dāng)TNF信號(hào)通路被激活后，能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，ROS能增強(qiáng)斑馬魚幼仔對(duì)海魚分枝桿菌的抵抗力[11]。這條通路激活能夠減少分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量同時(shí)也能防止被感染的巨噬細(xì)胞死于由細(xì)菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。但是在大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌感染中，如果巨噬細(xì)胞被感染程度比較嚴(yán)重時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的TNF信號(hào)通路就能激活RIPK1/RIPK3信號(hào)通路從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性壞死[12]，細(xì)胞膜破損，在巨噬細(xì)胞內(nèi)大量存在的結(jié)核分枝桿菌就會(huì)被釋放出來(lái)。結(jié)核分枝桿菌失去生存所必須的營(yíng)養(yǎng)供給環(huán)境，同時(shí)又被暴露在宿主免疫系統(tǒng)面前，最終被清除。

2.2傷寒沙門菌沙門菌病是一種常見(jiàn)的食源性細(xì)菌感染性疾病，主要的臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉與腹痛。在美國(guó)，每年傷寒沙門菌能感染100萬(wàn)人，在這100萬(wàn)人中大約有400人因此喪命[13]。傷寒沙門菌是一種兼性胞內(nèi)菌，有研究表明它在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均能引起巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞的死亡[14]。在20年前，研究人員就認(rèn)為沙門菌引起巨噬細(xì)胞的死亡可能是通過(guò)凋亡通路實(shí)現(xiàn)[15]。但在近年的研究發(fā)現(xiàn)這種沙門菌引起巨噬細(xì)胞的死亡并非通過(guò)caspase-3或者caspase-8介導(dǎo)的凋亡完成，而是通過(guò)caspase-1和caspase-11介導(dǎo)的焦亡通路完成[16]。還有研究證實(shí)沙門菌可以激活細(xì)胞內(nèi)的IFN-I信號(hào)通路，隨后將誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生程序性壞死[16]。研究人員用抗IFN-I受體的中和抗體與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，之后再用沙門菌感染，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)大量死亡。研究者又分別用3種方式預(yù)處理的巨噬細(xì)胞，依次是用necrostatin-1抑制RIPK1的巨噬細(xì)胞、敲除IFN-I受體的巨噬細(xì)胞和敲除RIPK3的巨噬細(xì)胞，之后都用沙門菌感染，最后發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞死亡數(shù)都有明顯的降低[9]。在更深入的研究中，研究人員用沙門菌感染IFN-I受體和RIPK3缺陷型的小鼠，發(fā)現(xiàn)這兩種小鼠的巨噬細(xì)胞數(shù)明顯比同樣感染的野生型小鼠的巨噬細(xì)胞多，前兩者的細(xì)菌滴度明顯比野生型小鼠的細(xì)菌滴度低[9]。在這個(gè)例子中，巨噬細(xì)胞的程序性壞死有利于限制沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖。

2.3單核細(xì)胞增生李斯特菌單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種兼性胞內(nèi)病原菌，它在感染宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)或者非巨噬細(xì)胞內(nèi)都能復(fù)制生存。一旦LM被宿主細(xì)胞以吞噬小體的形式吞進(jìn)胞內(nèi)后，在被運(yùn)送至溶酶體之前，其產(chǎn)生的毒力因子李斯特菌溶血素O(Listeriolysion O,LLO)就會(huì)發(fā)揮作用，幫助其從吞噬小體中逃離，從而避免被溶酶體中各類酶降解破壞。之前有研究認(rèn)為L(zhǎng)M可引起的巨噬細(xì)胞死亡，可能與焦亡有關(guān)而不是凋亡[17]。但最近有研究發(fā)現(xiàn)一種非焦亡并與炎癥相關(guān)的細(xì)胞死亡可能也參與到LM導(dǎo)致巨噬細(xì)胞死亡過(guò)程中來(lái)，當(dāng)LM感染小鼠后，小鼠肝臟中的Kuffer細(xì)胞會(huì)發(fā)生大量死亡并伴隨有大量炎癥因子的分泌。這種死亡方式不依賴caspase-1就可以發(fā)生，所以排除細(xì)胞發(fā)生焦亡。此外，當(dāng)小鼠感染Dhly基因突變株(不產(chǎn)生LLO的LM)后，Kupffer細(xì)胞死亡就沒(méi)有發(fā)生，一般含有LLO的LM能激發(fā)宿主細(xì)胞產(chǎn)生TNF[18]，最近有研究證實(shí)LLO家族的前體也能通過(guò)直接活化RIPK1/RIPK3信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡[8]。因此有理由相信這種細(xì)胞死亡是穿孔素(LLO)與RIPK1/RIPK3信號(hào)通路導(dǎo)致的程序性壞死。同時(shí)，當(dāng)LM感染Ifnar-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)Kupffer細(xì)胞同樣沒(méi)有出現(xiàn)死亡，提示I型干擾素介導(dǎo)的信號(hào)通路極有可能也在LM導(dǎo)致的Kupffer細(xì)胞死亡機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。而用LM去感染RIPK1的抑制劑necrostatin-1預(yù)先處理的小鼠后，Kupffer細(xì)胞死亡數(shù)量明顯減少。以上數(shù)據(jù)均提示RIPK1/RIPK3信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡在清除LM感染的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2.4鼠疫耶爾森菌鼠疫耶爾森菌是一種革蘭陰性細(xì)菌，是鼠疫的主要病原菌。鼠疫主要的臨床表現(xiàn)為發(fā)燒、腹痛、腹瀉同時(shí)在脾臟、肝臟和淋巴結(jié)伴有組織壞死和肉芽腫的形成[19]。鼠疫耶爾森菌一系列的外膜蛋白(Yops)是其主要的毒力因子，Yops通過(guò)細(xì)菌的三型分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用[20]。最近的一些研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用necrostatin-1抑制RIPK1后，由鼠疫耶爾森菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡數(shù)降低。用鼠疫耶爾森菌感染RIPK1缺陷巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞死亡數(shù)也大量減少，這表明RIPK1在鼠疫耶爾森菌誘導(dǎo)宿主巨噬細(xì)胞死亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7]。再進(jìn)一步探索研究研究者發(fā)現(xiàn)鼠疫耶爾森菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞大量死亡不僅需要RIPK1參與，同時(shí)也需要Caspase-8和RIPK3的加入[20]。有趣的是，當(dāng)單獨(dú)抑制或敲除Caspase-8和RIPK3兩種分子的一種，巨噬細(xì)胞死亡并不能被完全阻止，只有當(dāng)同時(shí)抑制或敲除Caspase-8和RIPK3時(shí)，巨噬細(xì)胞死亡才會(huì)被完全抑制[7]。以上研究發(fā)現(xiàn)表明在鼠疫耶爾森菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡過(guò)程中，其激活RIPK1后，RIPK1既能活化Caspase-8依賴的凋亡途徑也能活化RIPK3依賴的程序性壞死途徑最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞死亡。人們認(rèn)為在鼠疫耶爾森菌感染宿主細(xì)胞時(shí)發(fā)生RIPK1和RIPK3依賴的程序性壞死主要是YopJ在其中發(fā)揮了重要作用，YopJ是鼠疫耶爾森菌一種外膜蛋白毒力因子。用缺少YopJ的鼠疫耶爾森菌突變體感染巨噬細(xì)胞，RIPK1和RIPK3依賴的程序性壞死在很大程度上被抑制[7]。巨噬細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，有利于宿主清除入侵機(jī)體的鼠疫耶爾森菌。

3 小結(jié)與展望

文中介紹的幾種兼性胞內(nèi)菌在感染宿主時(shí)，宿主細(xì)胞尤其是最先與細(xì)菌接觸并能把菌體吞噬的巨噬細(xì)胞發(fā)生由RIPK1/RIPK3信號(hào)通路介導(dǎo)的程序性壞死。這種細(xì)胞死亡方式最大特點(diǎn)就是細(xì)胞膜發(fā)生破損，細(xì)胞內(nèi)容物溢出引起宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，包括更多炎癥因子的分泌以及更多免疫細(xì)胞聚集到感染部位發(fā)揮抗菌作用，同時(shí)兼性胞內(nèi)菌也無(wú)法從破碎的細(xì)胞中獲得生存所需的營(yíng)養(yǎng)，最終導(dǎo)致入侵宿主的細(xì)菌被清除。這種死亡方式會(huì)導(dǎo)致部分的宿主細(xì)胞死亡，但這些已經(jīng)被感染的細(xì)胞已經(jīng)無(wú)法發(fā)揮正常功能，還可能會(huì)成為細(xì)菌增殖的溫床，所以宿主選擇讓這些細(xì)胞死亡，對(duì)整個(gè)宿主抗感染過(guò)程具有重要意義。

細(xì)菌感染可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的多種應(yīng)答反應(yīng)。其中一種應(yīng)答反應(yīng)就是細(xì)胞程序性壞死。程序性壞死在病原體感染宿主過(guò)程中發(fā)揮積極作用。這種由 RIPK1和RIPK3介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死，一方面能夠幫助清除已經(jīng)被細(xì)菌感染的宿主細(xì)胞，另一方面可以使某些已經(jīng)被宿主細(xì)胞胞吞的兼性胞內(nèi)菌重新暴露在宿主的抗菌機(jī)制面前，幫助宿主清除這些細(xì)菌，消除感染。在研究病原體感染和宿主細(xì)胞死亡過(guò)程中，我們需要全面的看待宿主細(xì)胞死亡的作用，不能只看到細(xì)胞死亡對(duì)宿主不利的一面，還需要看到細(xì)胞死亡對(duì)宿主有利的方面，綜合分析才能了解清楚機(jī)體與病原體之間相互影響的真正意義。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.018

2016-12-23；

2017-02-21

國(guó)家自然科學(xué)基金(81373230，81301470).

*通訊作者，E-mail:hengyangzhfj@126.com.

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秦旭平)