p-STAT3及Twist在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊類型)中的表達(dá)及相關(guān)性分析

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(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬惠州醫(yī)學(xué) 惠州市第三人民醫(yī)院病理科，廣東 惠州 516002)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

p-STAT3及Twist在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊類型)中的表達(dá)及相關(guān)性分析

譚秋芬，胡惠軍，范曉娟，胡雪梅，鄒偉文，林小龍*

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬惠州醫(yī)學(xué) 惠州市第三人民醫(yī)院病理科，廣東 惠州 516002)

目的探討磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)和Twist在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法利用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測60例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中p-STAT3和Twist蛋白表達(dá)，分析兩者的相關(guān)性以及兩者的表達(dá)率與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果p-STAT3和Twist蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的陽性率明顯高于癌旁正常組織的陽性率。p-STAT3和Twist蛋白在乳腺癌晚期、淋巴結(jié)及脈管及組織學(xué)分級(jí)為Ⅲ-Ⅳ級(jí)的患者中陽性率明顯增高，但兩者在不同年齡及腫瘤大小不同的患者中陽性表達(dá)率不變。在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中，p-STAT3和Twist蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)性。結(jié)論p-STAT3與Twist蛋白的表達(dá)在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中具有明顯的相關(guān)性，且兩者的陽性率在淋巴及脈管轉(zhuǎn)移、分化較差及晚期的患者中明顯升高。這些結(jié)果表明磷酸化的STAT3蛋白可能通過上調(diào)Twist表達(dá)促進(jìn)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

p-STAT3； Twist； 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌； 免疫組織化學(xué)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率逐年上升并呈現(xiàn)出年輕化的趨勢。造成乳腺癌死亡的原因很多，其中最主要的原因是腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[1]。研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子STAT3 的磷酸化,可以介導(dǎo)多種信號(hào)分子,調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡影響腫瘤進(jìn)展[2]，但其作用機(jī)制尚不明確。而Twist作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，其能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化， 其過度表達(dá)與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)[3]。然而目前在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的研究中尚未見關(guān)于p-STAT3及Twist相關(guān)性的報(bào)道。因此，本文采取免疫組化的方法對乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中p-STAT3及Twist的表達(dá)進(jìn)行檢測，同時(shí)分析兩者關(guān)系，以及兩者與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌各臨床病理因素間的關(guān)系，從而探討兩者在乳腺癌癌變過程中的意義，進(jìn)一步明確乳腺癌進(jìn)展的可能機(jī)制，為乳腺癌治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本收集選擇本院病理科2012 年1 月～2015年12 月的手術(shù)切除乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者的標(biāo)本制成的蠟塊60例及20例癌旁組織作為對照。所有的標(biāo)本用10 %中性甲醛進(jìn)行固定并且用石蠟包埋,HE 切片則由副高以上的病理醫(yī)生確診。所有患者病檢前均未進(jìn)行任何治療，均有完整的臨床及病理資料。乳腺癌病理學(xué)分型及組織學(xué)分級(jí)參照2003年乳腺癌WHO 分類和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑鼠抗人Twist 單克隆抗體( H-81，SC15393 )及兔抗人STAT3 多克隆抗體均購于Santa Cruz 公司，SP試劑盒及DAB顯色劑均購自武漢博士德生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3免疫組織化學(xué)染色所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，以4 μm 厚度連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟和水化后，免疫組織化學(xué)參照SP試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，封片。免疫組化結(jié)果的判斷：p-STAT3 蛋白的陽性表達(dá)定位于胞核；而Twist蛋白陽性表達(dá)則定位于細(xì)胞漿。其中每張切片細(xì)胞的陽性強(qiáng)度按：無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別記0，1，2，3 分；著色面積則通過：無著色、著色<1/3，著色1/3～2/3，著色>2/3 分別記0，1，2，3 分。隨后根據(jù)這兩項(xiàng)的得分之和對結(jié)果進(jìn)行判定：<3 分為陰性，≥3 分則為陽性。每張切片均選取代表性的區(qū)域在200 倍視野下進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)8個(gè)視野，取平均值進(jìn)行分析[5-6]。

1.4統(tǒng)計(jì)分析用SPSS10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)， 其中計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中p-STAT3及Twist蛋白的表達(dá)p-STAT3 蛋白的陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，38例(63.3%)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的病例呈陽性表達(dá)，而癌旁正常組織中只有4例(20%)弱表達(dá)(P<0.01)。Twist蛋白的陽性表達(dá)定位于胞漿，浸潤性導(dǎo)管癌組織中44 例(73.3%)Twist表達(dá)陽性，而癌旁組織中只有5例(25%)弱表達(dá)(圖1、表1)。

圖1 p-STAT3及Twist蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及癌旁正常組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色SP法,×200)A:癌旁組織中p-STAT3表達(dá);B:癌組織中p-STAT3表達(dá);C:癌旁組織中Twist表達(dá);D:癌組織中Twist表達(dá)

組別np-STAT3陽性陰性Twist陽性陰性乳腺癌組織6038(63.3)22(36.7)44(73.3)16(26.7)癌旁組織204(20.0)16(80.0)5(25.0)15(75.0)χ214.12816.423P<0.01<0.01

2.2 p-STAT3蛋白與Twist蛋白的相關(guān)性分析表2結(jié)果提示p-STAT3 表達(dá)與Twist蛋白呈正相關(guān)(均P<0.001)。

表2 p-STAT3蛋白與Twist蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的相關(guān)性分析(例)

2.3不同臨床病理特征的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者中p-STAT3及Twist蛋白陽性表達(dá)率的比較由表2及表3可知，p-STAT3 及Twist蛋白表達(dá)率在組織分級(jí)為Ⅲ級(jí)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者中表達(dá)率均明顯升高(均P<0.05)；而在不同年齡及腫瘤大小不同的患者中表達(dá)率變化不大(P>0.05)。見表3、表4。

表3 不同臨床病理特征的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊型)患者中p-STAT3蛋白陽性表達(dá)率的比較(例，%)

3 討 論

信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化子信號(hào)通路異?；罨c腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。STAT3 是信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族的重要成員之一。STAT3的活化受其上游的Janus 激酶(JAK)的調(diào)控，活化的JAK 可以通過募集胞漿中的單體STAT3 分子，促進(jìn)STAT3 的酪氨酸磷酸化，從而使STAT3 形成同源或異源性的二聚體，進(jìn)而制其從受體上脫離，進(jìn)入胞核與相應(yīng)靶基因的STAT3位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄[7]。STAT3 信號(hào)活化能通過誘導(dǎo)腫瘤血管生成及細(xì)胞外基質(zhì)降解參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[8]。本課題組發(fā)現(xiàn)p-STAT3 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊類型)中表達(dá)明顯高于癌旁組織。且進(jìn)一步分析其與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)p-STAT3的表達(dá)率在發(fā)生淋巴結(jié)及脈管轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ及Ⅳ期、組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)的浸潤性導(dǎo)管癌患者中明顯升高(P<0.05)，提示STAT3的活化可能參與調(diào)控乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊類型)的進(jìn)展。

表4 不同臨床病理特征的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊型)患者中Twist蛋白陽性表達(dá)率的比較(例，%)

Twist作為腫瘤調(diào)控的重要靶標(biāo)，能通過干預(yù)P53 腫瘤抑制基因通路，誘導(dǎo)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)變抑制細(xì)胞分化等調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[9-10]。國外的研究顯示，Twist可作用于P53 依賴性和非依賴性通路以及NF-κB 通路調(diào)控細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的形成，并且調(diào)控E-box 啟動(dòng)子的表達(dá)，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，降低腫瘤細(xì)胞的黏附性，促進(jìn)上皮來源腫瘤(如前列腺癌、乳腺癌和消化道腫瘤等)的發(fā)生及轉(zhuǎn)移[11-14]。此外，Twist的上調(diào)可增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，加快腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移[15]。而Yang 等[16]在裸鼠的乳腺癌模型中研究提示，在Twist 蛋白表達(dá)越高的乳腺癌細(xì)胞越容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。本研究中Twist 陽性表達(dá)率在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌與癌旁組織間的陽性表達(dá)存在有顯著差異，提示Twist 可能在乳腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用。為進(jìn)一步探討Twist 表達(dá)與乳腺癌進(jìn)展的關(guān)系，分析了Twist 表達(dá)與不同臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊類型)的組織中Twist 的陽性表達(dá)率在發(fā)生脈管浸潤、分化程度較差及晚期的患者中表達(dá)率明顯升高，這些結(jié)果與蔡鳳林[17]和王偉[18]等課題組的研究相一致，表明Twist參與乳腺浸潤性癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。

在Twist的基因中存在STAT3結(jié)合的位點(diǎn)，提示活化的STAT3可能通過調(diào)節(jié)Twist的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[19]。因此，本課題組對兩者在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊類型)中的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊類型)中，p-STAT3的表達(dá)與Twist表達(dá)成正相關(guān)，提示STAT3的活化可能通過調(diào)控Twist表達(dá)，影響乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊類型)的侵襲及轉(zhuǎn)移。最新的研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌組織中表皮生長因子(EGF)或白介素-6(IL-6)可以激活JAK-STAT3 通路誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞EMT促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移， 而這種作用能被JAK-STAT3 通路抑制劑AG490 所逆轉(zhuǎn)[20]。而相同的結(jié)果在結(jié)腸癌的研究中也被證實(shí)[21]。然而STAT3 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，尚未見研究報(bào)道。此外，Twist作為調(diào)節(jié)EMT的轉(zhuǎn)錄因子，其是否受到活化的STAT3的調(diào)控，需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，p-STAT3 與Twist蛋白的表達(dá)在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中具有明顯的相關(guān)性，且兩者的陽性率在淋巴及脈管轉(zhuǎn)移、分化較差及晚期的患者中明顯升高。據(jù)此，課題組推測活化的STAT3 可能通過上調(diào)Twist蛋白介導(dǎo)EMT 促進(jìn)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊類型)的侵襲轉(zhuǎn)移，STAT3/Twist/EMT可能形成信號(hào)軸在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊類型)的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用，而這需要在將來的研究中進(jìn)一步證明。

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Theexpressionsandcorrelationofp-STAT3andtwistinnospecialtypeofinvasiveductalcarcinomaofbreast

TAN Qiufen,HU Huijun,FAN Xiaojuan,et al

(DepartmentofPathology，AffliatedHuizhouHospital,theThirdPeople’sHospitalofHuizhou，GuangzhouMedicalUniversity，Huizhou516002，Guangdong，China)

ObjectiveTo study the expressions of p-STAT3 and Twist in the no special type of invasive ductal carcinoma (IDC) of breast and to analyze its clinical significance.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expressions of p-STAT3 and Twist in 60 cases of IDC of breast and corresponding tumor-adjacent normal breast tissues.Statistical analysis was carried out to analyze the relationship between p-STAT3 and Twist expression,and the relationship of these expressions to clinicopathologic characteristics.ResultsThe positive rates of p-STAT3 and Twist protein expressions in the IDC of breast tissues were significantly higher than those in the corresponding tumor-adjacent normal breast tissue.The positive rates of p-STAT3 and Twist protein were significantly higher in lymph node metastasis,histological grade (Ⅲ) and vascular invasion.P-STAT3 and Twist protein had no change in different age and tumordiameter.The positive rate of p-STAT3 expression was positively correlated with the positive rate of Twist expression.ConclusionsThe expression of p-STAT3 and Twist protein was significantly correlated with invasive ductal carcinoma of breast,and the positive rate of p-STAT3 and Twist was significantly higher in lymphatic and vascular metastasis,poorly differentiated and advanced stage.These results indicate that p-STAT3 may play an important role in induced invasion and metastasis in no special type of IDC via regulation of the expression of Twist.

phosphorylation of signal transducer and activator of transcription 3; Twist; invasive ductal carcinoma of breast; immunohistochemistry

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.002

2016-11-09；

2017-02-02

國家自然基金(編號(hào)81600342)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(編號(hào)A2015620).

*通訊作者，E-mail:xiaolong880101@126.com.

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蔣湘蓮)