THEM4與高糖誘導的人胚腎上皮細胞膠原分泌的關系

陳 寧 ，楊永輝，安曉穎，朱桂云，康麗菲，郝 軍

(1.河北省胸科醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050041；2.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學教研室，河北 石家莊 050017)

·論著·

THEM4與高糖誘導的人胚腎上皮細胞膠原分泌的關系

陳 寧1，楊永輝1，安曉穎1，朱桂云1，康麗菲1，郝 軍2*

(1.河北省胸科醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050041；2.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學教研室，河北 石家莊 050017)

目的探討硫酯酶超家族成員4(thioesterase superfamily member 4,THEM4)在高糖刺激的人胚腎上皮細胞(human embryo kidney epithelial cells,HKC)內的表達以及與膠原分泌的關系。方法體外培養(yǎng)HKC，分別給予高糖(30 mmol/L)刺激0、6、12、24和48 h后，收集細胞。提取RNA， Real-time PCR檢測THEM4 mRNA的表達；提取總蛋白，Western blot檢測THEM4、phospho-Akt(Ser 473)、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達；免疫細胞熒光檢測THEM4蛋白表達和定位；ELISA方法檢測細胞上清液中Ⅰ型膠原(collagenⅠ,ColⅠ)、Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ,Col Ⅲ)分泌情況。結果① 高糖培養(yǎng)HKC內THEM4表達明顯降低，伴隨phospho-Akt(Ser 473)、 TGF-β1和α-SMA表達上調；THEM4與TGF-β1和α-SMA表達呈負相關(分別為：y=-5.100 9x+1.178，R2=0.971 1;y=-3.803 3x+1.408,R2=0.893 9)。 ②高糖可刺激HKC分泌ColⅠ、Col Ⅲ。結論高糖誘導的HKC膠原的分泌可能是通過抑制THEM4表達，上調phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1和α-SMA蛋白表達而實現(xiàn)的。

腎小管；上皮細胞；膠原分泌；硫酸酶超家族成員4

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.018

硫酯酶超家族成員4(thioesterase superfamily Member 4,THEM4)，又稱C末端調節(jié)蛋白，是Akt 的一種內源性抑制因子[1]，能結合Akt并抑制Akt磷酸化而阻斷下游信號的傳遞，通過負性調控PI3K/Akt信號通路具有一定的抗炎及抗腫瘤效應[2-3]。目前THEM4主要集中于基因學方面的研究[4-5]，被認為是一種與心血管疾病、慢性腎臟疾病以及糖尿病等代謝性疾病發(fā)生相關的基因[6]，位于1號染色體長臂21～24區(qū)，通過調節(jié)體內糖平衡狀態(tài)能夠增加2型糖尿病的易感性[7]。筆者前期研究揭示PI3K/Akt信號通路與糖尿病腎小管上皮細胞細胞外基質(extracellular matrix,ECM)分泌和纖維化相關，是糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)發(fā)生發(fā)展的關鍵調控通路[8]。然而THEM4作為Akt的負向調控因子，是否參與了上述病理進程以及在高糖誘導的人胚腎上皮細胞(human embryo kidney epithelial cells,HKC)內的表達如何目前卻尚不清楚。因此，本研究應用高糖培養(yǎng)HKC，觀察高糖刺激下各個時間點HKC內THEM4、phospho-Akt(Ser 473)、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、以及平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達情況，并同時檢測細胞上清液中膠原的分泌，探討THEM4與高糖誘導的HKC膠原分泌的關系，旨在為糖尿病腎臟ECM沉積的防治尋求理論依據(jù)。

1 資 料 與 方 法

1.1試劑及儀器 PrimeScript RT試劑盒(#RR047A)購自TaKaRa公司； TRITC-羊抗兔IgG、兔抗THEM4單克隆抗體(14692-1-AP)、兔抗β-actin單克隆抗體(20536-1-AP)、兔抗α-SMA單克隆抗體(14295-1-AP)均購自美國Protein Tech公司；兔抗phospho-Akt(Ser 473)單克隆抗體(#4060)、兔抗Akt單克隆抗體(#4685)均購自美國Cell Signaling公司；兔抗TGF-β1單克隆抗體(#AP12348a) 購自ABGENT；人CollagenⅠELISA試劑盒、人Collagen Ⅲ ELISA試劑盒均購自BlueGene Biotech。Real-time PCR儀購自安捷倫科技有限公司。

1.2方法

1.2.1HKC的培養(yǎng)及實驗分組 HKC為本實驗室凍存，用含10%胎牛血清及100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2。將消化好的細胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，細胞貼壁24 h后，經同步化后給予高糖(30 mmol/L)刺激0、6、12、24和48 h，終止培養(yǎng)并進行相關檢測。

1.2.2Real-time PCR檢測THEM4 mRNA的表達 采用Trizol法提取細胞總RNA，cDNA合成和目的基因擴增嚴格按照PrimeScript RT試劑盒(TakaRa,#RR047A)說明書操作，目的基因的引物分別為：THEM4 sense 5′-CCAGGAGCAGCTA-GGAGGTTA-3′antisense 5′-GTCTGAGGTCCTT-AGTCCAGC-3′，擴增片段91 bp；GAPDH sense 5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′antisense 5′-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3′，擴增產物140 bp，擴增條件為預變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。以GAPDH作為內參照校正，用2-△△Ct法分析基因的相對表達。

1.2.3Western blot檢測蛋白表達 收集各組細胞并加入冰冷的裂解液(50 mmol/L Tris-Cl pH7.4、150 mmol NaCl、0.1%SDS、1%Triton-X 100、1 mmol/L EDTA、aprotinin 2 mg/L、PMSF 100 mg/L)200 μL提取總蛋白。采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，分裝后-80 ℃保存。每個樣品取50 μg總蛋白，經10% SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至PVDF膜；5%BSA 37 ℃封閉1 h，一抗[THEM4,Akt，phospho-Akt(Ser 473)]，α-SMA,TGF-β1及 β-actin，1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜。TBST洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h；TBST洗膜，滴加ECL增強化學發(fā)光試劑，Odyssey FC成像系統(tǒng)顯影。用美國UVP公司LabWorks 4.5軟件對條帶進行定量分析，讀取積分光密度值(integrated optical density,IOD)，目的蛋白條帶的IOD值除以內參條帶的IOD值作為最終結果進行統(tǒng)計分析。

1.2.4免疫熒光細胞化學檢測 采用6孔板細胞爬片，高糖刺激24 h后終止培養(yǎng)，細胞用0.01 mol/L PBS沖洗數(shù)次，4%多聚甲醛固定30 min；0.5% Triton X-100 37 ℃打孔10 min，PBS沖洗，5 min×3次；正常山羊血清封閉，37 ℃孵育1 h；棄封閉液，滴加一抗(THEM4 1∶50)，4 ℃過夜；PBS沖洗，5 min×3次；滴加TRITC-羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h；PBS沖洗，5 min×3次；滴加 DAPI(1∶100配制)，37 ℃孵育10 min；PBS沖洗，5 min×3次；熒光顯微鏡下觀察并攝取圖像。

1.2.5ELISA檢測細胞上清液中ColⅠ、Col Ⅲ的含量 先后加入稀釋后的標準品50 μL、待測樣品50 μL于反應孔內，立即加入50μL生物素標記的一抗，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育45 min。甩去孔內液體，振蕩洗滌4次，每次30 s。每孔加入100 μL辣根酶標記的二抗，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育30 min。甩去孔內液體，振蕩洗滌4次，每次30 s。每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育5 min，避免光照。取出酶標板，迅速加入50 μL終止液，立即測定結果。在450 nm波長處測定各孔的OD值。結果判定：以標準品的OD值為縱坐標，相應標準品濃度為橫坐標，做標準曲線，樣品含量根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應濃度。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料比較分別采用F檢驗和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1高糖誘導下HKC內THEM4 mRNA及蛋白表達 THEM4 mRNA及蛋白在0 h均可見一定量基礎表達，隨著高糖刺激時間的延長而顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫熒光染色顯示THEM4主要表達并定位于0 h組HKC的胞質，而高糖刺激24 h時表達明顯減弱。見表1，圖1。

2.2高糖誘導下HKC內phospho-Akt(Ser 473)、 Akt蛋白表達 phospho-Akt(Ser 473)蛋白在高糖刺激0 h時表達較弱，隨著高糖刺激時間的延長而逐漸升高，并于高糖刺激后24 h達到高峰(P<0.05)，而總Akt蛋白表達在各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

組別THEM4mRNATHEM4蛋白0h1.000±0.0000.216±0.0216h0.282±0.173*0.205±0.00612h0.243±0.058*0.124±0.017*24h0.182±0.066*0.070±0.012*48h0.179±0.038*0.083±0.014*F63.32962.251P0.0000.000

*P<0.05與0 h比較(SNK-q檢驗)

圖1免疫熒光染色檢測高糖刺激0h(A)及24h(B)時HKC內THEM4蛋白表達

Figure1ImmunofluorescencestainingforTHEM4protein(indicatedinred)withDAPIcounterstaininginhighglucose-treatedHKCat0h(A)and24h(B)

組別phospho-Akt(Ser473)Akt0h0.063±0.0020.908±0.0556h0.074±0.0020.869±0.08612h0.182±0.001*#0.887±0.07324h0.686±0.002*#△0.901±0.06848h0.619±0.048*#△☆0.896±0.030F605.8460.160P0.0000.954

*P<0.05與0 h比較 #P<0.05與6 h比較 △P<0.05與12 h比較 ☆P<0.05 與24 h比較(SNK-q檢驗)

2.3高糖誘導下HKC內TGF-β1、α-SMA蛋白表達 Western blot結果顯示，TGF-β1及α-SMA蛋白在高糖刺激 0 h時均有極少量表達，隨著高糖刺激呈升高趨勢，并于24 h時表達較高；定量分析結果顯示，TGF-β1及α-SMA蛋白在高糖刺激后24 h的表達量分別是0 h表達量的13.4及1.8倍(P<0.05)。見表3。

將高糖刺激0 h 及24 h時HKC內THEM4與TGF-β1、α-SMA蛋白表達量進行相關性分析，結果顯示THEM4與后兩者蛋白均呈負相關關系(相關公式及相關系數(shù)分別為y=-5.100 9x+1.178,R2=0.971 1;y=-3.803 3x+1.408,R2=0.893 9)，表明隨著THEM4蛋白表達的降低，TGF-β1、α-SMA表達顯著增加。

組別TGF-β1α-SMA0h0.064±0.0110.614±0.0356h0.096±0.0150.951±0.020*12h0.429±0.085*#1.279±0.027*#24h0.856±0.054*#△1.085±0.150*#△48h0.243±0.021*#△☆0.382±0.008*#△☆F287.748748.353P0.0000.000

*P<0.05與0 h比較 #P<0.05與6 h比較 △P<0.05與12 h比較 ☆P<0.05與24 h比較(SNK-q檢驗)

2.4高糖誘導下HKC內ColⅠ、Col Ⅲ分泌 高糖刺激后24 h HKC內ColⅠ、Col Ⅲ分泌較0 h顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05) ，見表4。

組別ColⅠColⅢ0h11.615±0.5799.437±1.33124h14.831±2.72015.639±3.281t10.60219.233P0.0010.000

3 討 論

DN是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一，最終導致終末期腎衰竭[9-10]。涉及病因及發(fā)病機制非常復雜，包括血流動力學改變、糖代謝紊亂、脂質代謝異常、炎癥、生長因子、自噬[11]等多種因素。研究表明Akt的異常激活及TGF-β1的過表達參與了高糖誘導的腎小管上皮細胞向間質細胞轉分化過程，從而引起腎臟ECM過度沉積，啟動DN腎間質纖維化[12]。在高糖環(huán)境中，Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅳ型各種膠原以及蛋白多糖、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白等基質蛋白合成及降解失衡是引起ECM沉積的根本原因。本研究也證實，高糖可誘導HKC內phospho-Akt(Ser 473)、 TGF-β1及α-SMA表達增強，并伴隨ColⅠ、ColⅢ的分泌。提示出現(xiàn)ECM沉積。而關于高糖如何激活Akt信號通路的機制研究目前尚未完全明確，探討其機制并尋求潛在干預靶點將為DN的防治起到關鍵作用。

有學者發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物通過抑制Akt信號通路能夠緩解DN腎間質纖維化[13]。Shemesh等[14]也發(fā)現(xiàn)AS101通過對Akt下游通路的藥理學抑制效應，能夠減輕DN的進展。THEM4作為Akt內源性負向調控因子，有學者發(fā)現(xiàn)維生素D能夠直接上調THEM4蛋白的表達，進而抑制Akt/NF-κB通路的活化及COX-2介導的炎癥反應[2]。在小鼠肝癌模型[3]中THEM4蛋白表達降低，而通過慢病毒轉染使THEM4過表達能有效抑制腫瘤的生長增殖。Knobbe等[15]研究發(fā)現(xiàn)在惡性膠質瘤中存在Akt信號通路異常，而THEM4表達降低會解除對Akt的抑制效應，從而促進惡性膠質瘤的發(fā)生；同時發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，惡性膠質瘤組織中的THEM4 mRNA的表達至少下調了50%，并與THEM4啟動子的甲基化相關。因此，THEM4轉錄水平的下調是惡性膠質瘤發(fā)生的機制之一。

本研究同樣發(fā)現(xiàn)在高糖培養(yǎng)HKC內THEM4 mRNA及蛋白均呈低表達。筆者推測這可能是導致Akt過度活化并上調TGF-β1、α-SMA的表達，最終引起ColⅠ、ColⅢ分泌增加的原因。因此，推測THEM4表達降低可能是導致DN的ECM沉積的潛在因素，故THEM4有望成為防治DN新的干預靶點。

本研究下一步擬采用質粒轉染技術將THEM4的表達質粒轉染至HKC，進一步探討THEM4在DN的ECM沉積中的確切機制，以及過表達THEM4能否逆轉Akt的激活，進而下調TGF-β1和α-SMA蛋白的表達，減輕ECM沉積，為DN的防治提供新的思路。

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EffectofTHEM4expressiononcollagensecretioninhumanembryokidneyepithelialcellstreatedwithhighglucose

CHEN Ning1, YANG Yong-hui1, AN Xiao-ying1, ZHU Gui-yun1, KANG Li-fei1, HAO Jun2*

(1.DepartmentofPathology,HebeiChestHospital,Shijiazhuang050041,China; 2.DepartmentofPathology,BasicmedicalCollege,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

ObjectiveTo investigate the expression of thioesterase superfamily member 4(THEM4) and the relationship between THEM4 and collagen secretion in human embryo kidney epithelial cells(HKC) treated with high glucose.MethodsIn vitro cultured HKC were respectively treated with high glucose(30 mmol/L) for 0, 6, 12, 24 and 48 h. Then cells were collected for the extractions of RNA and total protein. Subsequently, THEM4 mRNA was detected by the method of Real-time PCR. The THEM4, phospho-Akt(Ser 473), transforming growth factor β1(TGF-β1) and α-smooth muscle actin(α-SMA) protein expressions were examined by Western blot. As well, immunofluorescence staining was used to explore the expressions and locations of THEM4. Again, collagenⅠ(ColⅠ) and collagen Ⅲ(Col Ⅲ) were detected using the competitive sandwich ELISA kit.Results①High glucose inhibited THEM4 expression, and induced increased phospho-Akt(Ser 473), TGF-β1, α-SMA in HKC. Again, THEM4 was negatively correlated with TGF-β1 and α-SMA expression(correlation formula: y=-5.100 9x+1.178,R2=0.971 1; y=-3.803 3x+1.408,R2=0.893 9 respectively); ② High glucose induced secreted ColⅠand secreted Col Ⅲ in HKC.ConclusionHigh glucose caused increased ColⅠand Col Ⅲ secretions likely by inhibiting THEM4, up-regulating phospho-Akt(Ser 473), TGF-β1 and α-SMA expressions in HKC.

kidney tubules； epithelial cells； collagen secretion; thioesterase superfamily member 4

2017-08-30；

2017-09-21

河北省醫(yī)學科學研究重點課題(20150604)

陳寧(1983-)，女，河北石家莊人，河北省胸科醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事病理學診斷研究。

*通訊作者

R587.2

A

1007-3205(2017)12-1434-05

劉斯靜)