鮭魚降鈣素及甲狀旁腺素(1-34)對卵巢切除大鼠椎體骨密度及骨組織形態(tài)計量學影響的比較

駱 陽，齊 璨，羅鵬遠，梁少博，田發(fā)明，張 柳

(1.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院創(chuàng)傷急救中心，河北 石家莊 050051;2.華北理工大學醫(yī)學實驗中心，河北 唐山 063000;3.華北理工大學附屬醫(yī)院骨科，河北 唐山 063000)

·論著·

鮭魚降鈣素及甲狀旁腺素(1-34)對卵巢切除大鼠椎體骨密度及骨組織形態(tài)計量學影響的比較

駱 陽1，齊 璨1，羅鵬遠1，梁少博1，田發(fā)明2，張 柳3

(1.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院創(chuàng)傷急救中心，河北 石家莊 050051;2.華北理工大學醫(yī)學實驗中心，河北 唐山 063000;3.華北理工大學附屬醫(yī)院骨科，河北 唐山 063000)

目的比較鮭魚降鈣素(salmon calcitonin,CT )及甲狀旁腺素( parathyroid hormone,PTH)(1-34)對卵巢切除大鼠腰椎骨密度(bone mineral density,BMD)及骨組織形態(tài)計量學的影響。方法40只3月齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，隨機分為4組，每組10只：假手術(Sham)組；雙側卵巢切除(OVX)組；雙側卵巢切除+甲狀旁腺素(1-34)(OVX+PTH)組；雙側7卵巢切除+鮭魚降鈣素(OVX+CT)組。OVX+CT組及OVX+PTH組于卵巢切除術后3個月分別給予皮下注射CT或PTH(1-34)。連續(xù)給藥3個月后處死所有大鼠并收集標本。取L4椎體進行BMD檢測。L5椎體進行Gemisa染色及骨組織形態(tài)計量學檢測。結果卵巢切除術后6個月，OVX組BMD顯著低于Sham組(P<0.05)，而OVX+CT組及OVX+PTH組椎體BMD顯著高于OVX組(P<0.05)，且OVX+PTH組BMD顯著高于OVX+CT組(P<0.05)。OVX組BV/TV低于Sham組，OVX+CT組高于OVX組，OVX+PTH組BV/TV高于Sham組、OVX組、OVX+CT組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。OVX組、OVX+CT組Tb.Th低于Sham組，OVX+PTH組高于Sham組、OVX組、OVX+CT組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。OVX組Tb.Sp高于Sham組，OVX+CT組和OVX+PTH組低于OVX組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組大鼠Tb.N差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論CT及PTH(1-34)可顯著增加卵巢切除大鼠腰椎BMD并抑制骨重建的高轉換狀態(tài)，且PTH(1-34)作用要優(yōu)于CT。

骨質疏松；骨密度；甲狀旁腺；降鈣素

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.008

骨質疏松是以骨量減少，骨顯微結構破壞，骨脆性增加，生物力學結構改變，易發(fā)生骨折為特征的一種全身性骨病，骨質疏松是老年人尤其是絕經后婦女的常見病及多發(fā)病[1-3]。隨著人口老齡化進程的加速，骨質疏松及其所引起的骨折作為當前的一個嚴重的社會問題而備受關注。骨質疏松藥物主要分為骨吸收抑制劑[降鈣素(calcitonin，CT)、雙膦酸鹽、雌激素等]和刺激骨形成的藥物[甲狀旁腺素(parathyroid hormone,PTH)、氟化物等]兩大類[4-5]。CT通過抑制骨吸收防止骨量下降[6-8]。PTH可促進成骨活性、抑制成骨細胞凋亡、增加新骨形成[9-13]。本研究通過卵巢切除術建立骨質疏松大鼠模型，應用CT及PTH(1-34)進行干預，通過骨密度(bone mineral density,BMD)及骨組織形態(tài)計量學檢測，比較CT及PTH(1-34)對卵巢切除大鼠椎體骨量及骨重建的影響。

1 材 料 與 方 法

1.1動物來源及分組 3月齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級，平均體質量(260±30) g。動物購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。隨機分為4組(每組10只)：假手術(Sham)組；卵巢切除組(OVX)；卵巢切除+降鈣素組(OVX+CT)及卵巢切除+甲狀旁腺素(OVX+PTH)組。所有大鼠均分籠飼養(yǎng)，自由攝食水。室溫(24±2) ℃，自然光照，動物飼料購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2骨質疏松大鼠模型制備 用10%的水合氯醛按3 mL/kg劑量對大鼠腹腔麻醉，取側臥位，以后方髂骨嵴上2 cm、脊柱旁1 cm處為中心備皮，碘伏消毒術區(qū)，鋪手術巾。以后方髂骨嵴上2 cm、脊柱旁1 cm處縱行切開，依次切開皮膚、皮下組織及筋膜組織，鈍性分離肌層，暴露腹腔。于切口下方脂肪組織中暴露卵巢及輸卵管(成熟卵巢為淡紅色菜花狀，黃豆大小，與輸卵管相連，表面有不規(guī)則結節(jié)狀卵泡)，用鑷子將卵巢及其周圍的軟組織提起后，絲線結扎周圍組織及輸卵管，切除卵巢，將切除卵巢后的組織還納回腹腔，對手術切口進行逐層縫合，關閉腹腔。應用碘伏對切口周圍進行消毒。對側卵巢切除依照此方法進行切除。Sham組只行背部切開手術，即暴露卵巢但不切除。

1.3藥物干預 卵巢切除術后3個月，OVX+CT組及OVX+PTH組皮下注射鮭魚降鈣素(瑞士諾華公司)16 U/kg,2 d 1次或甲狀旁腺素(1-34)(美國Sigma公司)30 μg/kg每天1次。連續(xù)給藥3個月后以過量麻醉的方法處死所有大鼠，取L4椎體進行BMD測量。L5椎體進行Gemisa染色及骨組織形態(tài)計量學檢測。

1.4檢測方法

1.4.1椎體BMD檢測 應用QDR Discovery雙能X線吸收骨密度測量儀(Hologic, Bedford, MA, USA)對椎體進行BMD檢測，應用小動物掃描模式進行掃描。掃描結束后，用儀器自選工具選定所測椎體的興趣區(qū)，讀出每個標本的BMD值，并記錄[14]。

1.4.2椎體Gemisa染色及骨組織形態(tài)計量學檢測 將L5椎體置于70%酒精固定液中固定2 d，剔除椎體表面的韌帶及肌肉組織，并沿正中矢狀位剖開椎體，然后進行梯度脫水。置于包埋劑(成分為甲基丙烯酸甲脂、鄰苯二甲基二丁脂、過氧化苯甲酰)中充分浸透。已浸透的標本置于10 mL大小的玻璃瓶中，倒入新鮮配置的浸液約5 mL后，調整椎體于瓶底中間位置。再放入42 ℃烤箱內聚合凝固。包埋塊凝固后，用鋸修理包埋塊，以適合于切片機的大小，硬組織切片機進行切片，厚度為8 μm。組織切片進行Gemisa染色，應用Leica DMLB2熒光/光學顯微鏡及Leica DC300數(shù)碼攝像系統(tǒng)對椎體硬組織切片進行測量，大鼠椎體骨組織形態(tài)計量學測算范圍為距骺板1～4 mm，兩側皮質骨內膜之間的松質骨，應用Leica QWin病理圖象分析軟件進行椎體骨組織形態(tài)計量學參數(shù)測定，經公式計算得出骨小梁相對體積(percent trabecular area,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp)。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)經Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗和Bartlett方差齊性檢驗后，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1椎體BMD檢測結果 卵巢切除術后6個月，OVX組大鼠椎體BMD顯著低于Sham組(P<0.05)，而OVX+PTH組及OVX+CT組大鼠椎體BMD與OVX組相比顯著增高(P<0.05)，且OVX+PTH組大鼠椎體BMD顯著高于OVX+CT組(P<0.05)。值得注意的是，OVX+PTH組椎體BMD顯著高于Sham組(P<0.05)。見表1。

表1卵巢切除術后6個月各組大鼠腰椎骨密度結果
Table1BMDvaluesamongthethreegroupsat6monthsafteroperation

組別BMDSham組0.293±0.011OVX組0.242±0.008*OVX+CT組0.274±0.014*#OVX+PTH組0.331±0.020*#△F37.213P0.000

*P<0.05與Sham組比較 #P<0.05與OVX組比較 △P<0.05與OVX+CT組比較(LSD-t檢驗)

2.2椎體骨組織形態(tài)結果 各組大鼠L5椎體組織切片經Gemisa染色后可見：卵巢切除術后6個月，OVX組松質骨骨小梁寬度較Sham組減少，骨小梁排列稀疏；而PTH(1-34)及CT干預后，OVX+PTH組及OVX+CT組較OVX組松質骨骨小梁排列整齊，骨小梁寬度明顯增加(圖1)。

圖1各組大鼠椎體(Gemisa染色×20)

A.Sham組；B.OVX組；C.OVX+CT組；D.OVX+PTH組

Figure1lumbarvertebraineachgroup(Gemisastaining×20)

2.3椎體骨組織形態(tài)計量學檢測結果 各組大鼠Tb.N差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。OVX組BV/TV低于Sham組，OVX+CT組高于OVX組，OVX+PTH組BV/TV高于Sham組、OVX組、OVX+CT組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。OVX組、OVX+CT組Tb.Th低于Sham組，OVX+PTH組高于Sham組、OVX組、OVX+CT組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。OVX組Tb.Sp高于Sham組，OVX+CT組和OVX+PTH組低于OVX組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

組別 BV/TV(%)Tb.Th(μm)Tb.N(mm-1)Tb.Sp(μm)Sham組42.64±3.1281.94±8.225.23±0.40110.31±10.88OVX組26.85±4.69*54.73±14.70*5.11±1.35151.02±37.5OVX+CT組37.53±5.19#63.31±9.05#6.06±1.31109.76±38.31OVX+PTH組58.44±5.97*#△123.14±25.13*#△4.82±0.5486.03±6.82#F8.05511.6401.2932.302P0.0000.0000.2960.073

*P<0.05與Sham組比較 #P<0.05 與OVX組比較 △P<0.05與OVX+CT組比較 (LSD-t檢驗)

3 討 論

雌激素缺乏是絕經后女性骨質疏松的主要原因，雌激素缺乏引起骨轉換率增高，骨吸收大于骨形成，骨小梁數(shù)量減少，骨小梁變細，乃至斷裂，骨小梁難以承受原來的載荷，導致骨強度下降，易于發(fā)生骨折，這將嚴重影響患者的生活質量[15]。卵巢切除大鼠是公認的模擬人類絕經后骨質疏松的經典動物模型。卵巢切除所導致的大鼠骨量降低與人類絕經后骨質疏松有相似之處[16]。本課題組前期研究結果顯示，行雙側卵巢切除術后12周可成功建立骨質疏松大鼠模型[17-21]。因此，本研究通過雙側卵巢切除術建立骨質疏松大鼠模型，并應用CT及PTH對其進行干預，比較CT及PTH對卵巢切除大鼠椎體骨量及骨代謝的影響。

目前治療骨質疏松的藥物主要有兩大類：一類為骨吸收抑制劑如CT，主要通過抑制破骨細胞增殖和骨吸收，降低骨轉化率，增強成骨細胞的活性和增殖分化，從而減少骨丟失，使機體骨骼組織鈣、磷等物質沉積增加；另一類為促進骨形成類藥物如PTH(1-34)，主要通過刺激骨形成增加BMD，對抑制骨吸收作用不明顯[22]。Wronski等[23]和Zhang等[24]研究結果顯示，給予卵巢切除大鼠PTH 16 U/kg，2 d 1次或PTH(1-34)每天30 μg/kg 可有效維持卵巢切除大鼠松質骨骨量。因此，本研究選擇此劑量進行對比研究。

骨組織的強度除了與骨組織結構有關外，更主要的是與骨量相關[25]。骨量與骨組織強度呈正相關性，骨組織強度的60%～80%由骨量決定，而 BMD 是全面評價骨量和診斷骨質疏松的可靠指標，也是衡量臨床骨質疏松癥治療效果的評價指標[26-28]。本研究結果顯示，卵巢切除術后3個月，分別給予CT及PTH(1-34)治療3個月后，OVX+PTH及OVX+CT組大鼠腰椎BMD顯著均高于OVX組(P<0.05)，且OVX+PTH組腰椎BMD顯著高于OVX+CT組(P<0.05)。說明PTH(1-34)及CT均可提高卵巢切除大鼠腰椎BMD，且PTH(1-34)改善骨質疏松作用較CT作用強。

骨組織的病理改變也是評價骨質疏松的重要參考指標[29]。本研究發(fā)現(xiàn)卵巢切除術后6個月，Gemisa染色結果顯示OVX組與Sham組相比椎體顯微結構明顯退變，骨小梁稀疏或斷裂。而OVX+CT組及OVX+PTH組與OVX組相比，椎體骨小梁增粗，骨小梁之間的連接較多。表明CT及PTH可以明顯改善骨組織的顯微結構，發(fā)揮治療骨質疏松的作用。

骨顯微結構直接決定骨骼局部的力學強度，而骨組織形態(tài)計量技術是目前了解骨顯微結構變化的最好的方法。骨顯微結構的改變是導致骨質疏松及發(fā)生骨質疏松性骨折的重要病理環(huán)節(jié)。骨組織形態(tài)計量學指標既是直接反映骨形成與骨吸收的重要指標，也是評估骨轉換狀態(tài)和骨質疏松程度、診斷分型及確定療效的重要指標。骨組織形態(tài)計量學方法可以精確地反映出骨重建過程的變化規(guī)律和特點，并有可能就此提出某一時段用藥治療的方針，同時也能對研究對象所處的狀態(tài)作出正確的評價。因此，本研究進一步觀察了CT及PTH對卵巢切除大鼠椎體骨組織形態(tài)計量學的影響。卵巢切除術后6個月，OVX組BV/TV及TB.Th顯著低于Sham組(P<0.05)，說明卵巢切除后雌激素缺乏引起骨小梁變薄、變細，骨小梁組織形態(tài)發(fā)生了改變。而經過CT及PTH(1-34)治療后，OVX+CT組及OVX+PTH組BV/TV、TB.Th顯著高于OVX組(P<0.05)，且OVX+PTH組BV/TV、TB.Th顯著高于OVX+CT組(P<0.05)，說明CT及PTH(1-34)可有效降低卵巢切除大鼠椎體骨轉換率，減少椎體骨量的丟失，而PTH(1-34)對于降低卵巢切除大鼠椎體骨轉換率、增加椎體骨量的作用明顯優(yōu)于CT。

綜上所述，基于本研究所用藥物的劑量及干預周期，PTH對于增加卵巢切除大鼠腰椎BMD、抑制椎體的高轉換作用的治療效果明顯優(yōu)于CT。

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Comparisonoftheeffectsofsalmoncalcitoninandparathyroidhormone(1-34)onbonemineraldensityandbonehistomorphometryofvertebrainovariectomizedrats

LUO Yang1， QI Can1， LUO Peng-yuan1, LIANG Shao-bo1, TIAN Fa-ming2， ZHANG Liu3

(1.DepartmentofOrthopedicSurgery,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China; 2.MedicalResearchCenter,theNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China; 3.DepartmentofOrthopaedicSurgery,theAffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

ObjectiveTo compare the effects of salmon calcitonin(CT) and parathyroid hormone(PTH)(1-34) on bone mineral density and bone histomorphometry of vertebra in ovariectomized rats.MethodsForty female Sprague-Dawley rats aged 3 months were randomly divided into four groups(with 10 rats each). All rats but those in the Sham group

ovariectomy and treated by vehicle(OVX), salmon calcitonin(OVX+CT) and PTH(1-34)(OVX+PTH). After animals were sacrificed at 6 months post-OVX, the L4-5spinal segments were harvested. Bone mineral density(BMD) and histomorphometry analysis were performed to evaluate the bone mass and microstructural changes in the lumbar vertebral bodies．Histological analysis with Gemisa staining was used to identify the characteristics of the degenerative discs.ResultsSix months after OVX, the BMD values of L4vertebral bodies in the OVX group were significantly decreased, compared with the Sham group(P<0.05)．The BMD values in the OVX+CT group and OVX+PTH group were significantly increased，compared with the OVX group(P<0.05), and the BMD values in the OVX+PTH group were significantly increased than that in the OVX+CT group(P<0.05). The BV/TV values of L5vertebral bodies in the OVX group were significantly decreased, compared with the Sham group, the BV/TV values in the OVX+CT group were significantly increased than that in the OVX group, the BV/TV values in the OVX+PTH group were significantly increased, compared with the Sham, OVX and OVX+CT group(P<0.05). The Tb.Th values in the OVX group and OVX+CT group were significantly decreased, compared with the Sham group, the Tb.Th values in the OVX+PTH group were significantly increased than that in the Sham group, OVX group and OVX+CT group(P<0.05). The values of Tb.Sp in the OVX group were higher than that in the Sham group, OVX+CT group and OVX+PTH group(P<0.05). There are no significantly changes of Tb.N values in each groups(P>0.05).ConclusionBoth salmon calcitonin and parathyroid hormone(1-34) can improve the bone mass and suppress the high bone turn-over in OVX rats. But the effect of parathyroid hormone(1-34) to suppress the bone resorption and improve the bone mass is better than that of salmon calcitonin.

osteoporosis; bone density; parathyroid hormone; calcitonin

2017-07-31；

2017-08-23

河北省醫(yī)學科學研究重點課題(20170137)

駱陽(1982-)，男，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事骨外科疾病診治研究。

R681.1

A

1007-3205(2017)12-1392-05

許卓文)