風(fēng)車子抑素A4對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的抑制增殖與誘導(dǎo)自噬作用研究

黃澤智，蔣傳命，蘇 敏，覃熙媛，羅志勇

(1.邵陽學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，湖南 邵陽，422000；2.中南大學(xué) 分子生物學(xué)研究中心，湖南 長沙，410000)

風(fēng)車子抑素A4對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的抑制增殖
與誘導(dǎo)自噬作用研究

黃澤智1，蔣傳命1，蘇 敏2，覃熙媛2，羅志勇2

(1.邵陽學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，湖南 邵陽，422000；2.中南大學(xué) 分子生物學(xué)研究中心，湖南 長沙，410000)

目的研究自噬在風(fēng)車子抑素A4(Combretastatin A4，CA4)抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖中的作用，探討CA4抑制血管生成的機(jī)制。方法體外培養(yǎng)HUVECs，采用不同濃度的CA4處理HUVECs，藥物作用不同時間后用MTT法檢測CA4對細(xì)胞存活率的影響，MDC染色檢測10nM CA4處理不同時間自噬小體變化的情況，RT-PCR檢測自噬相關(guān)基因LC3B和Beclin 1基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，Western Blot檢測LC3B和Beclin1的蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果CA4能抑制HUVECs增殖并在一定范圍呈濃度依賴性和時間依賴性；10nM CA4處理12小時和24小時自噬小體顯著增加，誘導(dǎo)HUVECs自噬；熒光定量PCR結(jié)果顯示自噬相關(guān)基因LC3Ⅰ表達(dá)下調(diào)、LC3Ⅱ表達(dá)上調(diào)，LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值顯著上調(diào)，Beclin 1表達(dá)上調(diào)；Western Blot結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果一致，但mTOR蛋白未見明顯變化。結(jié)論CA4能顯著抑制HUVECs增殖和誘導(dǎo)HUVECs自噬。

風(fēng)車子抑素A4;自噬;內(nèi)皮細(xì)胞

血管生成(angiogenesis)是指從已經(jīng)存在的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展形成新的血管的過程，它與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等過程密切相關(guān)。血管生成與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境下分泌促血管生成因子，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖生長，從而使腫瘤內(nèi)血管新生。許多生物學(xué)過程都可成為抗腫瘤藥物作用的靶點，如抑制細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制腫瘤血管生成等，其中抑制血管生成已成為抗腫瘤研究的重要方向[1]。

風(fēng)車子抑素(Combretastatin)系列化合物是由學(xué)者Pettit從風(fēng)車子屬南非柳樹Combretum caffrum樹皮中分離得到，包括17種結(jié)構(gòu)相似的化合物，其中風(fēng)車子抑素A4(Combretastatin A4,CA4)的活性最強(qiáng)。CA4的基本結(jié)構(gòu)為A、B兩個苯環(huán)經(jīng)順式乙烯橋連接，苯環(huán)上有一些甲氧基基團(tuán)。CA4結(jié)構(gòu)式如圖1所示，CA4是新型的微管蛋白秋水仙堿位點結(jié)合劑，目前正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗，應(yīng)用前景十分看好。

圖1CA4的結(jié)構(gòu)

Fig.1StructureofCA4

細(xì)胞自噬(autophagy or autophagocytosis)又稱為Ⅱ型細(xì)胞死亡，是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(autophagy related gene，Atg)等調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程。 近十多年來的研究顯示，自噬作為一種高度保守的適應(yīng)機(jī)制，在腫瘤細(xì)胞中被保留下來，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的不同階段，自噬可能起著不同的作用。在腫瘤治療過程中發(fā)現(xiàn)了一些因素能引起細(xì)胞自噬，盡管適度的自噬能促進(jìn)細(xì)胞存活，但自噬樣死亡經(jīng)常被觀察到。因此，如何促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入“自噬樣死亡程序”，成為腫瘤治療研究的新熱點。目前，關(guān)于自噬在CA4抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的作用報道較少，本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)為對象，初步探討自噬在CA4抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的作用。

莫言的文學(xué)作品《檀香刑》改編為歌劇，將于國家大劇院上演，并于11月12日召開媒體見面會。這位諾獎得主告訴媒體，近兩年，他將主要精力用于寫作戲曲文學(xué)劇本，以實現(xiàn)自己多年夙愿。18年前出版的這本小說中也融入了山東地方戲“茂腔”的元素。他認(rèn)為，唯有寫出具有中國特色和個人特性的作品，才能使中國文學(xué)在世界文學(xué)版圖上占有一席之地。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

HUVECs購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

MDC染色經(jīng)熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)10nM CA4處理的HUVECs細(xì)胞核周圍區(qū)域陽性染色，呈點狀結(jié)構(gòu)，隨著作用時間的增加，MDC染色細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，每組統(tǒng)計100個細(xì)胞，計算點狀聚集MDC熒光的細(xì)胞比例，實驗重復(fù)三次，求平均值與標(biāo)準(zhǔn)差。各時間點(0、6、12、24h)的自噬細(xì)胞比率分別為(5.36±0.25)%、(9.38±0.18)%、(20.31±0.41)%、(28.45±0.34)%。與對照組相比，12h、24h處理組細(xì)胞自噬顯著增多(p<0.05)。24h處理組細(xì)胞自噬率達(dá)到最大值，與對照組相比顯著增多(p<0.01)，見圖3。

收集不同濃度CA4(0、5、10、20nM)處理24h的HUVECs細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解緩沖液中提取蛋白(按試劑盒操作說明書進(jìn)行操作)。測蛋白總濃度，各取30μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，按Western Blot方法，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以封閉液(5%脫脂奶粉)封閉，0.1%TTBS清洗后，分別加入一抗，于4℃溫育2h?？贵w按照說明書以1∶1 000稀釋。加入稀釋二抗工作液，于室溫溫育2h。進(jìn)行顯影，Image Lab軟件對目的條帶以全自動圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，計算其積分吸光度，以與內(nèi)參GAPDH吸光度值之比反映各基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變。

1.2 材料

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

收集10nM CA4處理不同時間(0、6、12、24h)的HUVECs細(xì)胞，PBS清洗2次，除去培基，4%多聚甲醛固定15min，加入50μM MDC染色，37℃溫育60min，PBS清洗2次，熒光顯微鏡下觀察。每組統(tǒng)計100個細(xì)胞，計算含自噬細(xì)胞的比例。

1.4 CA4對HUVECs細(xì)胞增殖的檢測

取對數(shù)生長期的HUVECs細(xì)胞，按5×103/孔接種到96孔板中，每孔加入200μl培養(yǎng)基，于孵箱中培養(yǎng)24小時，將細(xì)胞分為空白對照組、加藥組(0、5、10、50、100nM)，每組設(shè)5個復(fù)孔，分別作用12、24、48、72h，加入MTT 20μl(5g/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10min于570nm波長處用酶標(biāo)儀測各孔吸光度A，重復(fù)實驗三次，取平均值與標(biāo)準(zhǔn)差。

物聯(lián)網(wǎng)相關(guān)技術(shù)在果蔬運(yùn)輸系統(tǒng)的推廣應(yīng)用，通過各類現(xiàn)有的通信網(wǎng)絡(luò)接入到物聯(lián)網(wǎng)管理中心、信息中心，實現(xiàn)物與物、物與人的鏈接，實現(xiàn)對物品和過程的智能化感知、識別和管理。物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)并不是一個單向技術(shù)，而是多種信息領(lǐng)域的新技術(shù)組合。

1.5 CA4對HUVECs細(xì)胞自噬的影響

用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2、95%飽和濕度培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

兩年后，老板終于松口，答應(yīng)放李高明回家，條件是他必須做到春節(jié)前。李高明高興，但他沒有日歷、手表，靠什么算日子呢？李高明看著工地旁的包谷地，估摸著等包谷收完了，再過一段時間，他應(yīng)該就能回去了?！罢娴氖强粗莻€包谷地過，等著時間回家?！?/p>

1.6 CA4對HUVECs細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

收集不同濃度CA4(0、5、10、20nM)處理24h的HUVECs細(xì)胞，加入1ml Trizol試劑，提取細(xì)胞總RNA。采用invitrogen M-MLV cDNA合成試劑盒進(jìn)行cDNA合成。合成體系為總RNA 1μl，Oligo(dT)1μl，雙蒸水10μl，dNTP 混合物(10mmol·L-1)2μl，RNase抑制劑1μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，5×Reaction buffer 4μl，總體積20μl。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：cDNA模板 1μl， dNTP 混合物(10mmol·L-1)1μl，上游引物(20μmol·L-1)1μl，下游引物(20μmol·L-1)1μl，2× Μltra-SYBR Mixture(With ROX)8μl，雙蒸水8μl，總體積20μl。擴(kuò)增反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10min，然后以94℃30 s，60℃45 s，72℃1min的程序循環(huán)35次，72℃延伸10min。PCR引物序列(Premier sequence)5.0軟件設(shè)計(見表1)。以GAPDH為內(nèi)參對照，用下表1中引物進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，每個樣品重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，基因表達(dá)水平的差異采用公式2-△△Ct計算。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.7 CA4對HUVECs細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

MSU晶體的生長速率取決于尿酸鹽離子的濃度[9]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，在溫度和尿酸鹽濃度保持恒定時，晶體長度與時間呈線性關(guān)系；當(dāng)尿酸鹽濃度升高時，晶體生長速率隨之加快。該研究進(jìn)一步在生理pH值、溫度、Na+濃度下發(fā)現(xiàn)，尿酸鹽離子濃度小于4 mmol/L時，MSU晶體出現(xiàn)溶解現(xiàn)象；尿酸鹽離子濃度為4 mmol/L時，晶體保持穩(wěn)定；尿酸鹽離子濃度為4～8 mmol/L時，晶體持續(xù)生長[8]。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

CA4由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院饋贈，溶劑采用DMSO，貯存母液濃度為10mM。DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；青鏈霉素購自杭州四季青公司；0.25%胰蛋白酶購自Hyclone公司；MTT、DMSO試劑購自Sigma-Aldrich公司；小分子量蛋白Marker購自Fermentas公司；PVDF膜購自Millipore公司；Western blotting化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Invitrogen公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce公司；Beclin1抗體、LC3 Ⅱ抗體均購自英國Abcam公司，invitrogen M-MLV cDNA合成試劑盒購自杭州沃森生物科技公司等。

2 結(jié)果

2.1 CA4對HUVECs細(xì)胞增殖的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，不同濃度的CA4分別處理HUVECs細(xì)胞12、24、48和72h ，根據(jù)測得各組A值，計算細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示5、10、50、100nM CA4對HUVECs細(xì)胞處理24h均有抑制作用，且抑制率呈明顯的劑量依賴效應(yīng)，隨著時間的延長，抑制效應(yīng)增加，不同濃度之間有顯著差異。當(dāng)CA4作用于HUVECs細(xì)胞48h后，測得的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為10nM，見圖2。

圖2 CA4抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖Fig.2 CA4 inhibited cell proliferation of HUVECSCell proliferation was determined by MTT assay after being treated with different concentration CA4 at varying times(12,24,48 and 72h).All data were represented as means±SD,n=3

2.2 CA4對HUVECs細(xì)胞自噬的影響

以信息化為基礎(chǔ)，在物聯(lián)網(wǎng)、工業(yè)大數(shù)據(jù)等新興技術(shù)的支撐下，區(qū)別于傳統(tǒng)“一刀切”模式，做到不同線路、不同車型、不同維修深度的維修對象精準(zhǔn)化是城市軌道交通車輛維修集約范式轉(zhuǎn)移的一個方向。

圖3 CA4對HUVECs細(xì)胞自噬的影響Fig.3 The inducing effect of CA4 on autophagy of HUVECsA、B、C、D stand for the number of autophagosomes treated with 10 nM CA4 at different times(0、6、12、24h)

2.3 CA4對HUVECs細(xì)胞自噬相關(guān)基因mRNA的影響

熒光定量PCR結(jié)果顯示，用不同濃度CA4(0、5、10、20 nM)分別處理24h，計算各組HUVECs細(xì)胞中自噬相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平與內(nèi)參基因GAPDH的比率。結(jié)果顯示10nM CA4處理組LC3Ⅱ基因與對照組相比顯著增高(p<0.05)，LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比值各藥物處理組都顯著增加。各組beclin1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與對照組比較均存在顯著性增高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。mTOR基因表達(dá)則未見明顯變化(結(jié)果見表2)。

Western Blot結(jié)果，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的熒光積分度比值表示蛋白表達(dá)量，不同濃度CA4處理組的LC3B、Beclin1蛋白表達(dá)均下降，各加藥組與對照組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；20nM組與對照組比較，差異非常顯著(p<0.01)，且蛋白表達(dá)量呈劑量依賴性下降。蛋白電泳圖譜顯示，結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果相一致。但mTOR蛋白未見明顯變化，見圖4。

表2 不同濃度CA4處理HUVECs細(xì)胞自噬相關(guān)基因mRNA變化(%±SD，n=3)Table 2 The change of mRNA,the HUVECs autophagy-related gene, treated by CA4 of different concentration

注：“*”表示p<0.05。

2.4 CA4對HUVECs細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

如果說“宗經(jīng)”是運(yùn)行《文心雕龍》的第一條樞軸，屬于顯性的，那么該書還有第二條樞軸存在，它隱默地支撐著全書的結(jié)構(gòu)。線索來源于劉勰自述全書體系的末尾句，即“位理定名，彰乎大易之?dāng)?shù)，其為文用，四十九篇而已”。該句比照《易傳·系辭》“大衍之?dāng)?shù)五十，其用四十有九”之說，王弼注云：“演天地之?dāng)?shù)所賴者曰五十也，其用四十有九，則其一不用也。不用而用以之通，非數(shù)而數(shù)以之成，斯易之太極也?！盵注]孔穎達(dá)：《周易正義》，臺北：藝文印書館，2007年，第152頁。

圖4 CA4對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The inducing effeot of CA4 on the expression of HUVECs autophagy-related proteinsThe expression result of autophagy-related proteins caused by CA4 of different concentration(0、5、10、20nM)treating HUVECs

3 討論

血管生成過程主要依賴于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和管腔的形成。腫瘤組織能通過腫瘤細(xì)胞分泌促血管生成因子，刺激內(nèi)皮細(xì)胞排列成血管。血管生成對腫瘤的生長具有重要作用。血管生成抑制劑既可以直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的功能，也可以間接作用于腫瘤細(xì)胞。近年來，抑制血管生成的研究成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要方向，傳統(tǒng)的抗血管生成主要通過抑制血管生長因子的產(chǎn)生、抑制血管生長因子的活性，調(diào)節(jié)生長因子受體的活性，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及分化為新生血管等機(jī)制來發(fā)揮作用[1]。大量臨床前數(shù)據(jù)表明，CA4具有廣譜的體外抗腫瘤活性，其抗腫瘤作用是通過破壞血管形成[2]。我們的前期研究證實CA4通過VEGF/VEGFR2信號途徑而發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用。此外，研究表明CA4對多藥耐藥株也有明顯的抑制細(xì)胞增殖的作用，風(fēng)車子抑素類化合物在過表達(dá)BCRP的腫瘤細(xì)胞中也展示了潛在的活性[3]，這些研究為CA4與其它腫瘤藥物的聯(lián)合應(yīng)用提供重要基礎(chǔ)。

自噬是真核細(xì)胞降解其內(nèi)容物，以實現(xiàn)細(xì)胞自身的代謝需求和某些細(xì)胞器的更新，是細(xì)胞的防御機(jī)制和生存機(jī)制，也是細(xì)胞死亡的方式之一。自噬在許多有機(jī)體的各種生理過程中起著重要的作用，包括應(yīng)激反應(yīng)、腫瘤抑制、細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器的質(zhì)量控制等[4,5]。

腫瘤細(xì)胞在代謝壓力、缺氧、營養(yǎng)缺乏及抗腫瘤治療等惡劣的細(xì)胞外環(huán)境下表現(xiàn)出抗凋亡活性，腫瘤細(xì)胞在這樣艱難的環(huán)境中生存，自噬起著關(guān)鍵性的作用[6]。自噬的激活能刺激死亡或通過促生存途徑來響應(yīng)化療引起的刺激，通常，促生存作用更明顯。通過抑制自噬可以增加腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性[7]。抗血管生成治療產(chǎn)生的缺氧和饑餓導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞自噬也能調(diào)節(jié)腫瘤耐藥性和生存。Li等報道，JNK-Bcl-2信號途徑與CA4誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬相關(guān)：抑制JNK的活性能抑制自噬，并促進(jìn)CA4誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；用Bcl-2抑制劑直接阻斷自噬通路同樣能促進(jìn)CA4誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[8]。

風(fēng)車子抑素類化合物是血管破壞劑，并能造成促進(jìn)促生存的自噬發(fā)生的環(huán)境，在CA4治療的腫瘤中能通過電子顯微鏡觀察到自噬的發(fā)生，但是自噬在這些腫瘤中的作用還不是很明確[9]，它與自噬抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用效果有待進(jìn)一步的臨床研究。

本研究通過MTT實驗檢測了CA4對HUVECs細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)，并觀察到CA4處理的HUVECs細(xì)胞經(jīng)MDC染色出現(xiàn)明顯的自噬泡增多現(xiàn)象，LC3B和Beclin1的mRNA和蛋白質(zhì)水平的結(jié)果顯示自噬增強(qiáng)現(xiàn)象，這表明CA4明顯誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞自噬增強(qiáng)。因此，CA4不僅能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬，也能誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞的自噬發(fā)生。自噬可能在CA4抑制HUVECs細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮重要的作用，自噬亦可能參與腫瘤血管生成。抑制自噬是否會增強(qiáng)抗腫瘤藥物的敏感性，血管生成抑制劑與自噬抑制劑的聯(lián)合使用是否會有更好的效果，聯(lián)合使用是否減低血管生成抑制劑的細(xì)胞毒性，這些問題有待進(jìn)一步探討。

本研究發(fā)現(xiàn)CA4誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞自噬增強(qiáng)現(xiàn)象，為CA4與自噬抑制劑的聯(lián)合用藥提供了初步的思路和實驗依據(jù)，但仍有很多問題需要進(jìn)一步研究。

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StudyontheProliferationInhibitionandAutophagy-inducingEffectsofCombretastatinA4onHumanUmbilicalVeinEndothelialCells

HUANG Zezhi1, JIANG Chuanming1, SU Min2, QIN Xiyuan2, LUO Zhiyong2

(1.School of Medical Laboratory, Shaoyang University, Shaoyang 422000, China;(2.Research Center of Molecular Biology, Central South University, Changsha 410000, China)

combretastatin A4;autophagy;endothelial cells

1672-7010(2017)06-0090-07

Q786

A

2017-09-18

湖南省教育廳科學(xué)研究項目(15C1465);湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目(15B220)

黃澤智(1964-)，男，湖南新寧人，教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究;E-mail:huangzz1964@163.com

Received：ObjectiveTo investigate the role of autophagy in the proliferation inhibition effect of Combretastatin A4(CA4) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), and to explore the mechanism of angiogenesis inhibition.MethodsHUVECs were cultured in vitro and treated with different concentration of CA4. The effect of CA4 on cell survival rate was determined by MTT method after a varying period of time,the treatment effect of 10nM CA4 on autophagosome at different time was determined by Monodansylcadaverin(MDC) staining methods,the genetic transcription level changes of autophagy-associated genes, LC3 and Beclin 1, were determined by Real Time PCR,the protein expressionlevel changes of LC3 and Beclin 1 were detected by Western Blot.ResultsCA4 can inhibit the proliferation of HUVECs,the inhibition depends on concentration and time in certain range,the autophagosomes treated by 10nM CA4 for 12 hours and 24 hours increased significantly, inducing autophagy in HUVECs cells,the results of real time PCR showed that the expression of LC3Ⅰ, the autophagy-related gene, was down-regulated, the expression of LC3 Ⅱ was up-regulated, the LC3Ⅰ to LC3 Ⅱ ratio was significantly up-regulated and the expression of Beclin 1 was up-regulated,the results of Western Blot was the same as that of real time PCR,but there was no obvious changes in the expression of mTOR protein.ConclusionCA4 can inhibit the proliferation of HUVECs significantly and induce the autophagy of HUVECs.