固定化酶催化制備乙酸正丁酯及動力學

王洪海，李旭，李春利，劉文靜

（河北工業(yè)大學化工節(jié)能過程集成與資源利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300130）

固定化酶催化制備乙酸正丁酯及動力學

王洪海，李旭，李春利，劉文靜

（河北工業(yè)大學化工節(jié)能過程集成與資源利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300130）

酯交換反應(yīng)可用南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)作催化劑，采用溶膠-凝膠法固定脂肪酶CALB得到的催化劑顆?？捎糜谝宜嵋阴ズ驼〈嫉孽ソ粨Q反應(yīng)。首先探究了固定化酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，然后在間歇反應(yīng)釜內(nèi)進行反應(yīng)動力學實驗，考察了轉(zhuǎn)速、催化劑用量、酯醇比、溫度等因素對反應(yīng)的影響，確定了適宜的操作條件。在328.15～343.15 K下，將實驗數(shù)據(jù)擬合得到反應(yīng)的動力學方程，通過實驗值與計算值的比較，驗證此宏觀動力學方程合理，可用于模擬計算。

催化劑；生物催化；動力學；酶；固定化

引 言

乙酸正丁酯，簡稱乙酸丁酯，是具有果香氣味的液體，是優(yōu)良的有機溶劑、分析試劑和萃取劑，也應(yīng)用于香料工業(yè)。隨著環(huán)境問題日益突出，人們更傾向于用乙酸正丁酯替代甲苯、二甲苯、酮類等溶劑，因而乙酸正丁酯具有很廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。

工業(yè)上普遍采用酸性催化劑合成乙酸正丁酯，由醋酸和丁醇直接酯化反應(yīng)。但這種方法有很多缺點，如副產(chǎn)物多、轉(zhuǎn)化率低、設(shè)備腐蝕問題等[3]。因此人們研究了新型催化劑來替代濃硫酸，如固體酸[4]和雜多酸[5]等酸性催化劑、分子篩和離子交換樹脂等負載型催化劑[6]、離子液體催化劑[7]等。這些催化劑雖然解決了設(shè)備腐蝕、副反應(yīng)少等缺點，但是仍存在反應(yīng)轉(zhuǎn)化率不高和環(huán)境污染的問題。因此開發(fā)一種生產(chǎn)效率高、環(huán)境友好型催化劑和生產(chǎn)工藝顯得尤為重要。

生物酶催化劑與化學催化劑相比具有活性大、選擇性高、反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境無污染的優(yōu)點，但是仍存在使用后無法回收、與產(chǎn)物混合造成后續(xù)分離困難、活性和穩(wěn)定性受溫度和pH影響的問題。而酶的固定化解決了以上問題使其可方便用于催化反應(yīng)。但是，反應(yīng)最終的轉(zhuǎn)化率往往會受熱力學和動力學的限制[8-9]。因此，如果將固定化酶催化劑與反應(yīng)精餾相結(jié)合，即通過移除生成物的方法有望達到提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率與分離效率的目的[10-11]。目前，將生物酶催化與反應(yīng)精餾相結(jié)合的研究還處于起步

階段[12-15]。

本文提出通過凝膠-溶膠的方法固定液態(tài)南極假絲酵母脂肪酶B（CALB），用于乙酸乙酯-正丁醇體系酯交換反應(yīng)，重點探究固定化酶催化酯交換反應(yīng)的較適宜條件，得出動力學方程，為接下來模擬計算和開發(fā)耐高溫生物酶催化劑及酶催化反應(yīng)精餾打下理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

CALB發(fā)酵液（所含蛋白質(zhì)量分數(shù)為6%），購買于諾維信公司。乙醇（EtOH）、乙酸乙酯（EtAC）、正丁醇（BuOH）、乙酸丁酯（BuAC）、甲醇（MeOH）、聚乙二醇（PEG 400）、乙腈、甲基三甲氧基硅烷（MTMS）均購買于天津市大茂化學試劑廠。氟化鈉購買于天津市風船化學試劑科技有限公司。正硅酸甲酯（TMOS）購買于天津希恩思生化科技有限公司。所有化學試劑均為分析純。

1.2 CALB固定化

本文采用溶膠-凝膠包埋法[16-17]固定 CALB液體，在已知文獻的基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化[18]。需要配制交聯(lián)劑和溶劑。交聯(lián)劑的配制：將質(zhì)量比為 1：3：3的正硅酸甲酯、甲基三甲氧基硅烷和甲醇混合，然后在冰水浴中攪拌。溶劑的配制：將質(zhì)量比為1：4：9：15 的聚乙二醇、氟化鈉（1 mol·L-1）、去離子水、CALB液體混合。交聯(lián)劑與溶劑的質(zhì)量比為3：2。將溶劑倒入交聯(lián)劑內(nèi)，為避免反應(yīng)放熱對酶的損害，在冰水浴中攪拌 3 min，然后移至室溫即得到含有CALB的溶膠。

凝膠顆粒的制備方法：溶膠在室溫下干燥，約20 min即可得到CALB凝膠固體，用研缽將凝膠研磨成直徑為1～1.5 mm小顆粒，可作為酯交換反應(yīng)催化劑進行反應(yīng)動力學探究。

1.3 動力學實驗

選用乙酸乙酯和正丁醇為反應(yīng)物，反應(yīng)生成乙酸丁酯和乙醇。為得到在CALB催化作用下的酯交換反應(yīng)動力學參數(shù)，在間歇攪拌釜中進行了此反應(yīng)動力學實驗。實驗采用水浴加熱，冷卻水冷凝。實驗操作過程如下：首先將所需量的反應(yīng)物乙酸乙酯和正丁醇分別水浴加熱到指定溫度，然后將二者加入間歇攪拌釜中混合，再加入所需質(zhì)量的固定化CALB顆粒，密封。打開攪拌器開始反應(yīng)，每隔30 min進行取樣分析。當分析結(jié)果顯示間歇攪拌釜內(nèi)各組分濃度趨于穩(wěn)定時，停止反應(yīng)。

1.4 分析方法

1.4.1 氣相色譜 實驗所需分析的樣品都經(jīng)氣相色譜進行分析。色譜條件：毛細柱OV1701，50 m×0.32 mm×0.5 μm，氫火焰FID檢測器，柱溫140℃，進樣溫度200℃，檢測室溫度210℃，進樣量為0.2 μl。色譜工作站為N2000，數(shù)據(jù)處理采用校正歸一法，相對校正因子見表1。

表1 相對校正因子Table 1 Data of correction factor

1.4.2 酶活力測定 用乙酸乙酯和正丁醇的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)作為酶活性測試方法。實驗條件為乙酸乙酯和正丁醇摩爾比為 1：1，反應(yīng)溫度為 60℃，轉(zhuǎn)速為 300 r·min-1。反應(yīng)后所測樣品和乙腈混合后在離心機離心1.5 min，然后用氣相色譜進行分析。定義每分鐘催化消耗 1 μmol乙酸乙酯所需的酶質(zhì)量為一個活力單位（U）。固定化脂肪酶活性所占同等質(zhì)量的游離脂肪酶活性的比例作為固定化脂肪酶的相對活性，并定義相同質(zhì)量的游離脂肪酶活性為100%[19]。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 固定化CALB特性

經(jīng)上述方法測試得游離酶 CALB的活性為(510±17)U·g-1，固定化凝膠顆粒 CALB 的酶活性為(484±12) U·g-1，此結(jié)果表明用溶膠-凝膠法固定后酶活性并沒有明顯損失。

2.1.1 固定化CALB的穩(wěn)定性 為了確定固定化酶的長期穩(wěn)定性，將固定化酶放置于25℃的干燥環(huán)境中，每間隔5 d對其進行酶活性的測試，其相對活性隨時間的變化如圖1所示。從圖中可以看出，固定化酶的活性并未出現(xiàn)明顯的損失，40 d后其相對活性仍為92%，說明此固定化方法優(yōu)良。

圖1 固定化酶CALB的穩(wěn)定性Fig.1 Long-term stability of CALB immobilized

2.1.2 固定化CALB的重復(fù)使用性 為了確定固定化酶CALB的重復(fù)使用性，采用分批式反應(yīng)的方法，方法和條件同1.4.2節(jié)，反應(yīng)體系溫度定為70℃，當?shù)孜镛D(zhuǎn)化率達到50%時停止反應(yīng)，用磷酸緩沖液洗滌固定化酶3次并干燥后加入到預(yù)熱好的下一批次的反應(yīng)液中進行反應(yīng)，每次固定化酶的相對活性隨反應(yīng)次數(shù)的實驗結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，70℃下固定化酶CALB活性略有下降，但仍能在重復(fù)使用10次之后保持90%的相對活性，且活性降低趨于平穩(wěn)，說明重復(fù)使用性很好。

2.2 反應(yīng)動力學研究

2.2.1 外擴散影響的消除 反應(yīng)動力學數(shù)據(jù)的測定需要在消除外擴散影響的前提下進行，實驗可以通過增大攪拌速率來消除外擴散的影響。當攪拌速率增大，而正丁醇的最大轉(zhuǎn)化率不再變化時，即認為消除了外擴散影響。在溫度為 65℃、醇酯摩爾比1：1、催化劑質(zhì)量為正丁醇質(zhì)量 5%的條件下，測定正丁醇轉(zhuǎn)化率隨攪拌速率的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，當轉(zhuǎn)速由200 r·min-1增大到300 r·min-1時，正丁醇的轉(zhuǎn)化率有明顯提高；當攪拌速率繼續(xù)增大至400 r·min-1，正丁醇的轉(zhuǎn)化率變化不大?？紤]到過大的攪拌速率不僅會增加能耗，而且也會增大對設(shè)備及催化劑顆粒的磨損，因此攪拌速率選擇 300 r·min-1。

圖2 固定化酶CALB的重復(fù)使用性Fig.2 Relative activity of CALB after repeated use

圖3 攪拌速率對正丁醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of stirring rate on conversion of n-butanol

2.2.2 催化劑用量的影響 催化劑的用量對反應(yīng)影響較大，用量過少會使反應(yīng)速率減小，導致反應(yīng)時間增長，催化劑過量又會造成資源的浪費。為了探究合適的催化劑用量對反應(yīng)的影響，進行了如下實驗：溫度為65℃、醇酯摩爾比1：1，攪拌速率為300 r·min-1，催化劑用量分別為正丁醇質(zhì)量的5%、10%、15%。對實驗結(jié)果分析作圖，見圖 4?？梢钥闯?，當催化劑用量由 5%增至 10%時，反應(yīng)達到平衡的時間明顯縮短；繼續(xù)增加催化劑用量至15%時，反應(yīng)速率并未有明顯提升。因此催化劑用量選定為正丁醇質(zhì)量的10%。

2.2.3 酯醇摩爾比的影響 反應(yīng)物的用量對酯交換轉(zhuǎn)化率起到?jīng)Q定性影響。為探究兩種反應(yīng)物的進料配比進行了以下實驗。

（1）正丁醇過量

在溫度為65℃，催化劑用量為乙酸乙酯質(zhì)量的10%，攪拌速率為300 r·min-1的情況下，正丁醇與乙酸乙酯的摩爾比分別為 1：1、1.25：1、1.5：1 時進行了3組平行實驗。催化劑用量對乙酸乙酯的轉(zhuǎn)化率影響如圖5所示。從圖中可以看出當正丁醇過量后，乙酸乙酯的轉(zhuǎn)化率未上升反而出現(xiàn)下降，表明增加正丁醇用量對固定化CALB的催化效果有抑制作用[20]。

圖4 催化劑用量對正丁醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of catalyst dosage on conversion of n-butanol

圖5 進料醇酯比對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of initial molar ratio on conversion of ethyl acetate

圖6 進料酯醇比對正丁醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of initial molar ratio on conversion of n-butanol

圖7 溫度對正丁醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of temperature on conversion of n-butanol

（2）乙酸乙酯過量

在溫度為 65℃、催化劑用量為正丁醇質(zhì)量的10%，攪拌速率為300 r·min-1的情況下，乙酸乙酯與正丁醇摩爾比分別為 1：1、1.5：1、2：1、2.5：1 時進行了3組平行實驗，催化劑用量對正丁醇的轉(zhuǎn)化率影響如圖6所示。從圖中可以看出隨著乙酸乙酯量的增加，正丁醇的轉(zhuǎn)化率也隨之增加，當酯醇摩爾比為2：1時，再增大乙酸乙酯的量正丁醇轉(zhuǎn)化率變化不明顯，因此選擇酯醇摩爾比為2：1。

2.2.4 溫度的影響 溫度是影響化學反應(yīng)平衡的一個重要因素，升高溫度有利于加快反應(yīng)速率，但是CALB長時間在高溫條件下活性容易受損。為探究酯交換反應(yīng)的最適溫度，在催化劑用量為正丁醇質(zhì)量的10%、攪拌速率為300 r·min-1、酯醇摩爾比為2：1的條件下，反應(yīng)溫度分別為55、60、65、70℃時探究溫度對正丁醇轉(zhuǎn)化率的影響，實驗結(jié)果如圖7所示。從圖7中可以看出，隨著反應(yīng)溫度升高，正丁醇轉(zhuǎn)化率也升高。當溫度為70℃時，轉(zhuǎn)化率最大為61%。實驗中當溫度繼續(xù)上升嚴重損傷酶的活性，因此溫度上限選擇70℃。

在328.15、333.15、338.15、343.15 K下得到反應(yīng)平衡時各物質(zhì)的平衡摩爾組成，可根據(jù)式(1)得到各個溫度下的反應(yīng)平衡常數(shù)

根據(jù)平衡常數(shù)與反應(yīng)溫度的關(guān)系可得到圖 8，由圖8可得到二者之間的關(guān)系為

圖中的點根據(jù)Van’t Hoff方程計算反應(yīng)焓變，可得標準反應(yīng)焓變?yōu)棣=11.39 kJ·mol-1，證明反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，同時根據(jù)圖8的變化趨勢也證實了該反應(yīng)為吸熱反應(yīng)。

2.2.5 與傳統(tǒng)催化劑的比較 催化劑作為影響反應(yīng)的重要因素，常用的酯交換反應(yīng)催化劑有陽離子樹脂、分子篩、無機催化劑等，文獻中對不同種類催化劑的性能進行了深入研究，結(jié)果顯示無機催化劑Si-3的催化性能最佳[1]。進行了傳統(tǒng)催化劑Si-3與固定化CALB的催化性能的實驗研究。在Si-3與固定化酶各自最優(yōu)條件下進行反應(yīng)，Si-3催化正丁醇能達到的最高轉(zhuǎn)化率為50%，本文固定化酶催化正丁醇的轉(zhuǎn)化率能達到60%。表明固定化CALB催化酯交換反應(yīng)有良好的性能。

圖8 反應(yīng)溫度對平衡常數(shù)的影響Fig.8 Effect of reaction temperature on equilibrium constant

2.3 動力學方程的擬合

該酯交換反應(yīng)為可逆二級反應(yīng)[21]，反應(yīng)速率可描述為

根據(jù)動力學模型，將實驗數(shù)據(jù)進行線性回歸擬合，得到反應(yīng)的Arrhenius點，見圖9。

由此可得到該酯交換反應(yīng)的Arrhenius方程為

根據(jù) Arrhenius方程線性回歸擬合可以得到相應(yīng)的動力學參數(shù)，數(shù)值見表2。

圖9 反應(yīng)速率常數(shù)與溫度的關(guān)系Fig.9 Relation of reaction rate constant and temperature

表2 擬均相模型的動力學參數(shù)Table 2 Kinetic parameters

最終得到乙酸乙酯和正丁醇反應(yīng)的動力學方程

其中

3 結(jié) 論

（1）固定化酶CALB的活性與穩(wěn)定性好，25℃下將固定化酶CALB保存40 d后活性無明顯損失，說明此固定化方法合適。

（2）根據(jù)動力學實驗得出乙酸乙酯和正丁醇酯交換反應(yīng)的最適條件：轉(zhuǎn)速300 r·min-1、催化劑用量為正丁醇質(zhì)量的10%、反應(yīng)溫度70℃、酯醇摩爾比為2：1，且正丁醇過量會抑制CALB的催化活性。

（3）對測得的動力學數(shù)據(jù)進行擬合，得到乙酸乙酯和正丁醇酯交換反應(yīng)的動力學方程。

符 號 說 明

A——指前因子，L·mol-1·min-1

c——濃度，mol·L-1

Ea——活化能，J·mol-1

K——反應(yīng)平衡常數(shù)

k——反應(yīng)速率常數(shù)，L·mol·min-1

R——氣體常數(shù)，J·mol-1·K-1

r——反應(yīng)速率，mol·L-1·min-1

T——反應(yīng)溫度，K

下角標

+——正反應(yīng)方向

-——逆反應(yīng)方向

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date:2017-07-10.

Prof.LI Chunli,lichunli_hebut@126.com

supported by the Science and Technology Research and Development Plan of Hebei Province,China (16214505D).

Kinetics ofn-butyl acetate prepared by immobilized enzyme

WANG Honghai,LI Xu,LI Chunli,LIU Wenjing
(National-Local Joint Engineering Laboratory for Energy Conservation of Chemical Process Integration and Resources Utilization,Hebei University of Technology,Tianjin300130,China)

Candida antarcticalipase B(CALB) is immobilized by entrapment in a hydrophobic silica xerogel.Firstly,the stability and reuse of immobilized enzymes are investigated and can be stored for at least 40 d at 25℃without any significant loss of enzyme activity.Then,the transesterification of ethyl acetate withn-butanol in the presence of immobilized CALB is considered in a batch stirred tank reactor.The reaction kinetics is experimentally determined for different stirring rate,catalyst dosage,concentration and temperature.The suitable operating conditions are determined and a pseudo homogeneous kinetic model is established.The calculation data are in better agreement with the experimental data which shows that the kinetic equations are reasonable and suitable for simulation calculation.

catalyst; biocatalysis; kinetics; enzyme; immobilization

TQ 031.2; Q 503

A

0438—1157（2017）12—4685—06

10.11949/j.issn.0438-1157.20170881

2017-07-10收到初稿，2017-09-26收到修改稿。

聯(lián)系人：李春利。

王洪海（1974—），男，教授。

河北省科技計劃項目(16214505D)。