佛手果低聚糖超聲波輔助水浸提工藝研究

呂瑤瑤，李若蹊，張延杰，夏 雨，王 娟

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.咀香園健康食品（中山）有限公司，廣東 中山 528437）

佛手果低聚糖超聲波輔助水浸提工藝研究

呂瑤瑤1，2，李若蹊1，張延杰2，夏 雨2，王 娟1

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.咀香園健康食品（中山）有限公司，廣東 中山 528437）

利用超聲波輔助水提取技術(shù)，以腌制佛手果為原料，考察提取時(shí)間、超聲時(shí)間、提取溫度、料液比對(duì)佛手果低聚糖提取得率的影響，采用正交試驗(yàn)對(duì)佛手果低聚糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，從單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)結(jié)果以及節(jié)約能源角度，得出最佳工藝條件為：提取時(shí)間2 h，超聲時(shí)間20 min，提取溫度80℃，料液比1∶8，在此條件下，佛手果低聚糖得率為5.99（±0.15）%。采用體外結(jié)合膽酸鹽實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)佛手果低聚糖的降血脂功能，結(jié)果顯示，佛手果低聚糖對(duì)膽酸鈉（SC）、?；悄懰徕c（STC）的吸附能力較強(qiáng)，其結(jié)合量分別為20.30（±0.39）、19.61（±0.71）μmol/mg，對(duì)甘氨膽酸鈉（SGC）吸附能力較弱，其結(jié)合量只為14.38（±2.23）μmol/mg，提示佛手果低聚糖可能具有一定的降血脂功能。

佛手果；低聚糖；超聲波；提??；降血脂

低聚糖（Oligosaccharide），又稱寡糖，是由2～10個(gè)單糖通過末端的還原性羥基與其他單糖的羥基形成糖苷鍵，糖苷鍵縮聚連接形成的直鏈或支鏈的低度聚合糖［1］。低聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類繁多，使低聚糖多樣的功能有了分子結(jié)構(gòu)上的解釋，體現(xiàn)在生物的新陳代謝過程中［2］。低聚糖作為一種有著多種生理功能，熱量低甜度小，對(duì)人體無毒副作用且生產(chǎn)原料充足的小分子物質(zhì)有著極大的研究空間和研究潛力，其保健功能的開發(fā)有著無限前景，可作為新型保健食品的材料和添加劑，滿足人們對(duì)保健品更細(xì)致和更養(yǎng)生的要求。

前人研究多側(cè)重于佛手果多糖、揮發(fā)油和黃酮類物質(zhì)［3-4］，對(duì)于佛手低聚糖的研究暫時(shí)是一片空白，而陳摯等［5］在胡蘆巴調(diào)血脂研究時(shí)發(fā)現(xiàn)低聚糖在調(diào)血脂功能等多方面效果優(yōu)于多糖。目前低聚糖物理提取手段有溶劑浸提法、超聲波輔助浸提法、微波輔助浸提法、超高壓輔助浸提法和膜分離法［6-8］。提取生物活性成分時(shí)，為了保留其活性和性質(zhì)常常采用超聲波［9］或超高壓等提取溫度較低，對(duì)成分保留較為完好的方法。本試驗(yàn)主要針對(duì)佛手果低聚糖的提取工藝方法及其降血脂功能，選擇在超聲波輔助下使用水浴浸提法進(jìn)行研究，與傳統(tǒng)水浴浸提法相比提取效率更高，并優(yōu)化提取工藝。低聚糖含量測(cè)定使用苯酚-硫酸法，依據(jù)顯色狀況判斷其糖種類，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光值計(jì)算含量，研究不同工藝條件下低聚糖得率的變化［10］，并采用體外結(jié)合膽酸鹽法測(cè)定佛手果低聚糖對(duì)3種膽酸鹽的吸附量，初步研究其降血脂效果［11-12］，為佛手果低聚糖的進(jìn)一步研究提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮佛手果、腌制佛手果，均由廣東展翠食品有限公司提供。

JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物股份有限公司；SHA-B恒溫水浴振蕩器，常州奧華儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器公司；紫外/可見分光光度計(jì)，日本島津公司；TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52AA真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；JA1003電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 佛手果低聚糖提取 按照一定的料液比將佛手果與水混合，提?。ǔ暡ㄝo助水浸提，超聲波功率650 W），離心、抽濾去除果渣，旋蒸濃縮，濃縮至原體積1/4左右，servage法去除蛋白質(zhì)，4倍體積無水乙醇沉淀，去除脂類、多糖，靜置，離心（3 000 r/min，15 min），收集上清液，旋蒸濃縮，濃縮液即為佛手果低聚糖粗提取液［8，13］。

1.2.2 低聚糖含量測(cè)定［14-15］采用苯酚-硫酸法對(duì)低聚糖進(jìn)行測(cè)定。其原理是樣品溶液中的可溶性糖與濃硫酸反應(yīng)脫水后，生成糖醛或糖醛衍生物。糖醛衍生物能與苯酚發(fā)生縮合反應(yīng)，生成有色物質(zhì)。樣品中糖種類不同可呈現(xiàn)不同顏色反應(yīng)—單糖可反應(yīng)顯紫紅色，低聚糖則呈棕黃色。在490 nm處己糖有最大吸收峰，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系，據(jù)此可測(cè)得所含低聚糖量，并根據(jù)其顏色不同確定糖種類［14-15］。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取干燥的105℃無水葡萄糖150 mg于500 mL容量瓶中，配制成0.30 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，按表1配制成階梯濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以2.0 mL蒸餾水作為空白對(duì)照。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

每支試管中加入6%苯酚溶液1.0 mL，混勻后迅速加入7.0 mL濃硫酸，立即置于冷水浴中。20 min后于490 nm處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

得回歸方程：y = 10.94x + 0.017，R2=0.999，表明在490 nm波長(zhǎng)下，吸光度值與葡萄糖含量有良好的線性關(guān)系。

樣品溶液的測(cè)定：將所獲得的粗沉淀溶解于250 mL蒸餾水，吸取5 mL于100 mL容量瓶中配制成樣品溶液。準(zhǔn)確吸取樣品溶液0.5 mL于20 mL具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)充至2.0 mL。向試管中分別加入1.0 mL 6%的苯酚溶液后搖勻，再迅速加入濃硫酸7.0 mL，并將試管置于冷水浴中冷卻。取2.0 mL蒸餾水于試管中依次加入苯酚和硫酸溶液作為空白對(duì)照。待20 min后即可于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的吸光度。每組樣品測(cè)量?jī)纱稳∑骄怠Ｒ罁?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中的低聚糖含量，得出低聚糖得率：

1.2.3 佛手果低聚糖提取的單因素試驗(yàn) 選取料液比、浸提溫度、超聲時(shí)間、提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察這些因素對(duì)佛手果低聚糖提取效果的影響［16］。

1.2.4 佛手果低聚糖提取的正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用4因素3水平按L9（34）正交設(shè)計(jì)優(yōu)化佛手果低聚糖的提取工藝，各因素及水平設(shè)計(jì)如表2所示，每個(gè)處理3次重復(fù)［17-18］。

表2 佛手果低聚糖提取正交試驗(yàn)因素水平

1.2.5 降血脂功能測(cè)定 采用所測(cè)定目標(biāo)成分對(duì)膽酸鹽吸附率的方法表示低聚糖降血脂的能力。移取0.5 mL低聚糖粗糖液于試管中，用pH=6.8的磷酸緩沖液補(bǔ)至2 mL；并以2 mL磷酸緩沖液為空白對(duì)照，分別加入2 mL膽酸鹽（?；悄懰徕cSTC、甘氨膽酸鈉SGC、膽酸鈉SC）溶液，37℃恒溫振蕩1 h，離心（4 000 r/min，20 min），取1.5 mL上清液于具塞試管中，加入4.5 mL 60%的硫酸溶液混合均勻，70℃水浴20 min，冰浴5 min，紫外分光光度計(jì)387 nm處測(cè)定吸光度，3次重復(fù)［19］。

圖2 膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確分別稱量膽酸鈉（SC）、?；悄懰徕c（STC）、甘氨膽酸鈉（SGC）各0.0216、0.0268、0.0244 g于50 mL容量瓶中，配制成1 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)膽酸鹽溶液，按表配制成階梯濃度的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液。以1.5 mL緩沖液作為空白對(duì)照。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，得膽酸鈉（SC）標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 2.828x + 0.008，R2= 0.994。?；悄懰徕c（STC）的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y =1.757x + 0.063，R2=0.997。甘氨膽酸鈉（SGC）的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 2.356x + 0.003，R2=0.996。

表3 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2 結(jié)果與分析

2.1 佛手果低聚糖提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)佛手果低聚糖的影響 稱取30 g腌制佛手果于500 mL燒杯中，選取料液比1∶10 g/mL，浸提溫度80℃，超聲時(shí)間10 min，測(cè)定提取時(shí)間分別為1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h時(shí)佛手果低聚糖的得率，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間在1～3 h時(shí)，佛手果低聚糖的得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高，當(dāng)提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，低聚糖得率達(dá)到最高、為3.40%，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。提取時(shí)間越長(zhǎng)，原料中的成分在溶劑中溶解和擴(kuò)散得越充分和完全，提取率越高。但成分量是一定的，當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡后提取率不再增加。此時(shí)若再延長(zhǎng)提取時(shí)間，反而會(huì)使雜質(zhì)增多，使目標(biāo)成分的溶出受到影響，且提取效率較低，造成能源浪費(fèi)。

圖3 不同提取時(shí)間的低聚糖得率

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)佛手果低聚糖的影響 稱取30 g腌制佛手果于500 mL燒杯中，選取料液比1∶10 g/mL，浸提溫度80℃，提取時(shí)間2 h，測(cè)定超聲提取時(shí)間5、10、15、20和25 min時(shí)佛手果低聚糖的得率，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，在5～25 min超聲時(shí)間范圍內(nèi)提取時(shí)，佛手果低聚糖得率先隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，當(dāng)超聲時(shí)間為15 min時(shí)低聚糖得率最高、為2.02%，隨后呈下降趨勢(shì)。超聲時(shí)間在20、25 min時(shí)，低聚糖得率沒有顯著差異。隨著超聲時(shí)間增加，細(xì)胞被破碎的愈加完全，成分的溶出更加徹底，而低聚糖得率增加。當(dāng)擴(kuò)散平衡后，增加超聲時(shí)間也不會(huì)繼續(xù)增加成分的溶出。超聲時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使溶液中雜質(zhì)增多阻礙糖分溶出，同時(shí)隨著溶液溫度上升，劇烈的波動(dòng)可能導(dǎo)致成分破壞，導(dǎo)致低聚糖得率略有下降，造成能源浪費(fèi)。

圖4 不同超聲時(shí)間的低聚糖得率

圖5 不同提取溫度的低聚糖得率

2.1.3 提取溫度對(duì)佛手果低聚糖的影響 稱取30 g腌制佛手果于500 mL燒杯中，選取料液比1∶10 g/mL，提取時(shí)間2 h，超聲時(shí)間10 min，測(cè)定提取溫度 40、50、60、70、80℃時(shí)佛手果低聚糖的得率，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在40～80℃提取時(shí)，佛手果低聚糖得率隨提取溫度的提高呈上升趨勢(shì)，提取溫度為80℃時(shí)低聚糖得率最高、為2.52%，但與70℃時(shí)的得率沒有顯著性差異。溫度的提高有助于細(xì)胞內(nèi)成分更快地?cái)U(kuò)散到溶劑中，增加糖分在溶劑中的溶解率。當(dāng)溫度達(dá)70℃后，繼續(xù)升溫對(duì)低聚糖得率的增加不明顯。

2.1.4 料液比對(duì)佛手果低聚糖的影響 稱取30 g腌制佛手果于500 mL燒杯中，選取提取時(shí)間2 h，浸提溫度80℃，超聲時(shí)間10 min，料液比分別為 1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和 1∶12時(shí)佛手果低聚糖的得率，結(jié)果見圖6。由圖6可知，在1∶4～1∶12料液比范圍內(nèi)提取時(shí)，佛手果低聚糖得率隨料液比的降低呈先升高再下降隨后趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶6時(shí)，低聚糖得率最高、為1.78%。溶劑用量增加，增大了佛手果與溶劑的接觸面積，有利于佛手果低聚糖在溶劑中的溶解。但料液比過小，即溶劑用量過多，會(huì)導(dǎo)致后續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑時(shí)耗時(shí)過長(zhǎng)，使低聚糖遭到破壞。同時(shí)溶劑用量過多會(huì)使佛手果飄浮在溶劑表面，超聲時(shí)，超聲波經(jīng)過溶劑的反射后能量較弱，導(dǎo)致超聲對(duì)佛手果的作用減弱，造成低聚糖得率降低。

圖6 不同料液比的低聚糖得率

2.2 佛手果低聚糖提取正交試驗(yàn)

由表4可知，測(cè)超聲波輔助水浴提取佛手果低聚糖的得率受4種因素影響，由R值RB＞RA＞RC＞RD（即1.07＞0.62＞0.58＞0.57）判斷，得影響因素B＞A＞C＞D（即超聲時(shí)間＞提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比）。所得最佳低聚糖提取工藝條件為A2B3C3D3，即提取時(shí)間2.5 h，超聲時(shí)間20 min，提取溫度80℃，料液比1∶8。該組合不存在于原實(shí)驗(yàn)組中，按優(yōu)化參數(shù)做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在該工藝條件下低聚糖得率為5.99（±0.15）%，為最佳提取工藝條件。

表4 佛手果低聚糖提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 降血脂功能結(jié)果分析

腌制佛手低聚糖粗品與膽酸鹽結(jié)合量的結(jié)果如下：與膽酸鈉（SC）的結(jié)合量為20.30（±0.39）μmol/mg低聚糖；與?；悄懰徕c（STC）的結(jié)合量為19.61（±0.71）μmol/mg低聚糖；與甘氨酸鈉（SGC）的結(jié)合量為14.38（±2.23）μmol/mg低聚糖。

由上可知，佛手果的低聚糖對(duì)甘氨膽酸鈉（SGC）吸附能力最弱［20］，而對(duì)膽酸鈉（SC）和?；悄懰徕c（STC）無明顯差別，其吸附能力SGC＜SC≈STC。而佛手低聚糖對(duì)膽酸鹽的結(jié)合量，與夏雨等［10］測(cè)量的佛手果多糖相比可發(fā)現(xiàn)，低聚糖對(duì)膽酸鹽有較好的吸附效果，其吸附能力與佛手黃酮相當(dāng)，與陳摯等［5］先提取胡蘆巴多糖，再加入纖維素酶進(jìn)行降解得到胡蘆巴低聚糖所得出的低聚糖在調(diào)血脂功能等多方面效果優(yōu)于多糖結(jié)論相似。說明佛手低聚糖有較好的降低膽固醇含量的效果，可能具有較強(qiáng)的降血脂能力，還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)佛手果低聚糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)低聚糖提取效果的影響由大到小依次為：超聲時(shí)間＞提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比；正交試驗(yàn)結(jié)果表明，佛手果低聚糖提取的最佳工藝條件為提取時(shí)間2.5 h，超聲時(shí)間20 min，提取溫度80℃，料液比1∶8，此時(shí)提取的佛手果低聚糖得率最高、為5.99（±0.15）%，但與在試驗(yàn)號(hào)3工藝條件下提取的得率沒有顯著性差異，因此從節(jié)約能源角度考慮，選擇提取時(shí)間2 h、超聲時(shí)間20 min、提取溫度80℃、料液比1：8為最佳工藝條件。

本試驗(yàn)還采用體外結(jié)合膽酸鹽試驗(yàn)對(duì)佛手果低聚糖降血脂［21］能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明佛手果低聚糖對(duì)膽酸鹽具有一定的吸附力，具有一定的降血脂功能。本試驗(yàn)對(duì)于降血脂功能的測(cè)定采取了體外實(shí)驗(yàn)的膽酸鹽結(jié)合法，但對(duì)于生物是否真的有降血脂功效，需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證［22］。

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Study on ultrasonic assistant water extraction processing of Bergamot oligosaccharides

LYU Yao-yao1，2，LI Ruo-xi1，ZHANG Yan-jie2，XIA Yu2，WANG Juan1
（1. School of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China；2.Juxiangyuan Health Food （ZhongShan） Co.，Ltd. ，Zhongshan 528437，China）

Using preserved Bergamot as raw material，the extraction technology of ultrasonic assisted-water was studied. To optimize the extraction process of bergamot oligosaccharides technology，extraction time，ultrasonic time，extraction temperature，ratio of material to watek chosen as factors which affected the extraction rate by orthogonal test. Considering the results of single factor experiment，orthogonal experiment results and energy conservation，the optimum extraction technology was as follows: extraction time 2 h，ultrasonic time 20 min，extraction temperature 80℃，and ratio of material to water 1∶8. The yield of bergamot oligosaccharide can reach 5.99（±0.15）% under these conditions. The capabilities of bergamot oligosaccharide which reduced blood lipid function was estimated as index by bile salt-binding experiment. The results suggested that bergamot oligosaccharide presented stronger binding ability to sodium cholate （SC），sodium taurocholate （STC），which accounted for 20.30（±0.39）μmol/mg，19.61（±0.71）μmol/mg，respectively，while it presented weaker binding ability to glycocholate（SGC），which accounted for 14.38（±2.23）μmol/mg. Therefore，bergamot oligosaccharide have function of reducing blood lipid.

bergamot；oligosaccharides；ultrasonic；extraction ；lowering blood lipid

S666.9

A

1004-874X（2017）08-0106-07

呂瑤瑤，李若蹊，張延杰，等. 佛手果低聚糖超聲波輔助水浸提工藝研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（8）：106-112.

2017-03-06

廣東省產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目（2014B090904044，2016B090918093）

作者簡(jiǎn)介：呂瑤瑤（1988-），女，碩士，工程師，E-mail：881003yy@163.com

王娟（1981-），女，博士，副教授，E-mail：wangjuan@scut.edu.cn

（責(zé)任編輯 白雪娜）