不同地域馬齒莧多糖的總糖測(cè)定及抗氧化活性比較研究

□ 蔣妍妮 吉安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 黃小流 戴彩華 井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部

不同地域馬齒莧多糖的總糖測(cè)定及抗氧化活性比較研究

□ 蔣妍妮 吉安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 黃小流 戴彩華 井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部

本文旨在探討不同地域馬齒莧多糖體外抗氧化活性及測(cè)定其總糖含量。方法：苯酚-硫酸比色法測(cè)定馬齒莧多糖的總糖含量，分別采用Fenton法、DPPH法和FRAP法研究馬齒莧多糖體外抗氧化活性。結(jié)果：內(nèi)蒙古、安徽與河南的馬齒莧多糖的總糖含量分別為14.69%，31.54%，38.17%；對(duì)羥自由基與DPPH自由基清除能力為內(nèi)蒙古＞河南＞安徽，對(duì)Fe3+的還原力為河南＞內(nèi)蒙古＞安徽。結(jié)論：馬齒莧多糖有良好的體外抗氧化活性，多糖含量及體外抗氧化有地域性差異。

不同地域；馬齒莧多糖；總糖含量；體外抗氧化活性

馬齒莧（Portulaca oleracea L）為馬齒莧科植物全草，又名長(zhǎng)壽菜、螞蚱菜、馬舌菜等，可入藥，也可食用；馬齒莧是已在民間有較早應(yīng)用歷史的傳統(tǒng)中藥，目前是衛(wèi)生部劃定的78種藥食兩用野生資源之一?！侗静菥V目》與《滇南本草》分別記載，馬齒莧有“散血消腫，利腸滑胎，解毒通淋，治產(chǎn)后虛汗”，“清熱利濕，消炎解毒，消腫止痛”等功效；現(xiàn)代藥理及營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究馬齒莧有降血脂、降血糖，抗菌、抗病毒，松弛肌肉，保護(hù)血管、預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤等藥理活性，同時(shí)還有良好抗氧化、延緩衰老等營(yíng)養(yǎng)保健作用。

有機(jī)酸、黃酮類、生物堿類、多糖、氨基酸和礦物質(zhì)等是馬齒莧的主要化學(xué)成分。多糖稱為多聚糖（polysaccharide），結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，它不僅是儲(chǔ)存能量的物質(zhì)，同時(shí)具有重要生物學(xué)活性如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性、降血糖血脂等，目前已有香菇多糖、靈芝多糖、云芝多糖、黃氏多糖和豬苓多糖等應(yīng)用于臨床。當(dāng)前對(duì)于馬齒莧多糖活性的研究已有報(bào)道，吳榮昆[1]采用Fenton、DPPH及FRAP法研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖有一定的體外抗氧化活性。植物體內(nèi)糖類物質(zhì)蓄積可受氣候或生態(tài)環(huán)境影響，不同地域的馬齒莧多糖水平在同一收獲期內(nèi)是否會(huì)有差異，其體外抗氧化活性有無(wú)差別有待進(jìn)一步探討，為馬齒莧資源藥食開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 材料與試劑

馬齒莧全草分別采自內(nèi)蒙古（赤峰）、河南（洛陽(yáng)）和安徽（安慶）（2014年7月，自然曬干），經(jīng)井岡山大學(xué)生命科學(xué)院許東風(fēng)教授鑒定為馬齒覓（Portulaca oleracea L）；DPPH（二苯代苦味肼基自由基，上海源葉生物科技有限公司）；TPTZ（2,4,6-三吡啶基三嗪，上海源葉生物科技有限公司）；D-無(wú)水葡萄糖（≥ 98%，索萊寶公司）；硫酸亞鐵、無(wú)水乙醇、氯化鐵、水楊酸、鹽酸、丙酮、石油醚、過(guò)氧化氫、冰醋酸、無(wú)水乙醚、三水合醋酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

LS5紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）、DU215CD電子分析天平（奧豪斯）、RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、SHB-IIIA 循環(huán)水式多用真空泵（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）、DG160C粉碎機(jī)（浙江省瑞安市飛達(dá)藥材器械廠）、GRQ-05A干熱消毒箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 馬齒莧多糖的提取

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室條件及參考朱曉宦等試驗(yàn)方法，馬齒莧干料粉碎后過(guò)40目篩，脫脂，按以下條件進(jìn)行水提：料液比（1∶15，m/v）、溫度100 ℃、30 min/次（熱水浴回流，共4次），冷卻過(guò)濾，合并濾液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約50 mL。濃縮液分次加入95%乙醇、80%乙醇進(jìn)行層析，得到沉淀物后依次用無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚洗滌后干燥備用。

2.2 馬齒莧多糖的總糖測(cè)定

精確稱量一定質(zhì)量D-無(wú)水葡萄糖溶于重蒸餾水，定容配制成初始液，然后稀釋成不同質(zhì)量濃度倍數(shù)待測(cè)，采用苯酚-硫酸比色法，測(cè)得各濃度值對(duì)應(yīng)的吸光值，擬合方程制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 羥自由基清除率

采用Fenton法[2]：取4mL Fenton工作液和2 mL待測(cè)液混勻，避光靜置10 min，離心；取上清液4 mL，加入2 mL 6 mmol/L水楊酸充分混勻，避光靜置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值。羥自由基清除率=1-(A0-A1)/A2×100%，A0為不同濃度樣品的吸光值，A1為用蒸餾水替代水楊酸時(shí)測(cè)得對(duì)應(yīng)濃度樣品的吸光值，A2為蒸餾水替代樣品時(shí)測(cè)得空白對(duì)照吸光值。

2.4 DPPH自由基清除率[3]

取5 mL 1.141×10-4mol/L DPPH工作液（70%乙醇為溶劑）和0.5 mL不同濃度的樣品液混合均勻，避光靜置30 min，于523 nm處測(cè)定吸光值。DPPH自由基清除率=(1-A/A0)×100%，A為樣品吸光值，A0為對(duì)照樣吸光值。

2.5 還原力

采用FRAP法[4]：取0.3 mL不同濃度樣品和2.7 mL預(yù)熱至37 ℃的FRAP工作液混合均勻，避光靜置30 min，于593 nm處測(cè)定吸光值。FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取12.16 mg硫酸亞鐵溶于適量的水中，加入18 mol/L硫酸0.50 mL，再加蒸餾水稀釋至100 mL定容，并投入小鐵釘。取上述溶液依次分別配制4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2007軟件進(jìn)行線性及二次曲線擬合，得相關(guān)方程計(jì)算相應(yīng)數(shù)據(jù)并分析。

3 結(jié)果

3.1 馬齒莧多糖的總糖含量

依照2.2的方法，擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.4403x-0.0461（R2=0.995），計(jì)算得出內(nèi)蒙古、安徽和河南馬齒莧多糖的總糖含量分別為14.69%、31.54%和38.17%。由結(jié)果可知，河南與安徽馬齒莧多糖含量分別約是內(nèi)蒙古的2.60倍、2.15倍，表明河南與安徽馬齒莧多糖的總糖含量比較接近，內(nèi)蒙古總糖含量明顯低于河南與安徽的。

3.2 馬齒莧多糖清除羥自由基的能力

由圖1可見(jiàn)，馬齒莧多糖對(duì)羥自由基有清除作用，隨著濃度增加，清除率也增加，且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。通過(guò)對(duì)其效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行二次曲線方程擬合，根據(jù)對(duì)應(yīng)擬合方程計(jì)算SC50值；從表1結(jié)果可見(jiàn)：內(nèi)蒙古、安徽和河南三地馬齒莧多糖對(duì)羥自由基清除能力為內(nèi)蒙古＞河南＞安徽，其中安徽對(duì)應(yīng)SC50值分別約是內(nèi)蒙古與河南的1.42倍和1.26倍，河南是內(nèi)蒙古的1.12倍，表明三地馬齒莧多糖對(duì)羥自由基清除能力有較大差異。

圖1 馬齒莧多糖對(duì)羥自由基的清除率與濃度關(guān)系曲線

3.3 馬齒莧多糖清除DPPH自由基的能力

由圖2可見(jiàn)，馬齒莧多糖對(duì)DPPH自由基有清除作用，隨著濃度增加，清除率也增加，且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。通過(guò)對(duì)其效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行二次曲線方程擬合，根據(jù)對(duì)應(yīng)擬合方程計(jì)算SC50值；從表2結(jié)果可見(jiàn)：內(nèi)蒙古、安徽和河南三地馬齒莧多糖對(duì)DPPH自由基清除能力為內(nèi)蒙古＞河南＞安徽，其中安徽對(duì)應(yīng)SC50值分別約是內(nèi)蒙古與河南的1.05倍和1.02倍，三者的值相差較小，表明三地馬齒莧多糖對(duì)DPPH自由基清除能力比較接近。

圖2 馬齒莧多糖對(duì)DPPH自由基的清除率與濃度關(guān)系曲線

表1 馬齒莧多糖對(duì)羥自由基清除的SC50值

表2 馬齒莧多糖對(duì)DPPH自由基清除的SC50值

3.4 馬齒莧多糖還原鐵離子的能力

依照2.5的實(shí)驗(yàn)方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4、圖5和圖6。

從圖4可見(jiàn)，F(xiàn)e2+在593 nm處吸光值與其在62.5～4000 μmol/L濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，線性方程為y=0.0003x+0.0094（R2=0.9972）。

圖3 硫酸亞鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 內(nèi)蒙古馬齒莧多糖還原力的FRAP值與濃度的關(guān)系線性圖

圖5 安徽馬齒莧多糖還原力的FRAP值與濃度的關(guān)系線性圖

由圖5、6、7結(jié)果綜合可見(jiàn)，不同地域馬齒莧多糖都有把Fe3+還原成Fe2+能力，還原力與對(duì)應(yīng)的濃度成線性關(guān)系。通過(guò)對(duì)其效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行線方程擬合，根據(jù)對(duì)應(yīng)擬合方程計(jì)算FRAP1000值；從表3數(shù)據(jù)顯示，不同地域馬齒莧多糖對(duì)Fe3+的還原能力為河南＞內(nèi)蒙古＞安徽，其中安徽對(duì)應(yīng)FRAP1000值分別約是內(nèi)蒙古與河南的1.05倍和1.07 倍，三者的值相差較小，表明三地馬齒莧多糖對(duì)Fe3+還原能力比較接近。

4 討論

馬齒莧是一年生肉質(zhì)草本，性喜高濕、向陽(yáng)、耐旱、耐澇，我國(guó)南北各地均常見(jiàn)。馬齒莧分布廣泛主要與其對(duì)土壤因子如有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮、全鉀、銨態(tài)氮、速效鉀的適應(yīng)范圍較寬有關(guān)，土壤因子如全磷和全氮還對(duì)馬齒莧葉、莖的鮮重，植株?duì)I養(yǎng)物總糖、蛋白質(zhì)水平影響顯著；植株的總糖、黃酮含量與采摘月份有關(guān)，需提取總糖建議最佳采收期為8月中旬[15]。曲曉蘭[16]分析采自泰山不同月份野生馬齒莧多糖含量為9月上旬最高，陳凌[17]分析嘉興馬齒莧結(jié)果為8月＞7月＞9月，這暗示馬齒莧多糖水平有地域上差異。本研究結(jié)果可見(jiàn)同為7月中旬采收來(lái)自內(nèi)蒙古（赤峰）、安徽（安慶）和河南（洛陽(yáng)）馬齒莧多糖含量分別為14.69%、31.54%和38.17%。以上差異我們推測(cè)可能是安徽與河南地域比較靠近，內(nèi)蒙古與上述2地相距較遠(yuǎn)，馬齒莧生長(zhǎng)的土壤因子，氣候條件，光照強(qiáng)度等差別大導(dǎo)致。李香和劉躍鈞分別測(cè)定貴州4地（平塘、龍里、獨(dú)山和都勻），浙江麗水6地（縉云縣、蓮都區(qū)、龍泉市、青田縣、松陽(yáng)縣和云和縣）馬齒莧多糖總量水平較接近的結(jié)果有可能是與采集地域比較接近有關(guān)[18-19]。

目前常用抗氧化活性檢測(cè)方法主要基于3個(gè)方面機(jī)理，一是對(duì)反應(yīng)體系中脂質(zhì)氧化物抑制能力，二是對(duì)反應(yīng)體系中自由基清除能力，三是對(duì)反應(yīng)體系中目標(biāo)氧化物的還原能力[20]。為了探究來(lái)自不同地域馬齒莧多糖體外抗氧化能力及與其含量水平是否有關(guān)，我們采用Fenton、DPPH和FRAP三種方法來(lái)評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，羥自由基是一種能激發(fā)油脂過(guò)氧化的較強(qiáng)氧化劑，F(xiàn)enton工作液為水溶性自由基體系；DPPH法有快捷、簡(jiǎn)便和靈敏優(yōu)點(diǎn)，為脂溶性自由基體系；FRAP原理是基于氧化還原反應(yīng)的比色法，有快速、簡(jiǎn)便和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[11-12]，SC50和FRAP1000分別為評(píng)價(jià)清除自由基能力與鐵離子還原能力指標(biāo)。由結(jié)果可知，內(nèi)蒙古馬齒莧多糖對(duì)羥自由基和DPPH自由基清除率能力最強(qiáng)，安徽的最弱；從對(duì)鐵離子還原力來(lái)看，河南馬齒莧多糖能力最高，安徽的最低；綜合來(lái)看三地馬齒莧多糖對(duì)DPPH自由基清除率、鐵離子還原力比較接近；對(duì)羥自由基的清除率有較大差別。從馬齒莧多糖含量與抗氧化活性關(guān)系可見(jiàn)，河南與安徽兩地馬齒莧多糖抗氧化活性與含量出現(xiàn)一致性結(jié)果，而內(nèi)蒙古馬齒莧多糖含量最低，其抗氧化能力最佳，這暗示地域相距遠(yuǎn)馬齒莧的內(nèi)在特性差異更大。由此我們推測(cè)不同地域尤其是相距遠(yuǎn)的地域馬齒莧由于受不同地理環(huán)境，氣候條件等影響，其內(nèi)在的化學(xué)物在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、種類等不同而表現(xiàn)出外在營(yíng)養(yǎng)活性不一樣。

圖6 河南馬齒莧多糖還原力的FRAP值與濃度的關(guān)系線性圖

表3 樣品FRAP1000值與濃度關(guān)系

總之，本研究通過(guò)分析比較三個(gè)地域馬齒莧多糖含量及其體外抗氧化能力，結(jié)果表明不同地域馬齒莧多糖含量及抗氧化活性有差異，地域相距越遠(yuǎn)，馬齒莧以上特性差異性越大，具體的相關(guān)性機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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吉安市科技支撐項(xiàng)目（吉安科計(jì)字[2013]18號(hào)4）。

蔣妍妮（1977—），女，江西吉安人，本科，主管藥師。研究方向：食品、藥品檢驗(yàn)檢測(cè)。