蒙藥藍(lán)刺頭對骨折愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究△

巴音額古樂 金鴻賓

(1.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065；2.天津醫(yī)院，天津 300211)

蒙藥藍(lán)刺頭對骨折愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究△

巴音額古樂1金鴻賓2

(1.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065；2.天津醫(yī)院，天津 300211)

目的：觀察蒙藥藍(lán)刺頭對骨折愈合的影響作用。方法選用健康成年日本大耳白兔75只，制作雙側(cè)橈骨中段骨折模型。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為模型組，陽性對照骨碎補(bǔ)組(0.3g·kg-1)，蒙藥藍(lán)刺頭高、中、低劑量組(3g·kg-1、1.5 g·kg-1、0.3g·kg-1)，藥物摻入飼料，于造模后d1連續(xù)給藥8wk。分別于骨折后第 2、4、8wk時處死，并處死前取股動脈血，觀察蒙藥藍(lán)刺頭對骨折區(qū)域骨組織形態(tài)和血清相關(guān)骨代謝指標(biāo)的影響。結(jié)果血清I型前膠原N末端前肽(PINP)、I型膠原C末端肽(CTX-1)檢測顯示，相同時間點(diǎn)內(nèi)除PINP各組中的蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組和骨碎補(bǔ)組無差異外，其余各組均有顯著差異(P<0.001)；不同時間點(diǎn)的PIPN和CTX-1在各組間均存在顯著性差異(P<0.001)。X線片半定量評定，各組間比較顯示，蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組在第2、4、8wk時與模型組、蒙藥藍(lán)刺頭低劑量組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)；骨碎補(bǔ)組和蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組在第2、4wk時與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。進(jìn)行骨折愈合組織學(xué)評價，各組間比較顯示，各期蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組與模型組、蒙藥藍(lán)刺頭低劑量組比較均有顯著性差異(P<0.01)；蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、骨碎補(bǔ)組在第2、4、8wk時與模型組比較也具有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論蒙藥藍(lán)刺頭通過增高血清PINP濃度和降低CTX-1濃度，提高成骨細(xì)胞活性和成骨能力，促進(jìn)骨折局部膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨速度，促進(jìn)骨痂早期改建和塑形，加快骨折愈合，其作用存在量-效依賴性、給藥持續(xù)時間-效應(yīng)關(guān)系。

蒙藥藍(lán)刺頭；骨折愈合；I型前膠原N末端前肽；I型膠原C末端肽；成骨細(xì)胞

蒙藥藍(lán)刺頭為常用接骨蒙藥，具有接骨愈傷、清熱止痛作用[1]；其味苦，性涼、稀、輕、柔、鈍。系菊科植物藍(lán)刺頭(Echinops lotifolis Tausch)的干燥頭狀花序，多年本草[2]。始載于《智慧之劍》中, 屬于蒙醫(yī)自采自用藥之一，近代蒙醫(yī)藥學(xué)文獻(xiàn)《認(rèn)藥白晶鑒》中均以阿扎格-刺日敖恩作為烏日格蘇圖-呼和(藍(lán)刺頭)收載[3]。蒙醫(yī)在治療前臂骨折、骨不愈合、骨折較輕而筋傷較寬等情況時，慣用內(nèi)服藍(lán)刺頭水煎劑，均有很好的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)[4]，藍(lán)刺頭全草含黃酮類成分，花序中含量最高。劉巖等[5]研究了藍(lán)刺頭對去卵巢模型鼠骨鈣素(BGP)的影響，結(jié)果認(rèn)為，蒙藥藍(lán)刺頭可能通過類雌激素樣作用抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成，調(diào)節(jié)骨吸收與骨形成。為了深入探討該藥促進(jìn)骨折愈合的作用及機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬制作兔橈骨骨折模型，觀察蒙藥藍(lán)刺頭花序?qū)钦蹍^(qū)域組織形態(tài)和血清骨代謝指標(biāo)的影響，以其為蒙藥藍(lán)刺頭更廣泛的應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：健康日本大耳白兔共75只，體重 2.0kg～2.5 kg，12wk齡，其中雌性38只，雄性37只，由天津市中西醫(yī)結(jié)合骨科研究所動物實(shí)驗(yàn)室提供。動物模型建立、飼養(yǎng)和取材均在天津市中西醫(yī)結(jié)合骨科研究所動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

1.2 藥品和試劑：藍(lán)刺頭(花序)，河北保定安國藥材市場購買；骨碎補(bǔ)，天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房購買；鹽酸賽拉嗪注射液(速眠新Ⅱ號)，吉林省敦化市圣達(dá)動物藥品有限公司，批號070031582；兔I型膠原C末端肽(CTX)ELISA檢測試劑盒，上海西唐生物科技有限公司，批號1410151；兔I型前膠原N末端前肽(PINP)ELISA檢測試劑盒，上海西唐生物科技有限公司，批號1410153；蘇木素、伊紅，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心。

1.3 儀器：南韓牙科臺式鉆N3/E102N3，佛山市多易美醫(yī)療器材有限公司；高速萬能粉碎機(jī)YJ-1000A，濟(jì)南億健醫(yī)療設(shè)備有限公司；切片機(jī)RM2255 ，德國 LEICA 公司；自動雙重純水蒸餾器SZ-93，上海徐新生化儀器廠；制冰機(jī)AF200-PSC50R，日本 SANYO 公司；多功能顯微鏡CX41，日本 Olympus 公司； X 線機(jī)(CR)，意大利IAE 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蒙藥藍(lán)刺頭制備：蒙藥藍(lán)刺頭原材料由內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院國家蒙藥制劑中提供，原材料為藍(lán)刺頭花序，共10kg。將其原材料在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙藥炮制中心用小型萬能粉碎機(jī)打磨成粉末狀(過80目篩為標(biāo)準(zhǔn))，并封裝成袋，作為實(shí)驗(yàn)藥品備用。

2.2 骨折模型建立：模型建立參照文獻(xiàn)[6]，將動物分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)2wk，手術(shù)當(dāng)日將每只兔稱重后可用速眠新Ⅱ號(鹽酸塞拉嗪注射液)肌肉注射麻醉(肌注部位：臀肌處，肌注劑量：0.15mL·kg-1體重)，待麻醉后雙上肢常規(guī)脫毛，實(shí)施無菌手術(shù)，于雙側(cè)橈骨中1/3處縱行切開皮膚及皮下組織，暴露雙側(cè)橈骨中1/3部位，用口腔專用磨鉆造成3mm完全橫斷骨折，不作任何固定，生理鹽水沖洗切口，逐層縫合切口。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，常規(guī)飼料及飲水。術(shù)后連續(xù)3d肌肉注射硫酸慶大霉素預(yù)防感染， 4萬U/次， 1次/d，每日觀察動物活動及創(chuàng)口愈合情況。

2.3 動物分組和給藥：將75 只日本大耳白兔，隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：模型組，蒙藥高、中、低劑量組和陽性對照骨碎補(bǔ)組，每組 15只。每組再隨機(jī)分成3個小組，分別為2 wk組、4 wk組、8 wk組，每組 5只，編號，分籠飼養(yǎng)。各組兔術(shù)后均常規(guī)飼養(yǎng)，給藥劑量按《人兔體表面積折算的等效劑量比值表》計算，術(shù)后d1開始給予飼料混合喂養(yǎng)不同劑量的蒙藥藍(lán)刺頭粉劑(高、中、低劑量組，依次為3g·kg-1、1.5g·kg-1、0.3g·kg-1，其低劑量組為臨床等效劑量，高、中、低劑量比例為10:5:1), 1次/d，骨碎補(bǔ)組以臨床等效劑量0.3g·kg-1灌胃, 1次/d，模型組灌胃等量蒸餾水日1次。

2.4 標(biāo)本留?。悍謩e于術(shù)后 2、4、8 wk時采用耳緣空氣栓塞法處死動物，在無菌條件下取出雙側(cè)尺橈骨，觀察骨折區(qū)域愈合情況拍攝 X 線片，沿骨折斷端為中心，缺損區(qū)邊緣7.5 mm處截骨(長約15～16mm)，投入中性甲醛溶液固定，HE染色。處死前分別留取股動脈血，進(jìn)行高速低溫離心后吸取上清放入1.5mL離心管內(nèi)，編號，-70℃保存，待血全部留取完畢后進(jìn)行檢測。

2.5 觀察指標(biāo)

2.5.1 血清骨代謝指標(biāo)測定：取出-70℃血清樣本，待血清樣本完全溶解后放入低溫離心機(jī)以3000r/nin離心10min，抽取上層血清樣本，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定血清中PINP、CTX-1水平。

2.5.2 X線檢查：完整取下雙側(cè)尺橈骨，在放射科統(tǒng)一條件下(45kV、80mA、0.08s)拍攝 CR片，觀察各個時間段(2wk、4wk、8wk)橈骨骨折斷端愈合情況。根據(jù)骨痂形成情況及骨折線變化情況，參照Beck LS and Deguzman L評分系統(tǒng)[7]進(jìn)行骨折愈合狀況半定量評定，如有異議，通過影像學(xué)專家會診最終達(dá)成一致意見為準(zhǔn)。

2.5.3 組織形態(tài)學(xué)觀察:標(biāo)本進(jìn)行固定、切片、HE染色后，在光鏡(×40、×100)下觀察不同時間段(2wk、4wk、8wk)橈骨缺損修復(fù)的組織學(xué)改變。參照文獻(xiàn)[8]骨折愈合組織學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)，加以修改，并增加骨髓腔情況進(jìn)行骨折愈合組織學(xué)評分，分為0～4分。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組的血清PINP、CTX-1檢測，X線評分及組織學(xué)評分結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間比較采用F檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 血清PINP、CTX-1水平測定：本次試驗(yàn)中無兔死亡，均進(jìn)行采樣和數(shù)據(jù)統(tǒng)計。術(shù)后第2wk至8wk時蒙藥藍(lán)刺頭高、中、低劑量組和骨碎補(bǔ)組PINP均有上升趨勢，而CTX-1均有下降趨勢，唯有模型組的PINP第4wk后濃度逐漸下降趨勢。不同時間點(diǎn)的PIPN 、CTX-1在各自組間均存在顯著差異，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。相同時間點(diǎn)內(nèi)除PINP、CTX-1各組中骨碎補(bǔ)組和中劑量組無差異外，其余各組均有顯著差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。 PIPN、CTX-1在不同時間變化趨勢不同，其中：高劑量組，中劑量組和骨碎補(bǔ)組較為穩(wěn)定，而蒙藥低劑量組，模型組PIPN、CTX-1隨時間變化幅度較大，觀察所有蒙藥劑量(低、中、高劑量)與PINP、CTX-1的濃度變化發(fā)現(xiàn)，PINP濃度與用藥劑量呈正比關(guān)系，CTX-1濃度與用藥劑量呈反比關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 血清PINP、CTX-I水平比較

注：與模型組比較，*P<0.001 ，與第2wk比較，#P<0.001，與第2、4wk比較，△P<0.001.

3.2 X線檢查：骨折后2 wk時模型組和蒙藥低劑量組骨痂顯影不明顯，骨折線較清晰，而蒙藥高、中劑量組和骨碎補(bǔ)組可見少量骨痂顯影，主要位于折線遠(yuǎn)近端骨外膜下，骨折線略變模糊；第 4 wk時模型組和蒙藥低劑量組見骨痂少量顯影，骨折斷端開始變模糊，而蒙藥高、中劑量組和骨碎補(bǔ)組大部分標(biāo)本均已完全形成骨性骨痂，有連續(xù)性骨痂通過骨折線，骨折線明顯模糊，且蒙藥高劑量組和骨碎補(bǔ)組顯著；第8 wk時各組均達(dá)臨床愈合標(biāo)準(zhǔn)，骨折線消失或顯著模糊。而蒙藥高劑量組骨折愈合塑形良好，髓腔已貫通，蒙藥中劑量組和骨碎補(bǔ)組欠佳。通過參照X線片Beck LS and Deguzman L評分系統(tǒng)進(jìn)行骨折愈合狀況半定量評定，各組間比較顯示：2wk時蒙藥高劑量組與模型組和蒙藥低劑量組比較有顯著性差異(P<0.01)；蒙藥低劑量組與模型組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；骨碎補(bǔ)組與模型組、蒙藥低劑量組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4wk時蒙藥高劑量組與模型組和蒙藥中、低劑量組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；骨碎補(bǔ)組與模型組和蒙藥中、低劑量組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。8wk時蒙藥高劑量組與模型組和蒙藥低劑量組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；骨碎補(bǔ)組與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表2、圖1。

表2 各組各期X線片Beck LS and Deguzman L評分系統(tǒng)半定量比較

注：與模型組比較，*P<0.05，△P<0.01；與低劑量組比較，#P<0.05，☆P<0.01；與中劑量比較，P<0.05.

3.3 組織學(xué)觀察：蒙藥藍(lán)刺頭高、中劑量組和骨碎補(bǔ)組骨折愈合情況明顯好于模型組和蒙藥藍(lán)刺頭低劑量組，而蒙藥高劑量組骨折愈合情況最為顯著。參照文獻(xiàn)進(jìn)行骨折愈合組織學(xué)評價，各組間比較顯示，各期蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組與模型組和蒙藥藍(lán)刺頭低劑量組比較均有顯著性差異(P<0.01)；蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組和骨碎補(bǔ)組在第2、4、8wk時與模型組比較也具有顯著性差異(P<0.01)，結(jié)果見表3 、圖2。

表3 各組各期骨折愈合組織學(xué)評分

注：與模型組比較*P<0.01，與低劑量組比較#P<0.01；△P<0.05；與中劑量比較，☆P<0.05；與骨碎補(bǔ)組比較，P<0.05.

4 討論

骨折愈合是極其復(fù)雜修復(fù)的過程，是骨組織再生和重建的過程，從組織形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)的變化，將骨折愈合過程大體可分為3個階段[9]，即血腫機(jī)化期(早期)、骨痂形成期(中期)、骨板形成-塑型期(后期)。但三者之間不可截然分開的，而是相互交織逐漸演進(jìn)的過程。

本實(shí)驗(yàn)中觀察到，在骨折愈合早期(2wk時)蒙藥藍(lán)刺頭高、中劑量組和骨碎補(bǔ)組骨折斷端已被纖維組織包裹，骨折線兩端的內(nèi)、外骨膜下均可見明顯的骨小梁形成，并呈逐漸向骨折斷端中心延伸的趨勢，外圍可見大量軟骨細(xì)胞形成，呈軟骨島狀改變。骨折愈合中期(4 wk時)各組軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨較活躍，骨小梁大量形成，并穿插排列進(jìn)一步增多增粗，連接于骨折斷端，其間可見大量的纖維骨痂、軟骨細(xì)胞、炎性細(xì)胞及毛細(xì)血管明顯減少；模型組、蒙藥低劑量組大部分標(biāo)本骨折斷端間仍為纖維性組織連接，骨折wk圍骨小梁纖細(xì)、稀疏，骨痂體積較小，而蒙藥藍(lán)刺頭高、中劑量組和骨碎補(bǔ)組大部分標(biāo)本骨折斷端為骨小梁相連接，骨折wk圍骨小梁密度相對較高，骨痂體積較大。骨折愈合后期(8wk時)，蒙藥藍(lán)刺頭高、中劑量組和骨碎補(bǔ)組骨折斷端間骨小梁轉(zhuǎn)變?yōu)榘鍖庸?，外圍骨小梁出現(xiàn)較多吸收腔隙，髓腔再通，而蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組大部分標(biāo)本髓腔再通，模型組、蒙藥低劑量組骨折斷端間仍可見大量骨小梁有序排列，逐漸向板層狀骨過渡，標(biāo)本髓腔未全再通。提示蒙藥藍(lán)刺頭能夠促進(jìn)骨折局部膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨速度，促進(jìn)骨痂早期改建和塑形，具有促進(jìn)骨折愈合作用。

Ⅰ型前膠原氨基端前肽(PINP)和Ⅰ型前膠原羧基端前肽(PICP)是成骨細(xì)胞合成并釋放出前膠原纖維的細(xì)胞外分解產(chǎn)物，二者在血清中的含量反映了成骨細(xì)胞合成骨膠原的能力，可以被認(rèn)為是監(jiān)測成骨細(xì)胞活性和成骨能力的特異性生化指標(biāo)。PINP的解離和Ⅰ型膠原的合成比例為 1:1，故 PINP 可反映成骨細(xì)胞的活性和骨形成速率，升高提示Ⅰ型膠原的合成速率加快，骨轉(zhuǎn)換活躍[10]。血液中的 PINP、PICP 等由腎臟和肝臟分解去除，Ⅰ型膠原不溶于水，可通過檢測Ⅰ型膠原代謝產(chǎn)物來檢測Ⅰ型膠原的代謝狀況。目前PINP的檢測廣泛的應(yīng)用到藥物干預(yù)治療骨折及骨代謝疾病的療效的評估和惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移疾病的檢測中，尤其在藥物干預(yù)治療過程中動態(tài)觀察與監(jiān)測具有較高的臨床價值。Ⅰ型膠原 C 端肽(CTX-1)也是Ⅰ型膠原諸多降價產(chǎn)物中的一種，于 1994 年Bonde等[11]建立 CTX-1 的檢測法，在骨基質(zhì)的不斷重建中，Ⅰ型膠原被不斷的分解為 CTX-1，并被釋放入血，通過測定血中 CTX 的含量就能夠反映出骨基質(zhì)的吸收狀態(tài)，既能夠?qū)δ承┐x性骨病進(jìn)行早期診斷，又能夠?qū)构俏账幬镞M(jìn)行藥效評價。CTX-1作為骨吸收的特異性指標(biāo)，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用到小兒佝僂病、骨質(zhì)疏松癥、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移、骨折愈合的檢測中。本次實(shí)驗(yàn)通過測定促進(jìn)骨形成和骨吸收指標(biāo)PINP、CTX-1結(jié)果表明，蒙藥藍(lán)刺頭能夠增高血清PINP含量、降低CTX-1含量，其作用存在量-效依賴性、給藥持續(xù)時間-效應(yīng)關(guān)系，提示其可能提高成骨細(xì)胞活性和成骨能力，并促進(jìn)骨生長的同時也抑制骨吸收發(fā)揮重要作用。

綜上所述，蒙藥藍(lán)刺頭可能通過提高血清PINP濃度和降低CTX-1濃度，提高成骨細(xì)胞活性和成骨能力，促進(jìn)骨折局部膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨速度，促進(jìn)骨痂早期改建和塑形而加快骨折愈合。但蒙藥藍(lán)刺頭促進(jìn)骨折愈合相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)還需要進(jìn)一步深入研究。

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內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金( 2015MS08131)

R291.2

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1006-6810(2017)05-0064-04

2017年1月9日收稿