民族藥水楊柳根提取物對(duì)肝硬化和CHF大鼠的利尿作用研究△

肖 明 趙小超 陳柏承* 銀江林 周 靜

(1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，廣西 南寧 530022；2．廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；3．廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530023)

民族藥水楊柳根提取物對(duì)肝硬化和CHF大鼠的利尿作用研究△

肖 明1趙小超2陳柏承2*銀江林2周 靜3

(1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，廣西 南寧 530022；2．廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；3．廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530023)

目的：探討水楊柳根D101樹脂提取物對(duì)肝硬化大鼠和充血性心衰(CHF)大鼠的利尿作用。方法水楊柳根水提液經(jīng)D101大孔樹脂吸附，50%乙醇洗脫，得水楊柳根D101樹脂提取物(HRE)。給藥和分組：隨機(jī)分組，每組10只，正常對(duì)照組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、HRE高中低劑量組(2.7g·kg-1，1.8g·kg-1，0.9g·kg-1)。雄性SD大鼠，前7d飲用含苯巴比妥的飲用水，第8d 背部i.h 40% CCl4橄欖油溶液，劑量4 mL·kg-1，以后每4d i.h1次，劑量減半；第59d始改為每4d i.h1次,直到第107d，制得肝硬化模型大鼠；用藥4周后，測(cè)定6h尿量及血清ALT、AST水平。雄性SD大鼠，i.p 3%戊巴比妥鈉麻醉，劍突正下方腹部切口，打開腹腔，游離腹主動(dòng)脈，用9#注射針頭平行置于主動(dòng)脈上，用4#手術(shù)線捆扎，然后抽走注射針頭，使主動(dòng)脈直徑減少50%，關(guān)腹，抗感染，養(yǎng)至術(shù)后8w，制得CHF模型大鼠；用藥4周后，測(cè)定6h尿量，以及尿中K+、Na+濃度。結(jié)果：肝硬化腹水大鼠中，與無藥物干預(yù)的對(duì)照組比較，陽性藥組和HRE高中劑量組能明顯降低肝硬化大鼠的體重(P<0.001)，增加其6h排尿量(P<0.01或P<0.001)；HRE高中劑量組能明顯降低肝硬化大鼠的ALT水平和AST水平(P<0.05或P<0.01)。CHF大鼠中，假性手術(shù)組和HRE高中劑量組的6h排尿量、尿中Na+和Cl-濃度都有顯著增加(P<0.05，P<0.01或P<0.001)，但排出K+減弱(P<0.05或P<0.001)。結(jié)論水楊柳根的D101樹脂提取物，其主要成分為水溶性黃酮、多糖和皂苷，對(duì)肝硬化腹水大鼠和充血性心衰大鼠有顯著的利尿作用。

水楊柳；黃酮；多糖；皂苷；利尿作用

水楊柳是我國西南地區(qū)少數(shù)民族聚集的廣西、云南、貴州的民間習(xí)用藥材，多以根入藥。水楊柳根在壯、傣、苗等民族藥中，具有清熱解毒、利尿的功效，用于肝炎、關(guān)節(jié)腫痛、腹痛、燙傷的治療[1,2]。目前對(duì)楊柳根的化學(xué)成分和藥理作用研究不多?；瘜W(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，水楊柳根含有水柳皂苷、油酮酸、羽扇豆醇等物質(zhì)，其中油酮酸對(duì)AGZY 83α細(xì)胞有一定的抑制作用[3]。為揭示水楊柳根利尿的物質(zhì)基礎(chǔ)，作者用D101大孔樹脂制備水楊柳根提取物，并采用動(dòng)物模型研究其利尿作用，結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物及試劑：速尿片(呋塞米片)，天津力生制藥股份有限公司產(chǎn)品。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒均為四川邁克生物科技股份有限公司產(chǎn)品。AR級(jí)四氯化碳(CCl4)，廣東汕頭市西隴化工廠產(chǎn)品。

1.2 水楊柳根：2015年5月采集于廣西南寧市高峰林場(chǎng)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為homonoia riparia lour的干燥根。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，體重145～170 g，雄性，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2009-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于動(dòng)物房，全天保持溫度24±2℃，相對(duì)濕度60±5%。分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。動(dòng)物投入實(shí)驗(yàn)前，經(jīng)過3d的適應(yīng)性飼養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)以±s 表示，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為顯著差異，P<0.01為非常顯著差異。

2.2 HRE的制備：水楊柳根，曬干，打成粗粉。用水煮沸提取2次(15倍量×2h，10倍量×1h)，合并水提液，涼至室溫，單層普通濾紙濾過，取濾液上D101大孔樹脂柱，料液上完后用水洗柱，繼用50%乙醇水溶液洗脫，將洗脫液濃縮成稠膏，90℃烘干，得水楊柳根D101樹脂提取物(簡(jiǎn)稱HRE)，得率2.86%，每g提取物相當(dāng)于34.96g水楊柳根藥材。實(shí)驗(yàn)時(shí)在研缽中定量加入蒸餾水研磨，配制成所需藥物濃度?；瘜W(xué)顯色試驗(yàn)結(jié)果表明，HRE含有黃酮、多糖和皂苷類化合物。

2.3 劑量：據(jù)文獻(xiàn)[2]，中醫(yī)用水楊柳根，內(nèi)服9～15g/d。因此取15g為高劑量，高劑量的1/3(5g)為低劑量，高低劑量的中值(10g)為中劑量；換算為大鼠的HRE高中低劑量分別為：2.7 g·kg-1，1.8 g·kg-1，0.9 g·kg-1。

2.4 收集大鼠尿量方法：據(jù)文獻(xiàn)[4]，將大鼠分只飼養(yǎng)于代謝籠，禁食不禁水24h后，每鼠輕壓下腹部使排盡尿液，i.g生理鹽水，容積為30mL·kg-1，收集其一定時(shí)間段內(nèi)的所有尿量；時(shí)間結(jié)束時(shí)用手輕壓大鼠的下腹部使排盡尿液，一并收集，量取總體積。

2.5 對(duì)肝硬化大鼠的保肝利尿作用：按文獻(xiàn)[5]方法：雄性SD大鼠96只,前7d為誘導(dǎo)期，飲用含35mg·L-1苯巴比妥的飲用水，第8d 背部i.h 40% CCl4橄欖油溶液，劑量4 mL·kg-1,以后每4d i.h1次，劑量減半；第59d始改為每4d i.h1次。i.h過程中，如鼠體重較上一次體重減少25%以上，則少i.h1次。第108d，將有明顯腹水的大鼠50只，隨機(jī)分為5組：對(duì)照組(等體積0.5% CMC-Na)、陽性藥對(duì)照組(速尿，0.25 g·kg-1)、HRE高中低劑量組(2.7g·kg-1，1.8g·kg-1，0.9g·kg-1)。每鼠分養(yǎng)于代謝籠。第一次用藥前，用手輕壓每只大鼠的下腹部使排盡尿液，測(cè)定體重，記作W1。連續(xù)i.g用藥14d。末次給藥后24h，收集每鼠的6h尿量，同時(shí)再次測(cè)定體重，記作W2，計(jì)算用藥前后的體重減少率%=(W1-W2)/W1×100%，同時(shí)從眼眶取血，3000RPM離心10min，取血清測(cè)定ALT、AST水平，結(jié)果見表1。

對(duì)照組是肝硬化造模成功后，沒有藥物干預(yù)的、用于對(duì)照的試驗(yàn)組。表1顯示，與對(duì)照組比較，陽性藥組和HRE高中劑量組能顯著減少肝硬化大鼠的體重(P<0.01或P<0.001)，增加6h尿量(P<0.01或P<0.001)。HRE高中劑量組能明顯降低肝硬化大鼠的血清ALT和AST水平(P<0.05或P<0.01)，但陽性藥(速尿)組不能(P>0.05)。對(duì)照組和HRE小劑量組的體重呈無規(guī)律變化，有些鼠只的腹水不減反增，造成體重的增加；而有些則因消瘦而體重減少。試驗(yàn)過程中，因長(zhǎng)期處于肝硬化腹水狀態(tài)，鼠只有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

表1 HRE對(duì)肝硬化大鼠體重、尿量及ALT、AST水平的影響

注：經(jīng)方差分析，與對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

2.6 對(duì)CIF大鼠的利尿作用：參考文獻(xiàn)方法[6]。雄性SD大鼠96只，收集2h尿量，選取尿量超過給水量40%的大鼠為尿量合格動(dòng)物。取65只尿量合格動(dòng)物，i.p 3%戊巴比妥鈉麻醉,于劍突正下方的腹部切口，打開腹腔，鈍性游離腹主動(dòng)脈，用9#注射針頭平行壓置于主動(dòng)脈上，用4#手術(shù)線捆扎，然后抽走注射針頭，使主動(dòng)脈直徑減少約50%。關(guān)腹，縫合，用青霉素抗感染1w(10萬u·d-1/只)，養(yǎng)至術(shù)后8w，測(cè)定并選取左心室舒張末壓超過15mmHg者，為造模成功動(dòng)物。取造模成功動(dòng)物40只，隨機(jī)分為模型對(duì)照組(等體積生理鹽水)，HRE高中低劑量組(2.7g·kg-1，1.8g·kg-1，0.9g·kg-1)，每組10只。另取10只尿量合格動(dòng)物組成假性手術(shù)組(等體積生理鹽水)，該組只開腹游離腹主動(dòng)脈，也做動(dòng)脈捆扎處理，但不縮窄。各組動(dòng)物連續(xù)i.g給藥28d，給藥容量為20 mL·kg-1。末次給藥后24h，收集6h尿量，同時(shí)測(cè)定尿中K+、Na+、Cl-的濃度。結(jié)果見表2。

模型對(duì)照組是CHF造模成功，但無藥物干預(yù)、用于對(duì)照的試驗(yàn)組。表2顯示，與模型對(duì)照組比較，假性手術(shù)組和HRE高中劑量組在6h尿量、排出Na+離子和Cl-離子方面都有顯著增加(P<0.05，P<0.01或P<0.001)，但排出K+離子減弱(P<0.05或P<0.001)。提示HRE可保鉀排鈉，促進(jìn)動(dòng)物水潴留狀態(tài)的緩解。

表2 HRE對(duì)CHF大鼠尿量及離子濃度影響

注：經(jīng)方差分析，與對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

3 討論

肝硬化系肝細(xì)胞長(zhǎng)期處于炎癥狀態(tài)并壞死，從而使肝臟中形成結(jié)締組織，使肝臟質(zhì)地變硬。肝硬化會(huì)伴隨著肝功能失常，以及蛋白質(zhì)、脂肪、電解質(zhì)的代謝紊亂，從而導(dǎo)致水潴留，形成腹水。因腹水中含有大量蛋白質(zhì)和電解質(zhì)，因此肝硬化腹水的治療不能簡(jiǎn)單地將腹水抽走，而是讓機(jī)體對(duì)腹水進(jìn)行吸收，將水以尿液的形式排放，同時(shí)回收其中的營養(yǎng)物質(zhì)[7]。本文的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，水楊柳根提取物能保護(hù)肝細(xì)胞，減少肝細(xì)胞壞死，降低ALT和AST水平；另外還能促進(jìn)肝腹水的吸收，形成大量尿液排出。

CHF模型大鼠因動(dòng)脈被縮窄，心排出量減少，流向腎臟的動(dòng)脈血相應(yīng)減少，引起腎小球?yàn)V過分?jǐn)?shù)增加，進(jìn)而導(dǎo)致Na+、Cl-潴留，K+流失[8]。本文的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，水楊柳根可通過利尿促進(jìn)CHF大鼠的Na+、Cl-排出，同時(shí)降低K+離子的排出量，以達(dá)到保鉀排鈉，緩解水潴留的作用。

水楊柳根在云南和廣西少數(shù)民族中，以水煎煮，取湯口服，具有清熱解毒、利尿的功效，用于肝炎、燙傷等的治療[1,2]。D101樹脂提取物在提取過程中有針對(duì)性地富集水溶性黃酮、皂苷和多糖等成分，揚(yáng)棄無機(jī)鹽、水溶性淀粉、單糖等無活性成分，因此顯示出良好的藥理活性。但具有保肝利尿的化學(xué)成分仍有待進(jìn)一步研究和明確。

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StudyondiureticeffectofD101-resinextractfromtherootofHomonoiariparia

Xiao Ming1, Zhao Xiao-chao2, Chen Bocheng2**, Yin Jianglin2, Zhou Jing3

1.Pharmaceutical factory of University of Guangxi Traditional Chinese Medicine, Guangxi Nanning 530022; 2.University of Guangxi Traditional Chinese Medicine, Guangxi Nanning 530200;
3.Guangxi Medical University, Guangxi Nanning 530023)

Objective: To study the diuretic effect of HRE (short for “D101-resin extract from the root of Homonoia riparia”) on cirrhosis and CHF rats. Methods: i.h CCl4on the rat’s back for 107d to make cirrhosis model. On the other hand, opened the rat’s abdomen and strapped the abdominal aorta with 4# thread to make CHF model. The modeled rats were i.g HRE for 4 weeks, and then their 6-hour urine volume, ALT, AST and the concentration of Na+, Cl-, K+ were determinated. Results: For cirrhosis model rats, the Hi- and Mid-dose of HRE groups (2.7 g·kg-1，1.8 g·kg-1) could significantly decrease the rat’s weight, ALT and AST (P<0.05,P<0.01orP<0.001), contrarily, significantly increased the 6-hour urine volume (P<0.01 orP<0.001). For CHF model rats, the Hi- and Mid-dose of HRE groups (2.7 g·kg-1, 1.8 g·kg-1) could significantly increase the 6-hour urine volume and the concentration of Na+,Cl- (P<0.05,P<0.01orP<0.001); contrarily, significantly decrease the concentration of K+ (P<0.05 orP<0.001). Conclusion: The main components of HRE are flavonoids, polysaccharides and saponins. HRE has significant diuretic effect, and shows obviously dose-effect relationship.

Homonoia riparia(水楊柳); D101; diuretic effect

廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(桂中重開201507)

肖明(1971-)，女，漢族，廣西南寧人，主管藥師，從事中藥制藥及檢驗(yàn)分析工作，E-mail:2590994285@qq.com

*通訊作者：陳柏承(1989-)，男，漢族，廣西北流人，助理工程師，從事中藥藥效篩選工作，E-mail:1002693645@qq.com

RR29

B

1006-6810(2017)06-0056-03

2017年3月29日收稿