制備可促進干細胞增殖的三維取向電紡纖維膜

王丹丹，鐘惠湘，軒留洋，馬雙雙，李燕，蔣樂倫，蔣慶

(1.中山大學工學院生物醫(yī)學工程系，廣東 廣州 510006；2.廣東省傳感和醫(yī)療器械重點實驗室，廣東 廣州 510006；3.廣東省便攜式普及型先進實用醫(yī)療器械工程技術研究中心，廣東 廣州 510006)

制備可促進干細胞增殖的三維取向電紡纖維膜

王丹丹1,2,3，鐘惠湘1,2,3，軒留洋1,2,3，馬雙雙1,2,3，李燕1,2,3，蔣樂倫1,2,3，蔣慶1,2,3

(1.中山大學工學院生物醫(yī)學工程系，廣東 廣州 510006；2.廣東省傳感和醫(yī)療器械重點實驗室，廣東 廣州 510006；3.廣東省便攜式普及型先進實用醫(yī)療器械工程技術研究中心，廣東 廣州 510006)

為模擬體內三維微環(huán)境，比較脂肪干細胞(adipose derived stem cells, ADSCs)在二維與三維取向纖維膜的增殖速率，通過改進靜電紡絲收集裝置，制備三維聚己內酯(poly caprolactone, PCL)取向電紡纖維。纏繞在毛細管(直徑300 μm)的電紡纖維取向性優(yōu)良，纖維直徑300～400 nm。將ADSCs種于經(jīng)表面改性的電紡纖維上，黏附良好。在取向纖維膜上，細胞均沿纖維取向方向鋪展。與2D纖維膜相比，細胞在3D纖維模型支架上增殖速率較快，表明3D纖維支架在組織工程應用中更有優(yōu)勢。

三維取向纖維；靜電紡絲；脂肪干細胞；骨組織工程

細胞外基質(extra cellular matrix, ECM)是細胞在體內生存微環(huán)境的重要組成部分。近年來有關生物支架材料的研究多致力于模擬ECM的結構和性能，從而調控特殊的細胞應答，如細胞黏附、遷移、增殖和分化。靜電紡絲、自組裝和相分離法都可以制備出具有類似于ECM的微納米結構的纖維支架[1-3]。其中，靜電紡絲技術因操作簡單、所得纖維結構易于控制，纖維尺寸范圍分布廣(從納米至微米級別)，被廣泛應用于納米纖維支架領域[4]。靜電紡絲技術所制備的納米纖維支架除具有類似ECM的納米網(wǎng)狀結構外，還具有高孔隙率和高比表面積等優(yōu)點。在生物學性能方面，納米纖維支架還可促進細胞黏附、增殖和分化等[5]。

靜電紡絲技術是在聚合物溶液和接收裝置之間施加一個高電壓，一旦表面電位電荷超過一個臨界值，靜電引力就會克服溶液表面張力，產(chǎn)生直徑在納米到微米尺度的連續(xù)性纖維[6-7]。紡絲過程中，聚合物溶液的濃度、黏度、電場強度、擠出速率、接收裝置等會影響纖維的直徑和形狀。因此可以通過改變靜電紡絲條件，來控制支架的結構和形態(tài)[8]。

最近，一些研究報告指出支架的表面形貌可以影響干細胞命運[9-10]。由合成或天然可降解聚合物制備出的取向納米纖維，其表面形貌類似于原生骨組織中高度取向的膠原纖維束，被廣泛作為骨再生支架[11]。Duque等[12]發(fā)現(xiàn)：干細胞可以沿著高度取向的纖維方向生長。與無規(guī)纖維相比，在取向纖維上表現(xiàn)出增強的成骨分化潛能。高比表面積和高孔隙率的支架材料，對于細胞生長和組織再生起著至關重要的作用。大量研究表明，2D纖維膜可允許細胞粘附和增殖[13-15]。然而，這種傳統(tǒng)纖維支架為平面結構，嚴重阻礙了細胞的生長和遷移。通過改變實驗策略，不少研究者制備出了所需形態(tài)和結構的三維電紡納米纖維支架，并將之應用于組織工程領域。Swaminathan等[16]制備出取向的聚乙丙交酯(poly lactide-co-glycolide, PLGA)納米纖維，將其用于神經(jīng)工程修復；同時，相關研究也證明：相比于無規(guī)纖維，取向纖維降解速率較慢，可促進細胞增殖。Bosworth等[17]的研究發(fā)現(xiàn)3D電紡支架較2D支架材料能夠承載更大的拉伸載荷，表現(xiàn)出良好的機械性能。此外，3D電紡膜可更好地模擬層次緊密的肌腱組織結構，促進肌腱成纖維細胞的黏附和增殖。Xu 等[18]利用熱誘導納米纖維，在冷凍干燥條件下通過自集聚的方式制備出了聚己內酯(poly caprolactone, PCL)三維納米支架，其具有高孔隙率和相互關聯(lián)的孔洞結構。體外實驗結果表明：該支架不僅可提高細胞存活率，還可有效的促進BMP-2誘導的軟骨細胞的成骨分化，在骨組織工程中具有優(yōu)良的應用前景。盡管在3D納米纖維支架領域已經(jīng)累積了一定的研究成果，但關于細胞對納米纖維取向的響應，卻鮮有報道。而細胞取向與細胞增殖、分化等行為密切相關。且，3D培養(yǎng)是否優(yōu)于2D培養(yǎng)，仍有待進一步研究闡明。

在眾多干細胞中，脂肪干細胞(adipose-derived stem cell, ADSCs)具有很強自我更新能力和高度分化潛能，在一定條件下可誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、內皮細胞等[19]，進一步借助于組織工程技術可構建出骨組織[20]、軟骨組織[21]、肌肉組織[22]、內皮等。此外，ADSCs來源豐富，取材較方便，成為國內外學者的研究熱點[23]。因此，在本研究中ADSCs被選為模型細胞。本研究構建了具有大比表面積和高孔隙率的3D納米纖維支架模型，探索其對細胞粘附和增殖等方面的影響。為制備3D取向納米纖維，我們改進了紡絲接收裝置，制備出取向良好的電紡纖維。經(jīng)表征后，選擇具有合適性能的3D電紡纖維膜作為基底材料，研究其對ADSCs黏附和增殖的影響。

1 3D取向納米纖維支架模型的制備

1.1 實驗材料

聚己內酯(PCL，Mn～80000)購自Sigma公司；二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，均為分析純級別，購自廣州化學試劑廠；細胞基礎培養(yǎng)基(DMEM/F12)和鏈霉素-青霉素雙抗溶液，購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(EDTA-Trypsin)、3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，噻唑藍(MTT)，購自GIBCO公司。

1.2 實驗方法

制備取向和無規(guī)納米電紡纖維膜的原理相同，只是在接收裝置上有所區(qū)別。先將PCL溶于體積比為3∶1的DCM/DMF混合溶液中，質量分數(shù)為12%。電紡參數(shù)設置如下進行電紡：正極高壓噴射頭采用21#短針頭(φ=0.22 mm)，電壓+14 kV， 接收距離為10 cm， 推進速度為2 mL/h。收集3D取向(3D-A)納米纖維的裝置如圖1所示，該裝置利用電機帶動毛細管旋轉收集取向納米纖維。毛細管外徑為300 μm，轉速為900 r/min。在每根毛細管接收取向納米纖維30 s后取下，如此重復。用同樣的電紡溶液、紡絲參數(shù)制備對照樣品。2D無規(guī)(2D-R)電紡膜用平面鋁箔收集，2D取向(2D-A)電紡膜在接地金屬片的狹縫處收集[24]。

圖1 三維取向納米纖維的電紡裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the electrospinning setup for 3D aligned nanofibers

2 實驗方法與結果

2.1 3D取向納米纖維支架的形貌觀察

2.1.1 測試方法 3D取向纖維支架模型經(jīng)香豆素染色后，采用日本Olympus公司LX71熒光顯微鏡觀察取向纖維整體形貌；然后，使用日本日立S-4800掃描電鏡(SEM)在20 kV電壓下觀察噴金后的納米纖維的表面形貌。2D無規(guī)和取向電紡纖維膜，亦采用S-4800型掃描電鏡觀察形貌。最后，用圖像處理軟件Image J分析纖維直徑與取向分布。纖維取向由纖維與取向方向間的夾角表征，夾角越小，取向越單一。

2.1.2 測試結果 如圖2，毛細管中段所收集的纖維直徑分布最均勻，纖維取向最單一，幾乎全部與毛細管軸向呈垂直。而上段所收集的納米纖維取向和毛細管軸向夾角不為90°，有少許偏差。毛細管下段的納米纖維厚度比中段薄，纖維取向不均一。這可能是因為毛細管各段與注射針頭間的距離有差別，加上紡絲過程中還受重力作用，導致了毛細管不同段纖維取向不同。綜上所述，本文選擇毛細管中段的納米纖維構建三維支架模型。

圖2 毛細管上、中和下段取向電紡纖維熒光圖Fig.2 Fluorescence microscope images of 3D aligned electrospun fibers on the top, middle and bottom of glass capillaries

纖維表面形貌進一步由SEM表征。如圖3所示，3種纖維均連續(xù)，無結點。樣品2D-R的纖維平均直徑為(776±238)nm，～72.5%的纖維其直徑分布在500～1 000 nm范圍內，且取向隨機。而樣品2D-A的纖維平均直徑及分布與2D-R較接近，平均值為760 nm，～77.2%的纖維直徑分布在500-1 000 nm范圍內。但，2D-A纖維具有高度取向性，～58.7%纖維取向角分布在-5°～5°范圍內。由圖3(c)可知，毛細管上的3D-A納米纖維亦取向性良好。纖維平均直徑為(333±68) nm，61.1%的纖維直徑分布在300～400 nm范圍內，表明該樣品纖維直徑分布較窄?！?1.7%的纖維取向角度分布在-5°～5°范圍內，表明該纖維取向性良好。綜上所述，通過旋轉的毛細管可收集連續(xù)性良好，取向單一的3D取向納米纖維，且納米纖維堆積厚度可通過紡絲時間控制。且與2D電紡膜相比，3D-A纖維較粗，直徑分布較寬。

2.2 細胞在2D纖維膜上黏附與增殖檢測

2.2.1 測試方法 細胞實驗前，先將2D纖維膜滅菌(體積分數(shù)為75%酒精浸泡3 h)，在超凈臺中風干后，室溫下用0.1 mg/mL的PLL溶液包被過夜，后用PBS清洗。為觀察細胞黏附情況，將ADSCs(ATCC)按密度104cells/cm2種于2D纖維膜上，待細胞增殖3 d后，將Calcein-AM存儲液與PBS按1∶1 000比例混合加入細胞培養(yǎng)孔板，在37 ℃避光條件下孵育30 min，后用PBS清洗3遍，在熒光顯微鏡下觀察細胞形貌。

圖3 3種纖維的形貌、直徑和取向分布圖Fig.3 Fiber morphology (SEM image) and diameter, orientation distribution of three different electrospun nanofibers

為追蹤細胞增殖，將ADSCs按密度為5×103cells/cm2種于2D纖維膜上。相比于MTT法，Alamar Blue法稍靈敏，且不影響細胞活性，可用于追蹤同一組細胞的增殖[25]。因此，對于2D纖維膜，先用Alamar Blue法追蹤細胞增殖行為。

2.2.2 測試結果 本文首先研究ADSCs在經(jīng)表面改性的2D電紡纖維膜上的粘附與增殖。如圖4所示，在無規(guī)與取向纖維膜上，細胞均鋪展良好；在樣品2D-R上，細胞隨機分布，取向無規(guī)；而在樣品2D-A上，細胞取向較規(guī)律，沿著纖維方向呈伸展形態(tài)。采用Alamar Blue法追蹤了細胞的增殖行為。如圖5所示，在前5 d，2D-R與2D-A樣品間的吸光值無顯著性差異，但在第7天，2D-R纖維膜上吸光值明顯增加，表明其上細胞顯著增殖；而2D-A上吸光值仍然維持在與前5 d較接近的數(shù)值。上述對比表明，在2D電紡纖維膜上，無規(guī)纖維膜較取向纖維膜更利于ADSCs的增殖。

圖4 ADSCs在2D纖維膜上的熒光顯微照片F(xiàn)ig.4 Fluorescence microscope images of ADSCs on 2D electrospun membranes after Calcein-AM staining

圖5 ADSCs在2D-R和2D-A纖維支架上的增殖行為Fig.5 Monitoring proliferation of ADSCs on 2D-R and 2D-A electrospun membranes

2.3 細胞在3D納米纖維支架模型上的粘附與增殖檢測

2.3.1 測試方法 通過對3D取向納米纖維的形貌觀察，本文選用毛細管中間段的納米纖維來構建用于細胞粘附與增殖研究的支架模型，將3D取向納米纖維和毛細管一起，用硅膠粘在玻片(適于12孔板)上(樣品3D-A)。作為對照組，先將無規(guī)纖維膜固定在毛細管上，后用同樣的方式粘在玻片上(樣品3D-R)。滅菌、PLL表面處理、細胞種植以及Calcein-AM染色參數(shù)同2.2.1。

對于3D支架模型，用MTT法表征細胞增殖行為。檢測步驟如下：先配置質量濃度為5 mg/mL的MTT儲存溶液，溶劑為PBS，加入細胞時，MTT儲存液與培養(yǎng)基按1∶10的比例混合，在37 ℃避光條件下孵育4 h，后將培養(yǎng)基移除，每孔加入200 μL DMSO，置搖床上80 r/min震蕩10 min，使結晶物甲瓚充分溶解，在將溶液移入96孔板中，使用美國BioTek Synergy4酶標儀檢測490 nm處的吸光度。

2.3.1 測試結果 如圖6，細胞在具有曲率的取向纖維上能夠很好的黏附及鋪展，且細胞沿著纖維取向的方向生長。

為了追蹤細胞在3D納米纖維支架模型上的增殖情況，采用MTT法檢測細胞相對活性，結果如圖7所示。圖7中，兩種模型支架的吸光值均隨增殖時間逐漸增加，表明細胞在這兩種模型支架上均有所增殖。3D-R與3D-A支架模型在所表征的時間范圍(6 d內)無顯著差異。但細胞在3D-A支架模型上的活性較高。以上結果表明，對于3D纖維支架模型，纖維呈取向分布時更利于ADSCs黏附及增殖。

圖6 3D-A電紡纖維支架模型上ADSCs熒光顯微照片F(xiàn)ig.6 Fluorescence microscope images of ADSCs on 3D-A electrospun scaffold model

圖7 ADSCs在3D-R纖維支架模型上的增殖行為Fig.7 Monitoring proliferation of ADSCs on 3D electrospun scaffold models

3 分析與討論

除了細胞內部的調控機制，細胞外基質(ECM)對細胞行為的信號調控作用具有重要意義。電紡纖維膜，因具有與ECM相似的結構與形貌，被廣泛用于組織工程研究[26]。本研究構建了3D取向纖維支架模型來模擬體內ECM結構，進而研究其對ADSCs增殖的影響。通過改變接收裝置獲得了3D取向PCL納米纖維支架。與2D電紡膜相比，3D纖維直徑較小，取向更為規(guī)整。

ADSCs在2D纖維膜上可良好粘附，但與在無規(guī)纖維基底上(2D-R)相比，在取向纖維基底上(2D-A)細胞增殖速率較慢。這一發(fā)現(xiàn)與文獻中結果較接近。人源間充質干細胞(hMSC)在具有納米溝槽結構的基底上可沿著溝槽結構取向生長，但增殖速率卻低于在平面無納米拓撲結構的基底[27]。

當將ADSCs種于3D纖維模型支架時，發(fā)現(xiàn)細胞在3D-A支架上仍然沿纖維取向方向生長，而增殖速率與在3D-R支架上接近并在第2、6天略高。即使對于無規(guī)纖維，ADSCs在3D模型上增殖速率比在2D上更快。盡管對于在3D支架與2D纖維膜上細胞增殖的表征所用方法不同，但經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，兩種不同檢測方式所展現(xiàn)出的趨勢是一致的，如圖8所示。3D支架模型，可為細胞提供了一個利于吸收氧及營養(yǎng)成分以及輸出代謝廢物的微環(huán)境。 因此ADSCs在3D模型支架上表現(xiàn)出更快的增殖趨勢。

圖8 Alamar Blue法和MTT法表征ADSCs在孔板(TCP)上增殖行為的對比Fig.8 Comparing Alamar Blue assay and MTT assay on monitoring proliferation of ADSCs on tissue culture plates (TCP)

4 結 論

本研究構建了3D取向納米支架模型，探索了該模型對ADSCs黏附和增殖的影響。實驗證明了細胞可沿著纖維絲取向方向生長。與2D纖維膜相比，3D模型支架包括3D取向支架，均具有更優(yōu)的促細胞增殖能力。而間充質干細胞在取向基底上具有更優(yōu)的成骨分化能力。因此，本研究的發(fā)現(xiàn)為骨組織工程支架的設計提供了新思路，即制備具有取向納米結構如納米纖維的三維支架材料，在修復骨缺損領域更具潛力。

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Fabricationof3Dalignedelectrospunnaofiberstoenhancetheproliferationofstemcells

WANGDandan1, 2，3，ZHONGHuixiang1, 2，3，XUANLiuyang1, 2，3，MAShuangshuang1, 2，3，LIYan1, 2，3，JIANGLelun1, 2，3，JIANGQing1, 2，3

(1. Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006， China；(2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Sensor Technology and Biomedical Instrument, Guangzhou 510006， China；3. Guangdong Province Portable Universal Advanced Medical Equipment Engineering Technology Research Center, Guangzhou 510006， China)

In order to mimic theinvivo3D micro environment and compare proliferation rate of adipose derived stem cells (ADSCs) on 2D and 3D aligned nanofiber sheets, 3D aligned poly(caprolactone) (PCL) fiber scaffolds were prepared by improving the collector for electrospinning. The fibers were around capillaries in diameter of 300 μm, which were aligned very well and with fiber diameter in the range of 300～400 nm. After surface modification, ADSCs were seeded and it was found these cells were spread very well. Regardless 2D or 3D scaffolds, on aligned fibers cells were nearly all aligned along the fiber direction. When compared with that on 2D membranes, cells proliferated faster on 3D fiber scaffolds, showing the higher potential of 3D fiber scaffolds to be applied for tissue engineering applications.

three-dimensional oriented fibers; electrospinning; adipose derived stem cells; bone tissue engineering

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.06.012

2017-03-23

國家自然科學基金(51303216)

王丹丹(1992年生)，女；研究方向靜電紡絲；E-mail：wangdd_bme@163.com

鐘惠湘(1991年生)，女；研究方向：干細胞擴增；E-mail：huixiang34@163.com

(以上2位作者并列第1作者)

李燕(1984年生)，女；研究方向生物材料；E-mail：liyan99@mail.sysu.edu.cn

R318.08

A

0529-6579(2017)06-0076-07