基質(zhì)分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法同時測定干血斑樣品中22種鎮(zhèn)定催眠類藥物

于 峰， 魏 萌， 文 迪， 苗鑫剛， 張路迪， 張曉光

(1.河北醫(yī)科大學法醫(yī)學院，河北省法醫(yī)學重點實驗室，河北省法醫(yī)分子鑒定協(xié)同創(chuàng)新中心，河北石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學護理學院，河北石家莊 050031；3.河北醫(yī)科大學法醫(yī)鑒定中心，河北石家莊 050017；4.河北醫(yī)科大學，醫(yī)學與健康研究院大型科研儀器設備共享服務平臺，河北石家莊 050017)

目前較為廣泛應用的鎮(zhèn)定催眠類藥物主要有苯二氮卓類、吩噻嗪類、巴比妥類等，這些藥物具有改善睡眠、鎮(zhèn)定、抵抗抑郁和焦慮等作用，但容易使患者產(chǎn)生依賴或者成癮，過量服用會造成物理和精神的傷害，甚至呼吸衰竭死亡[1 -2 ]。因此,建立檢測這些藥物的準確快捷的方法十分必要[3]。干血斑法是指將采集的微量血樣本置于采血卡上，經(jīng)干燥后制成干血斑樣品，其具有創(chuàng)傷小，便于儲存和運輸，后處理簡單方便等優(yōu)點。隨著質(zhì)譜技術(shù)在精準醫(yī)學方面研究的開展，干血斑技術(shù)目前已經(jīng)在疾病標志物篩查、藥物動力學研究、臨床藥物監(jiān)測等方面[4 -2 ]得到廣泛的應用。

基質(zhì)分散固相萃取法最初由美國路易斯安納州立大學Staren Barker教授提出，它的原理是將硅膠鍵合有機相的凈化填料放入萃取溶劑中，被檢測物質(zhì)和凈化填料在剪切力作用下分散開來，被檢測物質(zhì)或者基質(zhì)中雜質(zhì)被吸附，使用不同極性溶劑進行解吸，從而達到凈化目的[13 -15 ]。

目前,文獻報道的檢測鎮(zhèn)定安眠藥物的方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法以及高分辨率質(zhì)譜法等[16 -21 ]。靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜是近年來興起的先進的質(zhì)譜分析技術(shù)，具有高通量、精確度高、分辨率高等優(yōu)點，其通過記錄被測物質(zhì)加和離子在電場內(nèi)的運動軌跡和頻率，經(jīng)過傅里葉轉(zhuǎn)換得到精確質(zhì)量數(shù)。使用干血斑結(jié)合靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜法檢測鎮(zhèn)定催眠藥物鮮有報道，與已有研究相比，本研究優(yōu)勢在于被測物種類全面，檢出限低，分析時間短，前處理簡單高效，通過對被分析物的精確質(zhì)量數(shù)進行定性和定量，從而極大降低假陽性出現(xiàn)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

QE-plus型超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾公司)；CT15RE型高速冷凍離心機(日本日立公司)；Vortex3000型渦旋混勻器(德國維根技術(shù)有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1×100 mm，1.7 μm，美國沃特世公司)；Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱(2.1×100 mm，1.9 μm，美國賽默飛世爾科技公司)；Phenomenex Kinetex C18色譜柱(2.1×100 mm，2.6 μm，美國菲諾美公司)；Milli-Q Advantage A10超純水儀(美國默克密理博公司) 。

22種安眠鎮(zhèn)定類藥物標準品(苯二氮卓類：奧沙西泮、地西泮、勞拉西泮、氯硝西泮、替馬西泮、硝西泮、去甲西泮、7氨基氯硝西泮、氟西泮、氯氮平、阿普唑侖、艾司唑侖、咪達唑侖、三唑侖；吩噻嗪類：丙咪嗪、氯丙嗪、異丙嗪、甲哌氯丙嗪；巴比妥類：巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥、異戊巴比妥)濃度均為1 000 μg/mL，溶劑甲醇(壇墨質(zhì)檢-標準物質(zhì)中心)，3種內(nèi)標標準品(地西泮D5、苯巴比妥D5、氯丙嗪D6)濃度均為100 μg/mL，溶劑甲醇(天津阿爾塔科技有限公司)；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、甲酸(99%)、乙酸銨(99%)、甲酸銨(99%)均購于美國默克密理博公司； C18粉末(50 μm，60 ?)、PSA粉末(40～63 μm，60 ?)購于天津博納艾杰爾公司；Whatman 903采血卡(美國思拓凡公司)；實驗用水為自制超純水。

全血樣品(河北醫(yī)科大學法醫(yī)鑒定中心提供)。

1.2 標準溶液配制

分別移取22種安眠鎮(zhèn)定類藥物標準品100 μL，用甲醇定溶于10 mL容量瓶中，配制成10 000 ng/mL的混標使用液1；混標使用液1以甲醇稀釋定容可分別制得1 000 ng/mL的混標使用液2及100 ng/mL的混標使用液3；分別移取3種內(nèi)標標準品1 000 μL，用甲醇定溶于10 mL容量瓶中，配制成10 000 ng/mL的混標內(nèi)標使用液。

1.3 干血斑的制備

移取全血50 μL于Whatman 903采血卡上，溫室條件下放置2 h得干血斑樣品，置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 樣品前處理

沿虛線邊緣處將干血斑裁剪下來，將其放入2 mL離心管中，加入10 μL(100 ng)混合內(nèi)標使用液，40 μL甲醇水溶液(體積比1∶1)浸潤干血斑，再加入950 μL乙腈，渦旋60 s，30 ℃超聲5 min，10 000 g/min，4 ℃下離心5 min；移取全部上清液于另一2 mL離心管中，加入PSA 100 mg，震蕩混勻，渦旋60 s，10 000 g/min，4 ℃下離心5 min；取上清液500 μL于另一2 mL離心管中，50 ℃水浴下氮氣吹干，加入100 μL甲醇水溶液(體積比1∶3)復溶，10 000 g/min，4 ℃下離心1 min，取上清液上機測定。

1.5 基質(zhì)加標標準溶液的制備

移取適量“1.2”混標使用液于9個2 mL離心管中，使離心管含有被測物質(zhì)量依次為2 ng、5 ng、8 ng、20 ng、40 ng、80 ng、200 ng、400 ng、800 ng；氮氣小心吹干離心管，加入50 μL甲醇水溶液(體積比1∶1)復溶，渦旋30 s，再加入950 μL全血，渦旋混勻60 s，得到被測物濃度為2 ng/mL、5 ng/mL、8 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL的基質(zhì)標準溶液。取制成的血液基質(zhì)標準溶液各50 μL于Whatman 903采血卡上，溫室條件下放置2 h即得，放置于-20 ℃冰箱保存。

1.6 基質(zhì)效應評價方法

按照“1.3”制備干血斑，沿虛線邊緣處將干血斑裁剪下來，將其放入2 mL離心管中，加入50 μL甲醇水溶液(體積比1∶1)浸潤干血斑，加入950 μL乙腈，渦旋60 s，30 ℃超聲5 min，10 000 g/min，4 ℃下離心5 min；取上清液500 μL于另一2mL離心管中，50 ℃水浴下氮氣吹干，移取“1.2”制備的適量標準溶液，加入甲醇水溶液(體積比1∶3)補足，使苯二氮卓類、吩噻嗪類添加濃度為10 ng/mL、400 ng/mL、600 ng/mL，巴比妥類添加濃度為40 ng/mL、400 ng/mL、600 ng/mL。同時用甲醇水溶液(體積比1∶3)直接配制成與上述濃度相同的標準溶液，上機測定，每個濃度水平重復測定3次。

1.7 外標法回收率測定方法

移取全血50 μL于Whatman903采血卡上(其中被測物濃度為40 ng/mL，400 ng/mL，600 ng/mL，按照“1.2”、“1.3”制備)不加入內(nèi)標，改變PSA和C18加入量，加入PSA量依次為50 mg、100 mg、150 mg，加入C18量依次為50 mg、100 mg、150 mg，按照“1.4”進行樣品前處理。

1.8 儀器條件

1.8.1 色譜條件色譜柱：Waters Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)以及預柱(5 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相相A 為10 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈溶液；洗脫梯度：0～2 min，25%B；2～9 min，25%B線性升高至90%B；9～10 min，90%B；10～11 min，90%B線性降低至25%B；11～12 min，25%B；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃；進樣體積：2 μL。

1.8.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧電離源(HESI)，離子源電壓：3 800 V，離子源溫度：350 ℃；鞘氣流速：40 arb；輔助氣流速：10 arb；毛細傳輸管溫度：320 ℃；S-lens RF level：60；掃描方式：一級質(zhì)譜全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描(Full MS ddMS2)；掃描模式：正負切換；一級質(zhì)譜全掃描分辨率：70 000；掃描范圍：150～1 000m/z；二級質(zhì)譜掃描分辨率：17 500；能量值(NCE stepped)：20、30、40；AGC target：1e5。

2 結(jié)果和討論

2.1 基質(zhì)分散固相萃取條件的確定

2.1.1 基質(zhì)效應評價按照“1.6”進行基質(zhì)效應評價?；|(zhì)加標標準溶液峰面積記為S，直接配制的相應濃度標準溶液峰面積記為S0，以(S-S0)/S0×100%評價基質(zhì)效應。實驗結(jié)果顯示，實驗中22種目標物質(zhì)的基質(zhì)效應范圍為-20.7%至-8.5%之間，均為抑制效應。

2.1.2 凈化劑的選擇及用量實驗選用C18和PSA作為凈化劑，以回收率作為考察方式，確定凈化劑的用量。內(nèi)標和外標峰面積由于基質(zhì)效應同時增強或者抑制，使用內(nèi)標法計算回收率無法準確反映基質(zhì)效應造成的影響，因此使用添加和不添加凈化劑時的峰面積之比來考察凈化劑的效果。

改變C18粉末和PSA粉末的用量，按照“1.7”進行實驗，在僅添加C18的實驗條件下，發(fā)現(xiàn)被測物回收率和不添加C18時峰面積無顯著差異。在添加PSA粉末的情況下，除了司可巴比妥以外，其他被測物峰面積與不添加PSA粉末時相比均有不同程度的增加，這說明PSA對于血液樣品具有更好的凈化效果。其原因可能是PSA的氨基可與金屬離子產(chǎn)生鰲合作用，從而有效的吸附了血液提取液中的金屬離子以及脂類、有機酸、糖類，降低了基質(zhì)效應。具體峰面積變化和添加量之間的關(guān)系如圖1所示(被測物濃度為40 ng/mL)，但是隨著添加量的增多，硝西泮、地西泮、異丙嗪、司可巴比妥、巴比妥等峰面積出現(xiàn)了明顯下降，這可能是由于PSA對被測物的吸附作用增強導致，在被測物濃度為400 ng/mL以及600 ng/mL的情況下改變PSA用量，也有相似的趨勢。綜合考慮，PSA添加量確定為100 mg。

圖1 添加不同量的PSA凈化劑條件下峰面積變化情況Fig.1 Effect of different dosage PSA on peak area a.benzodiazepines;b.phenothiazines;c.barbiturates.

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇比較了Waters Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)和Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)出峰和分離情況。結(jié)果顯示，3種色譜柱在12 min內(nèi)均可以實現(xiàn)22種被分析物質(zhì)的色譜分離。但是Hypersil GOLD C18色譜柱對于苯二氮卓類的分離效果和其他兩種色譜柱相比出峰時間更加集中，Kinetex C18色譜柱色譜柱對于巴比妥類的分離效果和其他兩種色譜柱相比出峰時間更加集中； Acquity BEH C18色譜柱在分離效果方面表現(xiàn)得更加均衡。在Waters Acquity BEH C18色譜柱上吩噻嗪類和巴比妥類出峰峰形較其余兩種色譜柱更加對稱和尖銳，最終選擇Waters Acquity BEH C18色譜柱作為分析柱。22種被測物的離子流色譜圖見圖2。

圖2 22種被測物離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of 22 analytes

2.2.2 流動相的選擇比較了甲酸銨水溶液-甲醇、甲酸銨水溶液-乙腈、乙酸銨水溶液-甲醇、乙酸銨水溶液-乙腈4種不同的流動體系下，22種被測物的出峰和分離情況。結(jié)果顯示，使用乙腈作為有機相時，被測物出峰時間要早于使用甲醇作為有機相的出峰時間。對于地西泮、氯丙嗪、異丙嗪、甲哌異丙嗪、丙咪嗪，使用甲醇出峰時間均在8～10 min，此時有機相的比例最高(90%)，共流出雜質(zhì)增多，基質(zhì)效應增強，導致出峰面積下降；此外，對于巴比妥類物質(zhì)，使用乙腈作為流動相時峰面積要明顯大于使用甲醇作為流動相的峰面積。使用甲酸銨水溶液作為流動相和乙酸銨水溶液相比，苯二氮卓類和吩噻嗪類在峰面積、峰形方面無明顯差異，但是對于巴比妥類物質(zhì)，使用乙酸銨水溶液要大于使用甲酸銨水溶液出峰峰面積，因此最終選擇使用乙酸銨水溶液-乙腈體系作為流動相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于苯二氮卓類和吩噻嗪類物質(zhì)離子化為[M+H]正模式，而巴比妥類離子化為[M-H]負模式，本儀器可以實現(xiàn)正負切換掃描，理論上可以節(jié)省一半儀器運行時間，但是正負切換掃描可能會帶來掃描信息的丟失，因此本實驗比較了正負切換同時掃描、正模式掃描、負模式掃描3種掃描方式下22種被測物質(zhì)的出峰情況。結(jié)果表明，苯二氮卓類和吩噻嗪類正負切換掃描下靈敏度、峰面積和單正模式掃描下無明顯差異，巴比妥類在正負切換掃描下峰面積出現(xiàn)了一定下降，但是下降幅度在10%之內(nèi)，在正負切換掃描模式下，22種被測物靈敏度、線性范圍、穩(wěn)定性表現(xiàn)良好。綜合考慮，本方法最終確定使用正負切換掃描，以提取的母離子精確質(zhì)量數(shù)定性和定量，以提取的子離子精確質(zhì)量數(shù)作為輔助定性，22種被測物的儀器實際提取質(zhì)量數(shù)與理論質(zhì)量數(shù)誤差均在5 ppm之內(nèi)，極大的減少了傳統(tǒng)四極桿質(zhì)譜假陽性或者假陰性的出現(xiàn)。22種被測物的分子式，理論質(zhì)量數(shù)，典型子離子見表1。

表1 22種被測物分子式、特征離子(n=5)

2.4 方法學驗證

2.4.1 檢出限、定量限、線性方程和線性范圍按照“1.5”制作干血斑樣品標準曲線，以外標峰面積和內(nèi)標峰面積比值作為縱坐標y(其中苯二氮卓類以地西泮D5為內(nèi)標、吩噻嗪類以氯丙嗪D6為內(nèi)標、巴比妥類以苯巴比妥D5為內(nèi)標)，以被測物濃度作為橫坐標x，進行線性擬合，得到線性方程。以3倍信噪比和10倍信噪比確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果如表2所示。苯二氮卓類、吩噻嗪類在5 ng/mL～800 ng/mL范圍內(nèi)線性表現(xiàn)良好(r2>0.99)，巴比妥類在20 ng/mL～800 ng/mL范圍內(nèi)線性表現(xiàn)良好(r2>0.99)，滿足了日常司法檢測的需要。

2.4.2 回收率和精密度取空白血樣，添加低、中、高三水平的被測物(苯二氮卓類、吩噻嗪類添加濃度為低水平10 ng/mL、中水平400 ng/mL、高水平600 ng/mL，巴比妥類添加濃度為低水平40 ng/mL、中水平400 ng/mL、高水平600 ng/mL)，按照1.2、1.3、1.4進行前處理，每個水平重復測定5次，計算平均回收率和相對標準偏差(RSD)見下表2。結(jié)果表明，22種被測物回收率在80.2%～113.5%范圍內(nèi)，RSD在0.9%～14.3%范圍內(nèi)，滿足方法學要求。

表2 22種被測物線性方程、檢出限、定量限、回收率和相對標準偏差(n=5)

2.4.3 樣品穩(wěn)定性取空白血樣，添加低、中、高3水平(苯二氮卓類、吩噻嗪類添加濃度為10 ng/mL、400 ng/mL、600 ng/mL，巴比妥類添加濃度為40 ng/mL、400 ng/mL、600 ng/mL)的被測物，按照“1.2”、“1.3”制備干血斑樣品，分成3組，分儲于4 ℃、-20 ℃、-40 ℃條件下，在1、2、3、5、7、10、15、20、30天后進行測定，每組每個水平平行測定5次。結(jié)果表明，在-20 ℃以及-40 ℃保存條件下，被測物質(zhì)30天內(nèi)穩(wěn)定性良好，測定結(jié)果RSD值在15%之內(nèi)。4 ℃下，被測物7內(nèi)穩(wěn)定性良好，但是7天后穩(wěn)定性變差，地西泮、地西泮、勞拉西泮、替馬西泮、硝西泮、異丙嗪、苯巴比妥測定結(jié)果RSD值高于20%。

2.5 實際樣品測定

收集了3份非正常死亡人員陽性血樣，應用本方法和《SF/Z JD0107005-2016血液、尿液中238種毒(藥)物的檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》對樣品進行對比檢測，結(jié)果見表3。本方法和應用司法技術(shù)規(guī)范檢測的相對偏差在10%之內(nèi)，可作為司法技術(shù)規(guī)范的補充檢測方法或者確證方法。

表3 本方法和司法技術(shù)規(guī)范方法的結(jié)果對比

3 結(jié)論

本研究應用高分辨質(zhì)譜技術(shù)對干血斑樣本中22種鎮(zhèn)定安眠藥成分進行了測定，干血斑樣品經(jīng)過乙腈提取后，應用基質(zhì)分散固相萃取法進行凈化。結(jié)果表明：22種被測物質(zhì)在線性范圍、檢出限、定量限、回收率以及穩(wěn)定性等方面符合方法學要求，該方法樣本存儲方便，保存時間長，前處理操作簡單，為臨床藥物研究和法醫(yī)毒物分析提供了新的技術(shù)支持。本研究僅選擇了兩種基質(zhì)分散固相萃取劑，沒有開展對于不同指標類型血，以及不同干血斑產(chǎn)品的適用性方面優(yōu)選工作，今后研究中，可以從這些方面進行更多的嘗試。干血斑-質(zhì)譜法在精準醫(yī)學檢測、藥物研究、疾病診斷等方面具有良好的應用前景。