陳皮精準(zhǔn)煮散飲片與市售飲片的質(zhì)量

莫結(jié)麗 張 靖 宮 璐 丘小惠 肖水明 李西文 徐 江 黃志海

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣東分院，廣州，510006； 2 廣東省藥檢所，廣州，510120； 3 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

陳皮精準(zhǔn)煮散飲片與市售飲片的質(zhì)量

莫結(jié)麗2張 靖1宮 璐1丘小惠1肖水明3李西文3徐 江3黃志海1

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣東分院，廣州，510006； 2 廣東省藥檢所，廣州，510120； 3 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

目的：臨床療效與中藥飲片規(guī)格及質(zhì)量是否均一密切相關(guān)，本文采用化學(xué)指紋圖譜法結(jié)合DNA分子鑒定技術(shù)，考察陳皮精準(zhǔn)煮散飲片與市售原飲片質(zhì)量差異。方法：比較原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片的干膏收率；采用HPLC-DAD法進(jìn)行3批次飲片混合粉碎前后質(zhì)量均一性、指紋圖譜與相似度評(píng)價(jià)。應(yīng)用ITS2序列作為DNA條形碼對(duì)陳皮飲片進(jìn)行鑒定；比較市售原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片的干膏收率；采用HPLC-DAD法進(jìn)行3批次飲片混合粉碎前后質(zhì)量均一性、指紋圖譜與相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：陳皮煮散飲片出膏率略高于市售飲片出膏率；精準(zhǔn)煮散飲片提取液中橙皮苷溶出較原飲片高，市售原飲片批間溶出量有明顯的差異性RSD為18.93%，混合制成煮散飲片后差異較小RSD為6.28%。指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，混合粉碎后指紋圖譜相似度提高，標(biāo)定共有峰16個(gè)，峰面積均有提高。結(jié)論：陳皮精準(zhǔn)煮散飲片與市售飲片基本屬性相一致，并提高中藥的浸出率、成分溶出率及質(zhì)量均一性，表明煮散飲片有較好的臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

陳皮；精準(zhǔn)煮散飲片；DNA條形碼；指紋圖譜

陳皮為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，在現(xiàn)行版《中華人民共和國(guó)藥典》中分為“廣陳皮”和“陳皮”[1]，兩者在外觀形狀上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中廣陳皮主產(chǎn)于廣東，其他陳皮產(chǎn)于福建、浙江、四川、江西等地。陳皮作為我國(guó)的一種傳統(tǒng)中藥，有著悠久的歷史，《本草綱目》記載：“今天下多以廣中者來(lái)勝。”廣東是陳皮主產(chǎn)區(qū)，來(lái)源主要有茶枝柑、行柑、甜柑、蕉柑、八月橘等，產(chǎn)量大，銷全國(guó)并供出口，其中廣陳皮(茶枝柑)是陳皮道地藥材，質(zhì)量最優(yōu)[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，陳皮具有抗炎、抗氧化、抗病原微生物、抗腫瘤、改善心腦血管疾病等藥理作用[3-5]。陳皮中含有多種化學(xué)成分，主要含有黃酮類和揮發(fā)油兩大類活性成分，一般以橙皮苷的含量來(lái)評(píng)價(jià)陳皮的質(zhì)量[6-7]。

由于橘的栽培變種品種繁多，造成陳皮商品來(lái)源復(fù)雜混亂，特別是切制成絲狀飲片后大多有混雜，人為添加多種不能入藥品種的柑皮。長(zhǎng)期以來(lái)，產(chǎn)地與生長(zhǎng)的差異化、貨源的不確定性、不穩(wěn)定性、中藥飲片的外觀形態(tài)差異大等因素，導(dǎo)致陳皮飲片批間、批內(nèi)質(zhì)量不均一，直接影響臨床用藥療效的穩(wěn)定。此外，飲片的商業(yè)等級(jí)盲目追求大規(guī)格為優(yōu)，人為增加飲片加工和調(diào)劑的難度，也制約了中藥飲片工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的自動(dòng)化進(jìn)程。因此，迫切需要一種易于鑒定和檢測(cè)，可經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備、規(guī)模化生產(chǎn)、質(zhì)量均一、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分裝，以提高臨床用藥精準(zhǔn)性的新型飲片。

實(shí)際上，傳統(tǒng)中藥藥用形式并非一成不變。唐宋時(shí)期盛行“藥力盡出”的中藥煮散，將中藥粉碎成一定粒度與水共煎，在粉碎加工過程中破壞了藥材原有形態(tài)，喪失了品質(zhì)鑒別的性狀特征，導(dǎo)致“辨藥之難”，后逐步被中藥飲片所取代[8-9]。中藥DNA條形碼鑒定體系的應(yīng)用與發(fā)展[10-12]，提供準(zhǔn)確的中藥識(shí)別與溯源，可有效解決傳統(tǒng)煮散的“辨藥之難”問題，并與現(xiàn)有中藥飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、中藥指紋圖譜技術(shù)構(gòu)成質(zhì)量控制體系，實(shí)現(xiàn)煮散的精準(zhǔn)化鑒定和檢測(cè)?；趥鹘y(tǒng)中藥煮散，本課題組提出“精準(zhǔn)煮散飲片”的概念與思路方法，將中藥飲片的形狀規(guī)格微小化、均勻化處理，使飲片批量規(guī)模穩(wěn)定化，批內(nèi)質(zhì)量均一化，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、高效的自動(dòng)化分裝、調(diào)劑、煎煮流程，提高臨床湯劑用藥的精準(zhǔn)性。現(xiàn)以陳皮為例，以飲片規(guī)格、含量均勻度、指紋圖譜與相似度評(píng)價(jià)、DNA序列比對(duì)為考查重點(diǎn)，對(duì)陳皮精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量開展系統(tǒng)評(píng)價(jià)，以期揭示精準(zhǔn)煮散飲片應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)，為中藥飲片的質(zhì)量均一化處理，使之實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)和配給的標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化，從而提高中醫(yī)臨床療效的穩(wěn)定性和臨床評(píng)價(jià)的可靠性提供參考實(shí)例。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國(guó)Agilent 1260型高效液相色譜儀(配備四元泵，柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器及DAD檢測(cè)器)，BT 125 D十萬(wàn)分之一分析天平(賽多利斯，德國(guó))、BS 224 S萬(wàn)分之一分析天平(賽多利斯，德國(guó))、HTP-312電子天平、DK-S26電熱水浴鍋、Centrifuge 5430R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，臺(tái)灣榮聰鐵工廠粉碎機(jī)。

1.2 試劑 乙腈、甲酸均為色譜純，購(gòu)自Fisher公司；液相用水為Millipore制備純水。

1.3 分析樣品 橙皮苷(含量≥98%，批號(hào)B20182)，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。陳皮購(gòu)自康美藥業(yè)有限公司，均產(chǎn)至廣東(批號(hào)為160303611、160903391、160809231)，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室黃志海中藥師鑒定均為現(xiàn)行版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)收載品種。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 含量測(cè)定采用高效液相方法測(cè)定，色譜柱為Kinetex C18柱(2.6 μm，100 mm×4.6 mm)。檢測(cè)方法按照中華人民共和國(guó)藥典2015年版一部陳皮項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)定市售飲片及煮散飲片提取液中橙皮苷的含量。

指紋圖譜色譜條件為：色譜柱同上；流動(dòng)相為乙腈(B)—水(A)，梯度洗脫(5%→75%)；流速：1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：25 ℃；洗脫時(shí)間：30 min；進(jìn)樣體積：5 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇配制成含橙皮苷0.50 mg/mL的對(duì)照品溶液，至于冰箱中4 ℃保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 不同規(guī)格陳皮煮散飲片制備 取陳皮市售原飲片(批號(hào)：160303611)用粉碎機(jī)粉碎均勻，過篩，分別得5～10目(2～4 mm)、10～24目(0.8～2 mm)、24～65目(0.25～0.8 mm)等不同規(guī)格的煮散飲片。分別稱取原飲片及不同規(guī)格煮散飲片100 g，分別加8倍水，先浸泡30 min，煮沸30 min，過濾分離出煎煮液，再加6倍水煎煮30 min。合并煎煮液，濃縮成100 mL溶液，即濃縮為1 g/mL的原藥材溶液。

圖1 陳皮原飲片及煮散飲片形態(tài)

2.3.2 質(zhì)量均一性實(shí)驗(yàn)陳皮煮散飲片制備 分別取3個(gè)批次市售飲片各200 g(S1：160303611，S2：160903391，S3：160809231)，充分混合后，用粉碎機(jī)粉碎均勻，過篩取10～65目粒徑范圍的煮散飲片。傳統(tǒng)飲片及煮散飲片形態(tài)見圖1。不同批次原飲片各取20 g；混合后10～65目陳皮煮散飲片取300 g，均勻攤平，畫格分為9份，隨機(jī)選取3份(S4～S6)，從每份中分別稱取20 g。上述6份樣品按上述方法煎煮。合并煎煮液，濃縮成100 mL溶液，即濃縮為0.2 g/mL的原藥材溶液。

取上述制備的0.2 g/mL的原藥材溶液，為供試品溶液，進(jìn)樣前用0.22 μm濾膜過濾。

2.4 DNA條形碼檢測(cè) 選取各批次及混合后煮散飲片樣本各約40 mg，用組織研磨儀磨碎，采用植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.,中國(guó))提取基因組總DNA。ITS2序列擴(kuò)增采用正向引物ITS2F:5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物：ITS3R:5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′，進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Taq PCR Mix酶(北京艾德萊生物科技有限公司)12.5 μL，正向、反向引物各1 μL(2.5 μmol/L)，模板DNA 2.0 μL(30～100 ng)，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(40個(gè)循環(huán))；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將電泳條帶清晰、明亮、單一的PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。所得序列采用CodonCode Alinger 6.02軟件進(jìn)行校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量區(qū)并采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段，獲得完整的ITS2序列。利用軟件MEGA 6.06分析比對(duì)，分析ITS2序列特點(diǎn)[13]。

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

2.5.1 出膏率考察 分別精密量取25 mL原飲片及不同規(guī)格煮散飲片1 g/mL的原藥材溶液于蒸發(fā)皿中，60 ℃真空干燥至恒重，稱量重量，根據(jù)出膏率公式[14]計(jì)算出膏率。與原飲片比較，粉碎后不同粒徑煮散飲片的出膏率略有增加；不同粒徑的出膏率有差異，其中5～10目出膏率較高。見表1。

表1 陳皮市售原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片出膏率(n=3)

2.5.2 飲片提取液中橙皮苷含量 采用高效液相方法測(cè)定，按照中華人民共和國(guó)藥典2015年版一部陳皮項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)定市售飲片及煮散飲片提取液中橙皮苷的含量。對(duì)照品及樣品溶液HPLC-DAD色譜圖分別見圖2、圖3。結(jié)果顯示，對(duì)照品及樣品中橙皮苷的色譜峰分離效果佳，雜峰較少，峰形良好，適合陳皮飲片中橙皮苷含量測(cè)定分析。

圖2 對(duì)照品HPLC-DAD色譜圖(1:橙皮苷)

圖3 陳皮飲片HPLC-DAD色譜圖(1:橙皮苷)

混合煮散前，各批次陳皮飲片藥材中橙皮苷成分的溶出差異較大，波動(dòng)范圍在2.51～3.54 mg/g，RSD18.93%?；旌喜⒅瞥芍笊嬈螅涑绕ぼ杖艹隽柯杂性黾?，且RSD值顯著下降。見表2。

表2 陳皮原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片提取液中橙皮苷含量

2.5.3 飲片指紋圖譜比較 取上述藥材，按指紋圖譜檢測(cè)方法檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm的陳皮飲片提取液主要色譜峰指紋圖譜如圖4所示。采用國(guó)家藥典委員會(huì)2014年版指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件，比較市售原飲片與煮散飲片指紋圖譜相似度。見表3。結(jié)果顯示，精準(zhǔn)煮散飲片與市售飲片的指紋圖譜相似度基本一致，在成分的種類上未有明顯改變，不同批次樣品經(jīng)粉碎、混合后的指紋圖譜相似度更好，相似度可達(dá)0.997以上，采用指紋圖譜相識(shí)度分析方法可以用于陳皮煮散飲片的真?zhèn)舞b別及質(zhì)量?jī)?yōu)劣的判定。以原飲片中橙皮苷的平均峰面積為基準(zhǔn)，計(jì)算制得精準(zhǔn)煮散飲片前后各共有峰的相對(duì)峰面積見表4。不同批次藥材經(jīng)混合制成精準(zhǔn)煮散飲片后，部分共有峰溶出率有不同程度的升高。其中峰11為橙皮苷。

圖4 市售原飲片及混合后精準(zhǔn)煮散飲片HPLC指紋圖譜

樣品S1S2S3S4S5S6對(duì)照指紋圖譜S11.0000.9950.9760.9730.9710.9710.985S20.9951.0000.9850.9790.9790.9770.990S30.9760.9851.0000.9900.9890.9880.994S40.9730.9790.9901.0000.9990.9990.998S50.9710.9790.9890.9991.0001.0000.997S60.9710.9770.9880.9991.0001.0000.997對(duì)照指紋圖譜0.9850.9900.9940.9980.9970.9971.000

表4 共有峰相對(duì)峰面積比較(n=3)

3.5.4 DNA條形碼檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用MEGA6.06分析陳皮3條ITS2序列特征,發(fā)現(xiàn)種內(nèi)無(wú)變異位點(diǎn)，3條陳皮序列長(zhǎng)度均為232 bp，A、C、G、T的堿基含量分別為14.66%、38.36%、33.19%、13.79%，GC含量達(dá)71.55%。3條psbA-trnH序列比對(duì)后長(zhǎng)度為413 bp，無(wú)變異位點(diǎn)。2種序列BLAST搜索結(jié)果均顯示相似性最高的為橘Citrus reticulata，相似度為100%。主導(dǎo)單倍型序列特征見圖5，6。

3 討論

橙皮苷是《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的陳皮飲片測(cè)量指標(biāo)成分，含橙皮苷不得少于2.5%，且能夠被水提取出來(lái)，因而我們以橙皮苷作為測(cè)定飲片溶出的指標(biāo)成分，其余成分以橙皮苷的平均峰面積為基準(zhǔn)，比較煮散飲片制備前后共有峰的相對(duì)峰面積。我們收集了3批次陳皮市售飲片，飲片均勻混合粉碎后制成煮散飲片，采用HPLC-DAD法進(jìn)行飲片混合粉碎前后橙皮苷成分的浸出率質(zhì)量均一性，指紋圖譜分析，以及DNA序列比對(duì)研究。比較陳皮煮散飲片與市售飲片指紋圖譜，其成分的種類上未有明顯改變，但各共有峰的溶出有不同程度的升高，混合粉碎后的精準(zhǔn)煮散飲片指紋圖譜相似度更好。

陳皮的ITS2和psbA-trnH條形碼在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行BLAST搜索時(shí)，尚能比對(duì)到除橘及其變種外的同屬物種，包括甜橙Citrussinensis、酸橙Citrusaurantium等。由于該屬植物自身特點(diǎn)，如易發(fā)生芽變、種屬間易雜交、體細(xì)胞突變率高、人工栽培品種繁多，以及研究者采用的分類標(biāo)準(zhǔn)的不同等，導(dǎo)致該屬在種的劃分上一直存在較大分歧[15]。羅焜等[16]對(duì)包括橘屬7個(gè)品種在內(nèi)的蕓香科72屬300個(gè)樣本進(jìn)行DNA條形碼篩選比較研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，ITS2和psbA-trnH序列在屬水平上的鑒定成功率為100%，但目前暫未發(fā)現(xiàn)可用于柑橘屬種間鑒定的DNA條形碼序列[17-19]。因此，對(duì)于陳皮的物種鑒定，在DNA條形碼鑒定到屬的基礎(chǔ)上，應(yīng)輔以其他手段如指紋圖譜技術(shù)進(jìn)一步明確種屬。

圖5 陳皮ITS2序列

圖6 陳皮psbA-trnH序列

精準(zhǔn)煮散飲片基于傳統(tǒng)中藥煮散用藥方式，僅是改變了中藥飲片的形狀規(guī)格，使其微小化、均勻化，可實(shí)現(xiàn)飲片質(zhì)量均一化，飲片分裝、調(diào)劑、煎煮自動(dòng)化，使中藥劑量和湯劑質(zhì)量更加精準(zhǔn)。發(fā)展精準(zhǔn)煮散飲片不僅能提高中醫(yī)臨床用藥質(zhì)量的穩(wěn)定性，也能提高中藥資源的合理利用，在藥量更少的情況下煮散仍可達(dá)到常規(guī)飲片同樣的臨床治療效果。此外，它采用中藥DNA條形碼鑒定體系，與現(xiàn)有中藥飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、中藥指紋圖譜技術(shù)結(jié)合，解決了中藥飲片因切制及粉碎處理導(dǎo)致某些性狀特征喪失產(chǎn)生的“辨藥之難”問題，實(shí)現(xiàn)了煮散飲片的精準(zhǔn)化鑒定和檢測(cè)。基于多種現(xiàn)代技術(shù)體系為支撐的現(xiàn)代新型飲片，精準(zhǔn)煮散飲片體系將成為現(xiàn)階段常規(guī)飲片向“精準(zhǔn)化”轉(zhuǎn)型升級(jí)的適宜模式。

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ComparativeStudyonQualityofPrecisePowderDecoctionPiecesofCitriRetilulataePericarpiumwithitsCrudeSlices

Mo Jieli2,Zhang Jin1,Gong Lu1,Qiu Xiaohui1,Xiao Shuiming3，Li Xiwen3，Xu Jiang3，Huang Zhihai1

(1SecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,GuangdongProvincialAcademyofChineseMedicalSciences,ChinaAcademyofChineseMedicalSciencesGuangdongBranch,Guangzhou510006,China;2GuangdongInstituteforDrugControl,Guangzhou,510120,China; 3InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

Objective:To evaluate the quality difference of precise powder decoction pieces (PPDP) of Citri Retilulatae Pericarpium (CRP) and traditional commercial crude slices.MethodsDifferent specifications of PPDP were prepared,their dry extract contents were compared with those of commercial slices.Three batches of commercial slices were collected,and the content uniformity,fingerprint and similarity were evaluated before and after mixing and preparation by HPLC-DAD and DNA sequence alignment.ResultsPaste rate of PPDP was slightly higher than that of the traditional commercial slices,among which paste rate of 5-10 mesh were the highest.The dissolution rate of hesperidin of PPDP was higher than that of traditional commercial slices.RSDof inter-assay dissolution of commercial slices was 18.93%,which could be reduced to 6.28 % after being mixed and prepared into PPDP.ConclusionPPDP and traditional commercial slices of CRP shared consistent properties,while PPDP could apparently improve the extraction rate,the dissolution rate and the quality uniformity,which demonstrates boiled powder of CRP is more suitable in clinical practice.

Citri Retilulatae Pericarpium; Precise powder decoction pieces; DNA; Fingerprint

廣東省藥品檢驗(yàn)所專項(xiàng)(2016KT1014)；廣東省中醫(yī)院專項(xiàng)(2015KT1817)；國(guó)家自然基金項(xiàng)目(81402887)；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥健康服務(wù)專項(xiàng)(ZZ0908067)

莫結(jié)麗(1974.12—)，女，碩士研究生，主任藥師，副主任，研究方向：中藥質(zhì)量控制，E-mail：13925104132@139.com

徐江(1984.04—)，男，博士研究生，助理研究員，研究方向：藥用植物基因組學(xué)研究，E-mail：jxu@icmm.ac.cn；黃志海(1974.08—)，男，碩士研究生，主任藥師，團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人，研究方向：中藥資源與中藥炮制，Tel:(020)39318571，E-mail：1925196926@qq.com

R917

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.056

(2017-01-05收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄)